Il protocollo presenta un modello murino completo convalidato dalla TNBS della malattia di Crohn e metodi per la visualizzazione dei recettori estrogeni mediante immunosofochimica utilizzando l'immunofluorescenza delle sezioni del colon fissato in formalina incorporate nella paraffina.
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Articolo metodologico
Visualizzazione dei recettori degli estrogeni nei coloni dei topi con la malattia di Crohn indotta da TNBS utilizzando l'immunofluorescenza
In questo articolo
Sommario
Abstract
La malattia di Crohn è il tipo più diagnosticato di malattia infiammatoria intestinale. L'infiammazione cronica in via di sviluppo nell'intestino porta al disturbo della peristalsi e al danno della mucosa intestinale e sembra essere associato ad un aumento del rischio di trasformazione neoplastica del colon. Sempre più prove indicano che gli estrogeni e i recettori degli estrogeni influenzano non solo i tessuti ormone-sensibili, ma anche altri tessuti non direttamente correlati agli estrogeni, come i polmoni o il colon. Qui, descriviamo il protocollo per la colorazione dell'immunofluorescenza di successo dei recettori degli estrogeni nel colon ottenuti da un modello murino della malattia di Crohn indotta da TNBS. Viene fornito un protocollo dettagliato per l'induzione della malattia di Crohn nella preparazione di topi e intestini, nonché una procedura immunohistochimica passo-passo utilizzando sezioni intestinali incorporate con paraffina fissata a formalina. I metodi descritti non sono solo utili per il rilevamento del recettore degli estrogeni e l'indagine di segnalazione degli estrogeni in vivo, ma possono anche essere applicati per altre proteine che possono essere coinvolte nello sviluppo della colite.
Introduzione
La malattia di Crohn (CD) è una malattia infiammatoria intestinale (IBD) manifestata come infiammazione cronica intestinale. L'eziologia del CD è poco compresa, ma ci sono alcuni fattori principali che sembrano essere responsabili dello sviluppo del CD, tra cui il microbiota intestinale, e fattori genetici e ambientali, come la dieta o lo stress1. Per una migliore comprensione della patogenesi della malattia di Crohn, sono stati utilizzati diversi modelli di infiammazione intestinale2,3,4,5,6,
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Protocollo
Gli studi sugli animali sono stati condotti con il consenso del Comitato Etico Locale (28/EB29/2016) in conformità con la direttiva 2010/63/EU del Parlamento europeo e del Consiglio del 22 settembre 2010 e raccomandazioni istituzionali.
1. Modello murino indotto dalla TNBS della malattia di Crohn
NOTA: Questo protocollo utilizza topi maschi BALB/C di peso di 25-28 g. Gli animali sono alloggiati a una temperatura costante (22-24 gradi centigradi) e, relativa umidità 55 - 5%, e mantenuti in un ciclo di luce / buio di 12 h con accesso gratuito a pellet chow standard e tap acqua ad libitum.
- Posizio....
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Risultati
Caratteristiche macroscopiche dei colon nei topi con la malattia di Crohn indotta da TNBS
Le immagini rappresentative dei due punti presi dal controllo e dei topi trattati con TNBS sono mostrate nella Figura 2. Nei topi con un modello indotto da TNBS della malattia di Crohn, la lunghezza del colon è ridotta mentre la larghezza del colon è aumentata.
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Discussione
Ci sono numerosi modelli animali per l'esame di fisiologia IBD, compresi i modelli genetici, immunologici o spontanei, così come i modelli chimicamente indotti15. Tra i diversi tipi di modelli animali di colite, modelli indotti chimicamente come il modello indotto da TNBS descritti in questo protocollo, sono relativamente economici e facili da ottenere. Il modello murino indotto dalla TNBS della colite ha diversi sintomi clinici legati alla base patologica del CD. Gli animali con colite indotta so.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Il lavoro è stato pubblicato grazie al sostegno finanziario delle autorità dell'Università di Lodz: Vice-Rettore per la Ricerca Scientifica, Vice-Rettore per la Cooperazione Nazionale e Internazionale e Preside della Facoltà di Biologia e Protezione Ambientale. Damian Jacenik è stata sostenuta da sovvenzioni (2017/24/T/N'N'5/00045 e 2015/17/N/N/N'N/00336) del Centro Nazionale di Scienze, Polonia.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Animali | |||
| BALB/C topi | Università di Lodz | NA | |
| strong>Equipment | |||
| Calibro | VWR | 62379-531 | |
| Blocco di cartone | NA | NA Microscopio | |
| confocale - TCS SP8 | Leica Biosystems | NA | |
| Microtomo rotativo completamente automatizzato - RM2255 | Leica Biosystems | NA | |
| Vetrino | Thermo Scientific | J1800BMNT | |
| Modulo di inclusione in paraffina riscaldata - EG1150 H | Leica Biosystems | NA | |
| Scatola istologica | Marfour | LN.138747 | |
| Penna idrofobica | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Bilancia da laboratorio | Radwag | WL-104-0048 | |
| Software LAS X | Leica Biosystems | NA | |
| Stampo in metallo | Marfour | CP.5105 | |
| Garza sterile | NA | NA | |
| Forbice sterile | NA | NA | |
| Pinzetta sterile | NA | NA Processatore | |
| di tessuti - TP1020 | Leica Biosystems | NA | |
| Reagents | |||
| 2, 4, 6-trinitrobenzene sulfonato | Sigma-Aldrich | 92822 | |
| Albumina sierica bovina | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| DiOC6 (3) | Sigma-Aldrich | 318426 | |
| DyLight 650 anticorpo secondario | Abcam | ab96886 | |
| ER&alfa; anticorpo primario | Abcam | ab75635 | |
| ERβ anticorpo primario | Abcam | ab3576 | |
| Etanolo | Avantor Performance Materials Polonia | 396480111 | |
| Formaldeide | Avantor Performance Materials Polonia | 432173111 | |
| GPER anticorpo primario | Abcam | ab39742 | |
| Acido cloridrico | Avantor Performance Materials Polonia | 575283421 | |
| Idrogeno perossidasi | Avantor Performance Materials Polonia | 885193111 | |
| isoflurano (forano) | Baxter | 1001936040 | |
| Siero di capra normale | Gibco | 16210064 | |
| Paraffina | Leica Biosystems | 39602012 | |
| Piastra di Petrie | Nest Scientific 705001 | ||
| Soluzione salina tampone fosfato | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Soluzione fisiologica | Sigma-Aldrich | 7982 | |
| Primocin (antibiotico) | Invitrogen | ant-pm-1 | |
| ProLong Diamond Antifage Mountant con DAPI (liquido a base di glicerolo con DAPI) | Invitrogen | P36971 | |
| Cloruro di sodio | Chempur | WE/231-598-3 | |
| Citrato di sodio | Avantor Performance Materiali Polonia | 795780429 | |
| Tris | Avantor Performance Materiali Polonia | 853470115 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Xylene | Avantor Performance Materiali Polonia | BA0860119 |
Riferimenti
- Zhang, Y. Z., Li, Y. Y. Inflammatory bowel disease: pathogenesis. World Journal of Gastroenterology. 20 (1), 91-99 (2014).
- Morris, G. P., et al. Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon. Gastroenterology. 96<....
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Ristampe e permessi
