Un metodo di co-cultura per studiare l'escrescenza neurite in risposta ai segnali paracrini dentali

Sommario

Descriviamo l'isolamento, la dispersione e la placcatura delle cellule primarie della polpa dentale (DP) con neuroni trigeminali (TG) coltivati in cima ai filtri transwell sovrastanti. Le risposte cellulari delle cellule DP possono essere analizzate con l'immunofluorescenza o l'analisi RNA/proteina. L'immunofluorescenza dei marcatori neuronali con microscopia confocale consente l'analisi delle risposte di escrescenza neurite.

Abstract

L'innervazione dentale consente ai denti di rilevare pressione, temperatura e infiammazione, che sono tutti cruciali per l'uso e il mantenimento dell'organo dentale. Senza l'innervazione sensoriale, le attività orali quotidiane causerebbero danni irreparabili. Nonostante la sua importanza, i ruoli di innervazione nello sviluppo e nella manutenzione dei denti sono stati in gran parte trascurati. Diversi studi hanno dimostrato che le cellule DP secernono proteine della matrice extracellulare e segnali paracrini per attirare e guidare gli assoni TG dentro e in tutto il dente. Tuttavia, pochi studi hanno fornito informazioni dettagliate sul crosstalk tra il DP mesenchyme e afferenti neuronali. Per colmare questa lacuna nella conoscenza, i ricercatori hanno iniziato a utilizzare le co-culture e una varietà di tecniche per studiare queste interazioni. Qui, dimostriamo i molteplici passaggi coinvolti nella co-cultura delle cellule DP primarie con neuroni TG dispersi su un filtro transwell sovrastante con pori di grande diametro per consentire la crescita assonale attraverso i pori. Le cellule DP primarie con il gene di interesse affiancato da siti loxP sono state utilizzate per facilitare la delezione genica utilizzando un sistema ricombinase Adenovirus-Cre-GFP. L'utilizzo di neuroni TG del topo Thy1-YFP ha permesso una precisa imaging afferente, con espressione ben al di sopra dei livelli di fondo mediante microscopia confocale. Le risposte del DP possono essere studiate attraverso la raccolta e l'analisi di proteine o RNA, o in alternativa, attraverso la colorazione immunofluorescente delle cellule DP placcate su coperture in vetro rimovibile. I media possono essere analizzati utilizzando tecniche come le analisi proteomiche, anche se ciò richiederà l'esaurimento dell'album a causa della presenza di siero bovino fetale nei media. Questo protocollo fornisce un metodo semplice che può essere manipolato per studiare le risposte morfologiche, genetiche e citoscheletriche dei neuroni TG e delle cellule DP in risposta all'ambiente controllato di un saggio di co-cultura.

Introduzione

L'innervazione dentale consente ai denti di rilevare pressione, temperatura e infiammazione, che sono tutti cruciali per l'uso e il mantenimento dell'organo dentale. Il mancato rilevamento del dolore dentale associato alla carie dentale e al trauma porta alla progressione della malattia. Pertanto, una corretta innervazione è un requisito per la normale crescita, funzione e cura dei denti.

Mentre la maggior parte degli organi sono completamente funzionali e innervati dal momento della nascita, lo sviluppo dei denti si estende nella vita adulta, con l'innervazione dei denti e la mineralizzazione che si verificano in concerto durante le fasi p....

Protocollo

Tutti gli esperimenti con i topi sono stati approvati dall'UAB Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Preparazione piastra

NOTA: i coverlips possono essere utilizzati per l'immagine di celle DP alla fine del saggio. Assicurarsi che il coperchio della piastra sia acceso durante tutte le fasi di incubazione e risciacquo al di fuori del cofano di coltura dei tessuti sterili per evitare la contaminazione durante la lavorazione del campione.

1. Preparazione coverslip
   1. Autoclave correle.
   2. Filtrare l'acqua ultrapura sotto il cofano.
   3. Trasferire i cop....

Risultati

Questi risultati mostrano che l'escrescenza di TG neurite è stata aumentata in presenza di cellule primarie DP nel pozzo sottostante rispetto al controllo della monocoltura neurite TG (Figura 2A,C). C'è una certa variabilità saggio-saggio-saggio nella escrescenza neurite. Pertanto, una monocoltura neuronale TG dovrebbe essere inclusa in tutti i saggi come un controllo per rilevare i livelli basali di escrescenza neurite. Le cellule primarie del mouse Tgfbr2^f/f son.......

Discussione

Le attività quotidiane della cavità orale richiedono che i denti percepiscano stimoli esterni e infiammazione interna al fine di consentire un corretto utilizzo e manutenzione. Tuttavia, sono disponibili solo informazioni limitate per quanto riguarda i segnali che guidano i processi di sviluppo dell'innervazione dei denti. Questo protocollo fornisce un metodo per isolare e co-cultura cellule primarie DP e neuroni TG al fine di studiare la comunicazione incrociata tra le due popolazioni. Diverse variabili sono state ottim.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
5-Fluoro-2'-deossiuridina	Sigma-Aldrich	F0503	Usato come inibitore mitotico a 15 μ Concentrazione M in terreni di co-coltura, giorno 2
Piastra per coltura cellulare a 24 pozzetti	Corning	3524	Piastra di co-coltura
Alexa-546 anti-pollo	Invitrogen	A-11040	Secondario alla crescita di neuriti marcati con anticorpi anti-GFP, diluizione 1:500 Anticorpo
anti-GFP	Aves Lab, Inc	GFP-1010	Anticorpo primario per marcare i neuroni Thy1-YFP, diluizione 1:200
Anti-Neurofilamento 200 anticorpi	Sigma-Aldrich	NO142	Anticorpo primario monoclonale per marcare i neuroni, diluizione 1:1000, alternativa se i topi YFP non sono disponibili
B6; 129- Tgfbr2tm1Karl/J	The Jackson Laboratory	12603	Tgfbr2f/f modello murino utilizzato per cellule pulpare dentali nel protocollo
ottimizzato B6. Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/J	The Jackson Laboratory	3709	Thy1-YFP genotipo del modello murino utilizzato per i neuroni trigeminali
Collagenasi di tipo II	Millipore	234155-100MG	Utilizzato per disperdere i neuroni del trigemino
Fetale Siero bovino fetale	Gibco	10437	Additivo per terreni di co-coltura
Pinze fini	Strumenti di scienza fine	11413-11	Pinze fini per la dissezione TG
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020	Riveste gli inserti del transwell alla concentrazione finale di 10 μ g/ml, la soluzione madre è assunta a 1,5 mg/ml
Tampone di lisi (tampone RLT)	Qiagen	79216	Estrae l'RNA dalle cellule della polpa dentale dopo la co-coltura
L-Glutammina	Gibco	25030081	Additivo ai terreni di co-coltura
Forbici per micro-dissezione	Sigma-Aldrich	S3146-1EA	Forbici da dissezione per aprire il cranio
Coperchio del microscopio Vetro	Fisherbrand	12-545-81	Vetrino coprioggetto circolare per la coltura cellulare opzionale e l'elaborazione dell'immunofluorescenza
Terreno essenziale minimo a	Gibco	12571063	Base del terreno di co-coltura
Penicillina-Streptomicina	Gibco	15070063	Additivo antibiotico per terreni di co-coltura
Inibitore della fosfatasi	Sigma-Aldrich	04 906 837 001	Additivo per RIPA Tampone per l'estrazione di proteine dalle cellule della polpa dentale co-coltura
Polybrene	Millipore	TR-1003-G	Utilizzato per aiutare nella trasfezione delle cellule della polpa dentale
Poly-D-Lysine	Sigma-Aldrich	P7280	Rivestimento del vetrino coprioggetto per favorire l'adesione cellulare della polpa dentale
Inibitori della proteasi	Millipore	05 892 791 001	Additivo al tampone RIPA per l'estrazione di proteine dalle cellule della polpa dentale dopo la co-coltura
Provette Eppendorf prive di RNAsi/DNAsi	Denville	C-2172	Provette presterilizzate da 1,7 ml per la raccolta di RNA, DNA o proteine alla fine del test
Inserto per colture cellulari ThinCert Greiner	Bio-One	662631	Inserti Transwell per neuroni trigeminali in saggi di co-coltura
Tripsina-EDTA (0,25%)	Gibco	25200056	Utilizzato per disperdere le cellule della polpa dentale
Tripsina di tipo II	Sigma-Aldrich	T-7409	Utilizzato per disperdere neuroni trigeminali
Pinze ultra fini	Strumenti di scienza fine	11370-40	Pinze ultra fini per dissezione
Uridina	Sigma-Aldrich	U3750	Usato come inibitore mitotico a 1 μ Concentrazione di M in terreni di co-coltura,
Giorno 2 Sistema di filtrazione sottovuoto	Millipore	SCNY00060	Filtro monouso Steriflip, 50 μ m filtro a rete in nylon
Pinze per fiale	Strumenti di scienza fine	110006-15	Pinze lunghe per il trasferimento di tessuti a coniche