Articolo metodologico

Effetto delle formulazioni lacrimali artificiali sull'attività metabolica delle cellule epiteliali corneali umane dopo l'esposizione all'essiccazione

DOI:

10.3791/60812

⸱

2 maggio 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Alcon Vision, LLC, 2Centre for Ocular Research and Education (CORE), School of Optometry & Vision Science, University of Waterloo

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lo scopo di questo protocollo è valutare se diverse formulazioni di lacrimazione artificiale possono proteggere le cellule epiteliali corneali umane dall'essiccazione utilizzando un modello in vitro. Dopo l'esposizione a formulazioni lacrimali artificiali e all'essiccazione, le cellule epiteliali corneali umane vengono valutate per l'attività metabolica.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le formulazioni lacrimali artificiali contenenti lipidi sono sviluppate per ridurre l'evaporazione lacrimale mediante il ripristino di uno strato lipidico lacrimale carente. Formulazioni lacrimali artificiali che prevengono l'essiccazione cellulare si tradurranno in una protezione oculare della superficie e nel mantenimento dell'attività metabolica cellulare. Durante la disidratazione, le cellule subiscono il processo di perdita dell'attività metabolica e successivamente di morte cellulare. Questo lavoro descrive un metodo per valutare l'efficacia delle formulazioni di lacrima artificiale. Il colorante metabolico (cioè alamarBlue) passa da una bassa molecola fluorescente che rivende a una molecola fluorescente che rivendifine in cellule vitali. Le prestazioni biologiche di una formulazione lacrimale artificiale sono misurate come capacità della formulazione di (a) mantenere la vitalità cellulare e (b) fornire protezione cellulare dall'essiccazione. I mezzi di crescita e la salina vengono utilizzati come controlli per i test di vitalità/essiccazione cellulare. Le cellule vengono incubate con soluzioni di prova per 30 minuti e quindi essiccate per 0 o 5 min a 37 °C e al 45% di umidità relativa. L'attività metabolica cellulare dopo l'esposizione iniziale e dopo l'essiccazione cellulare viene quindi determinata. I risultati mostrano gli effetti comparativi delle formulazioni di colliri sull'attività metabolica cellulare e sulla protezione dall'essiccazione. Questo metodo può essere utilizzato per testare formulazioni dell'occhio secco progettate per trattare individui con occhio secco evaporativo.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sono necessari molti ingredienti diversi in soluzioni oftalmiche a dosi multiple per mantenere stabilità, pH, osmolarità ed efficacia. Tuttavia, alcune sostanze chimiche come conservanti o tensioattivi in soluzioni oculari possono causare danni all'epitelio corneale1,2. I test di vitalità cellulare che utilizzano cellule epiteliali corneali umane (HCEC) possono essere eseguiti per valutare i potenziali danni causati da questi vari ingredienti nelle formulazioni oftalmiche. Uno dei saggi in vitro particolarmente utili per valutare il danno cellulare è il saggio alamarBlue3. In questo saggio, il colorante metabolico (cioè alamarBlue) contiene resazurina, che funziona come indicatore di vitalità cellulare. Durante la respirazione cellulare, la resazurina viene ridotta a risorufina accettando elettroni4. La riduzione della risorufina provoca un cambiamento da una molecola non fluorescente a una molecola fluorescente che può essere rilevata utilizzando uno spettrofluorometro5.

Questa indagine utilizza due diversi trattamenti delle cellule epiteliali corneali per determinare come possono funzionare i prodotti per gli occhi secchi in un modello in vitro. Nella prima valutazione, le cellule vengono trattate con questi prodotti per 30 minuti. Dopo il trattamento, le cellule vengono quindi valutate per l'attività metabolica immediatamente dopo l'esposizione ai prodotti per l'occhio secco e dopo un intervallo di tempo di recupero. Questa valutazione determina l'effetto di questi prodotti sulle cellule prima dell'essiccazione in una camera di umidità. Conservanti della soluzione, tensioattivi o tamponi in queste soluzioni possono avere alcuni effetti citotossici sulle cellule che possono essere rilevati utilizzando il colorante metabolico.

La seconda valutazione determina l'attività metabolica delle cellule dopo l'esposizione ai prodotti per l'occhio secco e l'essiccazione. In questa valutazione, se il trattamento del prodotto offre protezione alle cellule dai danni da essiccazione, l'attività metabolica delle cellule verrà mantenuta. La protezione cellulare dagli effetti dannosi dell'essiccazione può verificarsi se il prodotto per gli occhi secchi può rivestire le cellule con lipidi o il prodotto può assorbire liquido dall'ambiente circostante aggiungendo umidità alle cellule.

Questo protocollo è progettato per simulare gravi condizioni di stress ambientale sulle cellule. Altri studi hanno utilizzato vari modelli per creare questo stress esterno. Alcuni studi hanno asciugato le cellule nelle cappe a flusso laminare6,7,8 ,mentrealtri hanno utilizzato la temperatura ambiente e vari valori di umidità relativa (RH)9,10,11. Un metodo per simulare le condizioni dell'occhio secco è aumentare l'osmolarità dellasoluzione incubatrice 12,13. Un altro metodo in vitro per simulare condizioni ambientali avverse è quello di aggiungere citochine al supporto cellulare per simulare il fluido lacrimale dei pazienti con occhio secco14. Sebbene questi test siano modelli interessanti in grado di valutare come le sostanze chimiche riducono lo stress osmotico o stimolano il sistema immunitario, questi modelli non mostrano direttamente come le formulazioni chimiche possano proteggere le cellule dallo stress da essiccazione.

Il modello di essiccazione utilizza una camera di temperatura/umidità 37 °C e 45% RH. Simula condizioni ambientali che possono causare evaporazione dalla superficie oculare. Simulazioni di altre condizioni ambientali estreme come la bassa umidità presente nelle cabine degli aerei15 o in ambienti interni durante imesi invernali 16 possono anche essere eseguite utilizzando questo metodo.

La modellazione della coltura cellulare viene utilizzata per simulare l'effetto dello stress da essiccazione sulla cornea umana. Al fine di rilevare lo stress cellulare, vengono effettuati test di vitalità cellulare per determinare l'impatto sulla salute delle cellule. Diverse prove fisiologiche possono essere eseguite sulle cellule per determinare se sono stressate17. L'analisi eseguita in questa procedura di prova utilizza il colorante metabolico disponibile in commercio(Tabella dei materiali). Ha il vantaggio rispetto a molti altri stress test cellulari in quanto non è tossico, solubile nei mezzi di crescita e può valutare le cellule senza fissazione cellulare18. In questa procedura le cellule vengono testate per l'attività metabolica immediatamente dopo ogni trattamento e una seconda serie di cellule viene riposta in mezzi di crescita e valutata dopo un recupero di 18 ore. Il motivo del test immediatamente e poi dopo un periodo di recupero è identificare i danni cellulari che causano effetti immediati sull'attività metabolica e sui danni cellulari che causano effetti ritardati. Inoltre, offre l'opportunità di valutare l'impatto di queste formulazioni sui danni a breve e lungo termine e la capacità delle formulazioni di riprendersi / non riprendersi dall'insulto iniziale.

Questa indagine viene utilizzata per confrontare vari prodotti per l'occhio secco contenenti lipidi per il loro effetto sull'attività metabolica dell'HCEC con e senza essiccazione. Gli ingredienti nei prodotti per occhio secco testati sono descritti in Table of Materials. Gli ingredienti in soluzione #1 sono carbossimetilcellulosa sodio (0,5%), glicerina (1%) e polisorbato 80 (0,5%), in soluzione #2 sono olio minerale leggero (1,0%) e olio minerale (4,5%), e in soluzione #3 lipide è olio minerale e il glicole propilenico è il demulcente. Questi lipidi sono i componenti di formulazione che dovrebbero fornire protezione dell'HCEC dall'essiccazione.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Coltura cellulare epiteliale corneale umana

  1. Coltivare HCEC19 immortalato in contenitori da 75 cm2 rivestiti di collagene con 20 mL della miscela media/nutriente Eagle modificata di Dulbecco F-12 (DMEM/F12) contenente il 10% di siero bovino fetale (FBS) e l'1% di penicillina/streptomicina a 37 °C con il 5% di CO2.
    NOTA: non è necessario scuotere.
  2. Cambia i media ogni 2−3 giorni.

2. Preparazione delle cellule per la prova

  1. Dopo che le celle sono quasi confluenti, rimuovere i supporti di coltura.
  2. Aggiungere 4−6 mL di soluzione di dissociazione cellulare a ogni flaconi da 75 cm2. Incubare le cellule a 37 °C fino a quando le cellule si staccano (circa 20−30 min), controllando periodicamente al microscopio.
  3. Aggiungere 2−6 mL di DMEM/F12 contenente il 10% di FBS a ogni pallone da 75 cm2.
  4. Trasferire il contenuto del pallone in un tubo di centrifuga da 50 ml.
  5. Centrifugare le cellule a 450−500 x g per 5 min. Pipettare il supernatante e rimescolare le cellule in mezzi pre-riscaldati.
  6. Contare le cellule usando un emocitometro. Calcolare il volume di supporti che contiene un totale di 1 x 105 celle.
  7. Aggiungere 1 x 105 cellule a ciascun pozzo di una piastra di coltura rivestita con collagene-1 a 48 po '. Aggiungi abbastanza media al pozzo in modo che il volume finale dei media nel pozzo sia di 0,5 mL di cultura DMEM / F12 con FBS al 10%.
    NOTA: Una formulazione lacrimale artificiale può causare citotossicità che può essere misurata da una diminuzione dell'attività metabolica dell'HCEC. La coerenza dei dati dipende dall'aggiunta dello stesso numero di HCEC a ciascun pozzo durante il seeding. La concentrazione di coltura consigliata per 48 piastre di pozzo è 1 x 105. Poiché le cellule di mammifero possono depositarsi nel tubo di centrifuga dopo la sospensione, si consiglia di risosopendare frequentemente le cellule agitazione mentre seminano le piastre con le cellule in modo che la sospensione cellulare abbia l'HCEC equamente distribuito.
  8. Incubare le cellule a 37 °C e 5% CO2 per 24 ore.

3. Nessun protocollo di essiccazione

  1. Procedura di controllo
    1. Dopo l'incubazione di 24 ore rimuovere il supporto di coltura dalla piastra.
    2. Trattare immediatamente con 150 μL di una formulazione di prova e di una soluzione di controllo dei supporti.
    3. Incubare le cellule a 37 °C e 5% CO2 per 30 min.
    4. Rimuovere le soluzioni di test dalle celle.
    5. Aggiungere 0,5 mL di soluzione di colorante metabolico al 10% per testare l'attività metabolica. Incubare le cellule per altre 4 ore a 37 °C e 5% CO2.
    6. Dopo il periodo di incubazione di 4 ore, rimuovere 100 μL di soluzione metabolica di colorante da ogni pozzo e posizionare ogni 100 μL in un pozzo di una piastra di 96 po porsi.
    7. Misurare la fluorescenza di ogni pozzo utilizzando un lettore di lastre fluorescenti(Tabella dei materiali). Impostare la lunghezza d'onda di eccitazione a 540 nm e la lunghezza d'onda di emissione a 590 nm.
  2. Nessun protocollo di essiccazione (procedura di ripristino)
    1. Ripetere i passaggi 3.1.1−3.1.4.
    2. Aggiungere 0,5 mL di supporti DMEM/F12 a ciascun pozzo.
    3. Incubare un insieme di colture per 18 ore a 37 °C e 5% CO2.
    4. Rimuovere il supporto e aggiungere 0,5 mL di soluzione di colorante metabolico al 10%. Ripetere i passaggi 3.1.6 e 3.1.7.

4. Protocollo di essiccazione

  1. Procedura di controllo
    1. Dopo l'incubazione di 24 ore (fase 2.8), rimuovere il supporto di coltura dalla piastra.
    2. Trattare immediatamente con 150 μL di una formulazione di prova e di una soluzione di controllo dei supporti.
    3. Incubare le cellule a 37 °C e 5% CO2 per 30 min.
    4. Rimuovere le soluzioni di test dalle celle.
    5. Posizionare le cellule in una camera 37 °C e 45% RH per 5 minuti per essiccare le cellule.
    6. Aggiungere 0,5 mL di soluzione di colorante metabolico al 10% per testare l'attività metabolica. Incubare le cellule per altre 4 ore a 37 °C e 5% CO2.
    7. Dopo il periodo di incubazione di 4 ore, rimuovere 100 μL di soluzione metabolica di colorante da ogni pozzo e posizionare ogni 100 μL in un pozzo di una piastra di 96 po porsi.
    8. Misurare la fluorescenza di ogni pozzo utilizzando un lettore di piastre fluorescenti. Impostare la lunghezza d'onda di eccitazione a 540 nm e la lunghezza d'onda di emissione a 590 nm.
  2. Procedura di recupero
    1. Ripetere i passaggi 4.1.1-4.1.5.
    2. Aggiungere 0,5 mL di supporti DMEM/F12 a ciascun pozzo.
    3. Incubare un insieme di colture per 18 ore a 37 °C e 5% CO2.
    4. Rimuovere il supporto e aggiungere 0,5 mL di soluzione di colorante metabolico al 10%. Ripetere i passaggi 4.1.7 e 4.1.8.

5. Analisi dei dati

  1. Calcolare la fluorescenza media del controllo multimediale. Calcolare la percentuale di vitalità del campione utilizzando la formula seguente:
    Percentuale di vitalità del campione = fluorescenza del campione di prova/fluorescenza di controllo del supporto x 100
    NOTA: La media di controllo dei supporti è al 100% di vitalità. Il colorante metabolico da solo ha una piccola quantità di fluorescenza associata ad esso. La fluorescenza del reagente metabolico del colorante può essere sottratta dalla fluorescenza del campione di controllo e di prova prima di calcolare la vitalità % dei campioni di prova al controllo del supporto.
  2. Eseguire un test di normalità e un test per le varianze uguali sui campioni di controllo e test.
  3. Se il test di normalità supera e le varianze sono uguali, eseguire un ANOVA uni-way. Per identificare differenze significative tra gruppi specifici eseguire un test post hoc di confronti a coppie (ad esempio, i test di confronto multipli di Tukey o Dunnett).
  4. Se il test di normalità supera e le varianze sono diverse, eseguire l'ANOVA di Welch. Per identificare differenze significative tra gruppi specifici eseguire un test post hoc di confronti a coppie (ad esempio, test di confronto multipli di Dunnett o Games-Howell).
  5. Se il test di normalità non riesce, utilizzare un test non parametrico (cioè il test di Kruskal-Wallis). Per identificare differenze significative tra gruppi specifici eseguire un test post hoc di confronti a coppie (ad esempio, il test di Dunn).

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I risultati di uno studio che confronta tre formulazioni dell'occhio secco sono riportati nella figura 1. Questa figura mostra che vi sono differenze nell'effetto che i tre prodotti, la soluzione #1, la soluzione #2 e la soluzione #3(Tabella dei materiali)hanno sulla vitalità dell'HCEC. La #1 e la #2 hanno avuto un effetto significativo sull'attività metabolica dell'HCEC prima dell'essiccazione. Ciò significa che ci sono componenti di formulazione in questi prodotti che possono interrompere l'attività metabolica dell'HCEC. L'ulteriore calo dell'attività metabolica cellulare verificatosi dopo il recupero di 18 ore delle cellule esposte alla soluzione #1 mostra che l'HCEC è stato ferito inizialmente e dopo 18 ore la lesione non è stata riparata. In confronto, la #3 ha avuto solo un lieve effetto sull'attività metabolica dell'HCEC.

La figura 2 mostra l'effetto di queste formulazioni di occhi secchi contenenti lipidi sulla protezione cellulare. Con un'attività metabolica HCEC vicina allo 0% all'intervallo di recupero di 18 ore, la soluzione #1 e la soluzione #2 non proteggevano le cellule dallo stress da essiccazione. La #3, tuttavia, offriva una certa protezione contro lo stress da essiccazione.

figure-results-1
Figura 1: Effetto dei prodotti potenziati dai lipidi dell'occhio secco sulla vitalità cellulare. Vitalità relativa misurata dall'attività metabolica HCEC dopo il trattamento con prodotti per l'occhio secco contenenti lipidi. * = significatività statistica (p < 0,05) rispetto alla soluzione #3, Δ = significatività statistica (p < 0,05) relativa al controllo dei supporti per il periodo di recupero appropriato. L'altezza della barra rappresenta il valore medio e le barre di errore sono l'SD. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-2
Figura 2: Effetto dei prodotti potenziati dai lipidi dell'occhio secco sulla protezione dall'essiccazione. Effetto delle formulazioni dell'occhio secco contenenti lipidi sulla protezione cellulare. La #1 e la #2 non proteggevano le cellule dallo stress da essiccazione e non si riprendevano dagli effetti di essiccazione nel tempo. Al contrario, la soluzione #3 offerto una certa protezione contro lo stress da essiccazione. * = p < 0,05 rispetto alla soluzione #3, e Δ = p < 0,05 rispetto ai supporti non trattati (controllo) per il tempo di recupero appropriato. L'altezza della barra rappresenta il valore medio e le barre di errore sono l'SD. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo è progettato per determinare gli effetti protettivi delle soluzioni di strappo artificiale contro l'essiccazione cellulare. Inizialmente, le cellule sono esposte ai colliri secchi per rivestire le cellule. Successivamente, le cellule vengono essiccate e l'attività metabolica viene monitorata per valutare se le formulazioni possono mitigare gli effetti dannosi dello stress da essiccazione. Questi passaggi sono fondamentali per comprendere l'impatto complessivo che le formulazioni dell'occhio secco potrebbero avere sulla vitalità complessiva delle cellule epiteliali corneali.

Dopo che la maggior parte delle formulazioni dell'occhio secco sono state rimosse dai pozzi di coltura, la chimica delle molecole rimanenti che sono a contatto con le cellule avrà un impatto sull'essiccazione cellulare. Alcuni prodotti contengono micro-emulsioni di oli che riducono al minimo l'evaporazionecellulare 20. Uno studio che ha valutato l'analisi dell'attrito dopo il risciacquo ha mostrato il mantenimento di un basso attrito per alcune formulazioni dell'occhio secco che può essere un indicatore del tempo di residenza migliorato delle formulazioni dell'occhiosecco 21. Uno dei limiti di questo saggio è che, sebbene la protezione dall'essiccazione possa essere valutata rispetto ad altre formulazioni di colliri, la durata di questa protezione non può essere determinata a causa del breve tempo di asciugatura valutato. Tempi di essiccazione più lunghi in questo saggio in vitro possono richiedere l'uso di colture multistrato che hanno un contenuto complessivo di umidità maggiore rispetto a un monostrato cellulare.

I tempi di incubazione specifici per le formulazioni sulle cellule e la durata del tempo di asciugatura potrebbero dover essere regolati se i valori di temperatura e umidità vengono modificati. Selezionare una temperatura, un RH e un flusso d'aria per simulare condizioni di stress ambientale che possono contribuire all'occhio secco può essere difficile in quanto le condizioni ambientali stagionali e locali sonopiuttosto variabili 21. Le camere ambientali moderne per studi sull'uomo possono variare la temperatura tra 5 °C e 35 °C e RH tra il 5% e il 95%22. Utilizzando un evaporimetro e occhiali ben montati è stato determinato che a RH del 40−45% il tasso di evaporazione dalla cornea era di 0,037 μL/cm2/min e a RH del 20−25% il tasso di evaporazione era di 0,065 μL/cm2/min23. Se il modello in vitro sta esaminando l'effetto protettivo delle formulazioni in condizioni di RH estremamente basse come negli aerei15,deserti o ambienti interni asciutti16, i tempi di incubazione potrebbero dover essere ridotti per adattarsi ai tassi di evaporazione migliorati dalle cellule. Nel fluido lacrimale umano, sono presenti una varietà di lipidi derivati dal meibomio e da altre ghiandole che proteggono le lacrime dall'evaporazione. Questi lipidi hanno diversi punti di fusione24. Le variazioni di temperatura potrebbero influire sulla fluidità del fluido lacrimale, quindi le prove effettuate a temperatura ambiente potrebbero avere tassi di evaporazione significativamente diversi rispetto alle prove condotte a 37 °C. Poiché l'intervallo medio di temperatura della superficie oculare va da 32,9 a 36 °C25,si raccomanda di eseguire la prova vicino a questo intervallo di temperatura.

Oltre al colorante metabolico (alamarBlue) utilizzato in questo protocollo, ci sono altri reagenti chimici che possono essere utilizzati per valutare gli effetti delle formulazioni del prodotto sull'attività metabolica cellulare. I sali di tetrazolio (MTT, XTT, MTS, WST) sono sostanze chimiche alternative che possono essere utilizzate. La differenza nei sali di tetrazolio è che MTT è una molecola carica positivamente in modo che possa entrare nel citoplasma delle cellule viventi26. MTT diventa insolubile dopo la sua riduzione da parte di NAD(P)H27. Deve essere solubilizzato prima di leggere l'assorbanza su un lettore di lastre. Gli altri sali di tetrazolio sono caricati negativamente28. Devono essere ridotti da molecole secondarie al di fuori della cellula vivente perché non possono entrare nella cellula e interagire direttamente con le molecole intracellulari29. Per i test XTT, MTS e WST-1, l'aggiunta di un agente di accoppiamento elettronico 1-metossi fenazina methosulfato (PMS) può migliorare le prestazioni dei test30. A differenza dei test metabolici che utilizzano sali di tetrazolio, alamarBlue non richiede ulteriori agenti solubilizzanti o di accoppiamento elettronico. Inoltre, a differenza di XTT, MTS o WST-1, alamarBlue penetra nelle membrane cellulari e può essere ridotto direttamente dagli enzimicellulari 27,29. Il confronto diretto tra alamarBlue e sali di tetrazolio ha dimostrato che alamarBlue è più sensibile per valutare l'attività metabolica di varie linee cellulari tra cui HCEC3,27,31,32.

Altri endpoint biochimici possono anche essere considerati per valutare la protezione delle cellule epiteliali corneali umane per essiccazione. I coloranti fluorescenti possono essere utilizzati per rilevare la permeabilità della membrana cellulare e l'attività esterasecellulare 1. Inoltre, l'apoptosi può essere rilevata mediante colorazione per marcatori apoptotici sulla superficie cellulare o misurando per l'attività della caspasi1,33. Altri saggi hanno determinato gli effetti dei prodotti oftalmici sulle giunzioni strette HCEC34. Questi saggi potrebbero essere incorporati nelle valutazioni future utilizzando le procedure di essiccazione descritte in questo articolo.

Ci sono molte cause di occhio secco. L'occhio secco può essere causato da una diminuzione della secrezione di lacrime, da un aumento dell'infiammazione della superficie oculare o da una maggiore disidratazione sulla superficie oculare. Per gli individui che hanno l'uso evaporativo dell'occhio secco di una goccia d'occhio secca che impedisce alle loro cellule di asciugarsi durante le condizioni di essiccazione può alleviare i sintomi dell'occhio secco. Uno dei problemi in alcune formulazioni dell'occhio secco è la presenza di conservanti che possono danneggiare la superficie oculare. Le cellule che feriscono non sono utili ai pazienti con occhio secco in quanto possono causare la morte di più cellule poiché le cellule ferite sono più suscettibili allo stress da essiccazione35.

Un recente articolo di revisione di Garrigue et al. L'aggiunta di lipidi a lacrime carenti di lipidi può prevenire l'evaporazione, proteggendo così le cellule dall'essiccazione. Inoltre, gli umettanti sono molecole che attraggono e trattengono l'acqua sulla superficieoculare 37. Sia la glicerina in soluzione #1 il glicole propilenico in soluzione #3 sono umettanti. La #3 ha mostrato un maggiore effetto protettivo dell'HCEC che potrebbe essere dovuto alle proprietà lipidiche e umectanti degli ingredienti della formulazione.

Questo protocollo è progettato per valutare l'attività metabolica dell'HCEC dopo l'esposizione alle formulazioni dell'occhio secco e allo stress da essiccazione. Utilizzando i metodi descritti in questo articolo, è possibile sviluppare nuovi colliri nonirritating e protettivi per le persone che soffrono di occhio secco evaporativo.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tre autori (Rekha Rangarajan, Howard A. Ketelson, Lakshman Subbaraman) sono dipendenti di Alcon. Alcon è l'unica fonte di finanziamento e sponsor di questo progetto. Lyndon W. Jones, negli ultimi 3 anni, ha ricevuto supporto alla ricerca o conferenze honoris causa dalle seguenti aziende: Alcon, Allergan, Contamac, CooperVision, GL Chemtec, Inflamax Research, J&J Vision, Menicon, Nature's Way, Novartis, PS Therapy, Santen, Shire, SightGlass e Visioneering. Lyndon Jones è anche consulente e/o fa parte di un advisory board per Alcon, CooperVision, J&J Vision, Novartis e Ophtecs. La seguente lista di autori non ha nulla da rivelare: Richard Do, David J. McCanna, Adeline Suko, Daryl Enstone, Jaya Dantam.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori ringraziano Alcon per aver fornito sostegno finanziario a questi studi.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
75 cm2 Flaschetta ventilataCorning354485rivestita di collagene del marchio BioCoat
costar3370
alamarBlueFisher Scientificdal 1025
Corning 48 Piastre a pozzettiCorning354505Questo è il
Cytation 5BioTekPuò leggere fluorescenza da 280 a 700 nm (per il test 540/590)
DMEM/F12 con L-glutammina e 15 mM HEPESGibco11039-021Non c'è rosso fenolo in questo mezzo
Siero fetale bovinoHyconeSH30396.03
Cellule epiteliali corneali umaneUniversità di OttawaN/ACellule epiteliali corneali umane immortalizzate con SV40 del Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) e sono state caratterizzate Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Equivalenti corneali umani funzionali costruiti da linee cellulari. Scienza. 1999; 286:2169–72.
Camera di umidità/temperaturaSistemi ambientali associatiLH-1.5Linea Economica Camera di umidità
Penicillina StreptomicinaGibco15140-122100X concentrazione quindi aggiungere 1 ml a ogni 99 ml di terreno
Refresh Optive Advanced (soluzione #1)Allergan, IncCarbossimetilcellulosa sodica (0,5%),glicerina (1%),polisorbato 80 (0,5%),-lubrificanti- ingredienti inattivi-acido borico; copolimero carbomero tipo A; olio di ricino; eritritolo; levocarnitina; acqua purificata; Purite (complesso ossicloro stabilizzato) e può contenere idrossido di sodio per regolare il pH.
Soothe XP (soluzione #2)Bausch & LombOlio minerale leggero (1,0%), Olio minerale (4,5%)-emollienti-Ingredienti inattivi-acido borico, edetato disodico, octossinolo-40, poliquaternio-1 (conservante), polisorbato 80, acqua purificata, sodio borato decaidrato. Può contenere acido cloridrico e/o idrossido di sodio (per regolare il pH).
Systane Complete (soluzione #3)Alcon Inc.Glicole propilenico 0,6% Lubrificante Ingredienti inattivi: acido borico, dimiristoilfosfatidilglicerolo, edatato disodico, idrossipropil guar, olio minerale, polioxl 40 stearato, POLYQUAD® (Polyquaternium-1) 0,001% conservante, tristearato di sorbitano, sorbitolo e acqua purificata. Può contenere acido cloridrico e/o idrossido di sodio per regolare il pH.
TrypLE Express (soluzione di dissociazione cellulare)Fisher Scientific12605036
Questa è la piastra a 96 pozzetti CYT5MPV rivestito di collagene del marchio BioCoat

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Xu, M., Sivak, J. G., McCanna, D. J. Comparison of the effects of ophthalmic solutions on human corneal epithelial cells using fluorescent dyes. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 29 (9), 794-802 (2013).
  2. Maurer, J. K., et al. Quantitative measurement of acute corneal injury in rabbits with surfactants of different type and irritancy. Toxicology and Applied Pharmacology. 158 (1), 61-70 (1999).
  3. Xu, M. L., McCanna, D. J., Sivak, J. G. Use of the viability reagent PrestoBlue in comparison with alamarBlue and MTT to assess the viability of human corneal epithelial cells. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 71, 1-7 (2015).
  4. Slaughter, M. R., Bugelski, P. J., O'Brien, P. J. Evaluation of alamar blue reduction for the in vitro assay of hepatocyte toxicity. Toxicology in Vitro. 13 (4-5), 567-569 (1999).
  5. Hakkarainen, J. J., et al. Acute cytotoxic effects of marketed ophthalmic formulations on human corneal epithelial cells. International Journal of Pharmaceutics. 511 (1), 73-78 (2016).
  6. Paulsen, K., Maile, S., Giebel, J., Tost, F. Lubricating agents differ in their protection of cultured human epithelial cells against desiccation. Medical Science Monitor. 14 (6), 12-16 (2008).
  7. Tost, F., Keiss, R., Grossjohann, R., Jurgens, C., Giebel, J. Effect of different artificial tears against desiccation in cultured human epithelial cells. Medical Science Monitor. 18 (5), 188-192 (2012).
  8. Ubels, J. L., et al. Pre-clinical investigation of the efficacy of an artificial tear solution containing hydroxypropyl-guar as a gelling agent. Current Eye Research. 28 (6), 437-444 (2004).
  9. Hovakimyan, M., et al. Evaluation of protective effects of trehalose on desiccation of epithelial cells in three dimensional reconstructed human corneal epithelium. Current Eye Research. 37 (11), 982-989 (2012).
  10. Zheng, X., Goto, T., Shiraishi, A., Ohashi, Y. In vitro efficacy of ocular surface lubricants against dehydration. Cornea. 32 (9), 1260-1264 (2013).
  11. Matsuo, T. Trehalose protects corneal epithelial cells from death by drying. British Journal of Ophthalmology. 85 (5), 610-612 (2001).
  12. Zheng, Q., et al. Reactive oxygen species activated NLRP3 inflammasomes initiate inflammation in hyperosmolarity stressed human corneal epithelial cells and environment-induced dry eye patients. Experimental Eye Research. 134, 133-140 (2015).
  13. Hua, X., et al. Protective Effects of L-Carnitine Against Oxidative Injury by Hyperosmolarity in Human Corneal Epithelial Cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (9), 5503-5511 (2015).
  14. Schulze, U., et al. Trefoil factor family peptide 3 (TFF3) is upregulated under experimental conditions similar to dry eye disease and supports corneal wound healing effects in vitro. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (5), 3037-3042 (2014).
  15. Giaconia, C., Orioli, A., Di Gangi, A. Air quality and relative humidity in commercial aircrafts: An experimental investigation on short-haul domestic flights. Building and Environment. 67, 69-81 (2013).
  16. van Setten, G., Labetoulle, M., Baudouin, C., Rolando, M. Evidence of seasonality and effects of psychrometry in dry eye disease. Acta Ophthalmologica. 94 (5), 499-506 (2016).
  17. Valtink, M., Donath, P., Engelmann, K., Knels, L. Effect of different culture media and deswelling agents on survival of human corneal endothelial and epithelial cells in vitro. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 254 (2), 285-295 (2016).
  18. Zachari, M. A., et al. Evaluation of the Alamarblue Assay for Adherent Cell Irradiation Experiments. Dose-Response. 12 (2), 246-258 (2014).
  19. Griffith, M., et al. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 286 (5447), 2169-2172 (1999).
  20. Benelli, U. Systane lubricant eye drops in the management of ocular dryness. Clinical Ophthalmology. 5, 783-790 (2011).
  21. Davis, R. E., McGregor, G. R., Enfield, K. B. Humidity: A review and primer on atmospheric moisture and human health. Environmental Research. 144 (Pt A), 106-116 (2016).
  22. Calonge, M., et al. Controlled Adverse Environment Chambers in Dry Eye Research. Current Eye Research. 43 (4), 445-450 (2018).
  23. McCulley, J. P., Uchiyama, E., Aronowicz, J. D., Butovich, I. A. Impact of evaporation on aqueous tear loss. Transactions of the American Ophthalmological Society. 104, 121-128 (2006).
  24. Bron, A. J., Tiffany, J. M., Gouveia, S. M., Yokoi, N., Voon, L. W. Functional aspects of the tear film lipid layer. Experimental Eye Research. 78 (3), 347-360 (2004).
  25. Purslow, C., Wolffsohn, J. S. Ocular surface temperature: a review. Eye & Contact Lens. 31 (3), 117-123 (2005).
  26. Stepanenko, A. A., Dmitrenko, V. V. Pitfalls of the MTT assay: Direct and off-target effects of inhibitors can result in over/underestimation of cell viability. Gene. 574 (2), 193-203 (2015).
  27. Stockert, J. C., Horobin, R. W., Colombo, L. L., Blazquez-Castro, A. Tetrazolium salts and formazan products in Cell Biology: Viability assessment, fluorescence imaging, and labeling perspectives. Acta Histochemica. 120 (3), 159-167 (2018).
  28. Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction. Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).
  29. Rampersad, S. N. Multiple Applications of Alamar Blue as an Indicator of Metabolic Function and Cellular Health in Cell Viability Bioassays. Sensors. 12 (9), 12347-12360 (2012).
  30. Li, J., Zhang, D. L., Ward, K. M., Prendergast, G. C., Ayene, I. S. Hydroxyethyl disulfide as an efficient metabolic assay for cell viability in vitro. Toxicology in Vitro. 26 (4), 603-612 (2012).
  31. Koyanagi, M., Kawakabe, S., Arimura, Y. A comparative study of colorimetric cell proliferation assays in immune cells. Cytotechnology. 68 (4), 1489-1498 (2016).
  32. Uzunoglu, S., et al. Comparison of XTT and Alamar blue assays in the assessment of the viability of various human cancer cell lines by AT-101 (-/- gossypol). Toxicology Mechanisms and Methods. 20 (8), 482-486 (2010).
  33. McIlwain, D. R., Berger, T., Mak, T. W. Caspase functions in cell death and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (4), a026716(2015).
  34. McCanna, D. J., Harrington, K. L., Driot, J. Y., Ward, K. W., Tchao, R. Use of a human corneal epithelial cell line for screening the safety of contact lens care solutions in vitro. Eye & Contact Lens. 34 (1), 6-12 (2008).
  35. Puhlev, I., Guo, N., Brown, D. R., Levine, F. Desiccation tolerance in human cells. Cryobiology. 42 (3), 207-217 (2001).
  36. Garrigue, J. S., Amrane, M., Faure, M. O., Holopainen, J. M., Tong, L. Relevance of Lipid-Based Products in the Management of Dry Eye Disease. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 33 (9), 647-661 (2017).
  37. Lievens, C., et al. Evaluation of an enhanced viscosity artificial tear for moderate to severe dry eye disease: A multicenter, double-masked, randomized 30-day study. Contact Lens & Anterior Eye. 42 (4), 443-449 (2019).

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Saggio dell attivit metabolicaprotezione dalla essiccazionecolorante AlamarBluetest di viabilit cellulareformulazioni per l occhio seccopiastre rivestite di collagenemisurazione della fluorescenzaanalisi statistica

Articoli correlati