Articolo metodologico

Studiare gli effetti neurocomportamentali degli inquinanti ambientali sulle larve dei pesci zebra

DOI:

10.3791/60818

⸱

5 febbraio 2020

 ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Marine Geology, Tongji University, 2Key Laboratory of Yangtze River Water Environment, Ministry of Education, College of Environmental Science and Engineering, Tongji University, 3Shanghai Collaborative Innovation Centre for WEEE Recycling, WEEE Research Center of 10 Shanghai Polytechnic University, 4Shanghai Institute of Pollution Control and Ecological Security

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un protocollo sperimentale dettagliato è presentato in questo documento per la valutazione della tossicità neurocomportamentale degli inquinanti ambientali utilizzando un modello di larva di pesce zebra, compreso il processo di esposizione e i test per gli indicatori neurocomportamentali.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Negli ultimi anni sempre più inquinanti ambientali si sono dimostrati neurotossici, soprattutto nelle prime fasi di sviluppo degli organismi. Le larve di pesce zebra sono un modello preminente per lo studio neurocomportamentale degli inquinanti ambientali. In questo caso, viene fornito un protocollo sperimentale dettagliato per la valutazione della neurotossicità degli inquinanti ambientali utilizzando larve di pesce zebra, compresa la raccolta degli embrioni, il processo di esposizione, gli indicatori neurocomportamentali, il processo di prova e analisi dei dati. Inoltre, vengono discussi l'ambiente culturale, il processo di esposizione e le condizioni sperimentali per garantire il successo del test. Il protocollo è stato utilizzato nello sviluppo di farmaci psicopatici, ricerca sugli inquinanti neurotossici ambientali, e può essere ottimizzato per fare studi corrispondenti o essere utile per studi meccanicistici. Il protocollo dimostra un chiaro processo operativo per studiare gli effetti neurocomportamentali sulle larve di pesce zebra e può rivelare gli effetti di varie sostanze neurotossiche o inquinanti.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Negli ultimi anni sempre più inquinanti ambientali si sono dimostrati neurotossici1,2,3,4. Tuttavia, la valutazione della neurotossicità in vivo dopo l'esposizione agli inquinanti ambientali non è così facile come quella della perturbazione endocrina o della tossicità dello sviluppo. Inoltre, l'esposizione precoce agli inquinanti, soprattutto a dosi rilevanti per l'ambiente, ha attirato una crescente attenzione negli studi di tossicità5,6,7,8.

Il pesce zebra viene istituito come modello animale adatto agli studi di neurotossicità durante lo sviluppo precoce dopo l'esposizione agli inquinanti ambientali. I pesci zebra sono vertebrati che si sviluppano più velocemente di altre specie dopo la fecondazione. Le larve non hanno bisogno di essere nutrite perché i nutrienti nel chorion sono sufficienti per sostenerli per 7 giorni dopo la fecondazione (dpf)9. Le larve escono dal chorion a 2 dpf e sviluppano comportamenti come il nuoto e la tornitura che possono essere osservati, tracciati, quantificati e analizzati automaticamente utilizzando strumenti di comportamento10,11,12,13 a partire da 3-4 dpf14,15,16,17,18. Inoltre, i test ad alta velocità possono essere realizzati anche da strumenti di comportamento. Pertanto, le larve di pesce zebra sono un modello eccezionale per lo studio neurocomportamentale degli inquinanti ambientali19. Qui, viene offerto un protocollo utilizzando il monitoraggio ad alta produttività per studiare la tossicità neurocomportamentale degli inquinanti ambientali sulle larve di pesce zebra sotto leggeri stimoli.

Il nostro laboratorio ha studiato la tossicità neurocomportamentale di 2,2',4,4'-tetrapemodinoil etere (BDE-47)20,21, 6'-Hydroxy/Methoxy-2,2',4,4'-tetra etere bromodiphenyl (6-OH/MeO-BDE-47)22, etere difenile deca-brominato (BDE-209), paraffine di piombo e clorato23 utilizzando il protocollo presentato. Molti laboratori utilizzano anche il protocollo per studiare gli effetti neurocomportamentali di altri inquinanti su larve o pesci adulti24,25,26,27. Questo protocollo neurocomportamentale è stato utilizzato per aiutare a fornire supporto meccanicistico dimostrando che l'esposizione a basse dosi al bisfenolo A e il bisfenolo sostitutivo S indotta neurogenesi ipotalamica precoce nel pesce zebra embrionale27. Inoltre, alcuni ricercatori hanno ottimizzato il protocollo per eseguire studi corrispondenti. Uno studio recente ha eliminato la tossicità della beta amiloide (A) in un modello di pesce zebra facile e ad alto throughput utilizzando nanoparticelle d'oro rivestite di caseina (Cas AuNP). Ha mostrato che - Cas AuNPs in circolazione sistemica traslocato attraverso la barriera egizia-encefalica delle larve di pesce zebra e sequestrato intracerebrale A -42, suscitando tossicità in modo non specifico, chaperone-like, che era supportato dalla patologia comportamentale28.

Locomozione, angolo di percorso e attività sociale sono tre indicatori neurocomportamentali utilizzati per studiare gli effetti della neurotossicità delle larve di pesce zebra dopo l'esposizione agli inquinanti nel protocollo presentato. La locomozione è misurata dalla distanza di nuoto delle larve e può essere danneggiata dopo l'esposizione agli inquinanti. L'angolo di percorso e l'attività sociale sono più strettamente correlati con la funzione del cervello e del sistema nervoso centrale29. L'angolo del percorso si riferisce all'angolo del percorso del movimento animale rispetto alla direzione di nuoto30. Nel sistema sono impostate otto classi d'angolo a partire da 180 gradi. Per semplificare il confronto, sei classi nel risultato finale sono definite come turni di routine (-10, 0, 0, 0, 10 dollari), curve medie (-10, 90, 10 dollari e giri reattivi (-180 gradi, 90, 90 dollari, 90 dollari), curve medie (-10, 90, 90 dollari) secondo i nostri studi precedenti21,22. L'attività sociale a due pesci è fondamentale per il comportamento di gruppo shoaling; qui una distanza di < 0,5 cm tra due larve valide è definita come contatto sociale.

Il protocollo qui presentato dimostra un chiaro processo per studiare gli effetti neurocomportamentali sulle larve di pesce zebra e fornisce un modo per rivelare gli effetti di neurotossicità di varie sostanze o inquinanti. Il protocollo andrà a beneficio dei ricercatori interessati a studiare la neurotossicità degli inquinanti ambientali.

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Protocollo

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Il protocollo è conforme alle linee guida approvate dal Comitato Etico Animale dell'Università di Tongji.

1. Raccolta di embrioni di pesce zebra

  1. Mettere due coppie di sano adulto Tubingen zebrefish nella scatola di deposizione delle uova la notte prima dell'esposizione, mantenendo il rapporto di sesso a 1:1.
  2. Rimuovere il pesce adulto al sistema 30-60 min dopo la luce del giorno la mattina successiva.
  3. Togliere gli embrioni dalla scatola di riproduzione.
  4. Sciacquare gli embrioni con acqua di sistema.
  5. Trasferire gli embrioni in una parabola di vetro Petri (9 cm di diametro) con acqua di sistema sufficiente.
  6. Osservare gli embrioni al microscopio e selezionare gli embrioni sani per un'esposizione successiva.
    NOTA: Gli embrioni sani sono solitamente trasparenti con un colore dorato chiaro al microscopio. Gli embrioni malsani sono solitamente pallidi e raggruppati insieme come osservato al microscopio.

2. Preparazione prima dell'esposizione

  1. Preparare la soluzione di Hanks's secondo le linee guida del libro di pesce zebra31.
    NOTA: la soluzione Di Hanks include 0.137 M NaCl, 5.4 mM KCl, 0.25 mM Na2HPO4, 0.44 mM KH2PO4, 1.3 mM CaCl2, 1.0 mM MgSO4, e 4.2 mM NaHCO3.
  2. Diluire la soluzione di Hanks ' alla soluzione 10% Hanks' utilizzando acqua sterile.
  3. Aggiungi 1 mL di DMSO in 999 mL di 10% soluzione Hanks per creare una soluzione di controllo del 10% di soluzione Hanks, incluso lo 0,1% DMSO.
    NOTA: i passaggi successivi utilizzano BDE-47 come esempio di soluzione di esposizione.
  4. Sciogliere 5 mg del pulito BDE-47 in 1 mL di 100% DMSO per fare una soluzione di esposizione standard di 5 mg/mL.
  5. Vorticare la soluzione 5 mg/mL per 1 min per sciogliere completamente il BDE-47 nel DMSO.
  6. Trasferire 10 l della soluzione 5 mg/mL in una bottiglia di vetro marrone da 12 ml.
  7. Aggiungere acqua sterilizzata ad un volume finale di 10 mL per rendere la concentrazione di soluzione di esposizione BDE-47 5 rapporto mg/L e DMSO allo 0,1%, quindi vortice per 1 min.
  8. Trasferire 10 e 100 l una delle soluzione da 5 mg/L rispettivamente in due flacci volumetrici da 100 ml.
  9. Aggiungere il 10% della soluzione Hanks, incluso lo 0,1% DMSO (preparato al punto 2.3) a 100 mL per effettuare le concentrazioni finali delle soluzioni di esposizione BDE-47, rispettivamente 5 g/L e 50 g/L.
  10. Trasferire le soluzioni in bottiglie di vetro marrone da 100 ml e conservarle a 4 gradi centigradi.

3. Esposizione degli embrioni

  1. Trasferire 50 embrioni in ciascuno dei tre piatti di vetro Petri (6 cm di diametro) 3-5 ore dopo la fecondazione (hpf).
  2. Utilizzare una punta pipetta da 1 mL per macchiare l'acqua del sistema intorno agli embrioni.
  3. Utilizzare una pipetta per trasferire il controllo e due soluzioni di esposizione BDE-47 (controllo, 5 g/L, 50 g/L) rispettivamente nei tre piatti di vetro Petri.
  4. Agitare i piatti di vetro Petri delicatamente uno per uno per rendere gli embrioni dispersi nella parte inferiore del piatto.
  5. Mettete i piatti di vetro Petri nell'incubatrice leggera sotto i 28,5 gradi centigradi.
  6. Rinnovare metà delle soluzioni di esposizione ogni 24 ore fino a 5 dpf.
  7. Controllare gli embrioni morti di ogni gruppo su 1 dpf e 2 dpf e calcolare il tasso di mortalità.
  8. Controllare gli embrioni incubati di ogni gruppo su 2 dpf e 3 dpf e calcolare la schiusa.
  9. Controllare la deformità delle larve ogni giorno dopo che escono dal chorion e calcolare il tasso di deformità di ogni gruppo.
    NOTA: Gli indicatori di deformità includono la cisti pericardio, la curvatura spinale, la curvatura della coda, tra gli altri fattori32.

4. Preparazione per il test di comportamento

  1. Preparare una micropiastra di 48 pozzetto per la locomozione e la prova dell'angolo di percorso e tre 6 microplacche per il test di attività sociale la mattina del 5 dpf.
  2. Trasferire 800 litri di soluzione di esposizione in ogni pozzo della microplacca 48 pozzo.
    NOTA: Utilizzare 16 pozze per ogni gruppo (ad es. la soluzione di controllo, 5 g/L e 50 gruppo g/L).
  3. Utilizzare una punta di pipetta da 1 mL per trasferire 200 l'l di soluzione di esposizione con una larva dalla piastra di vetro Petri in uno dei 48 pozzetti.
  4. Trasferire 4 mL di soluzione di esposizione in ogni pozzo della micropiastra a 6 pozzetto.
    NOTA: Utilizzare una micropiastra 6 po ' per ogni gruppo.
  5. Utilizzare una punta di pipetta da 1 mL per trasferire 200 l-L di soluzione di esposizione con due larve in ogni pozzetto della micropiastra del pozzo a 6.
    NOTA: ogni gruppo ha sei gruppi ripetuti.
  6. Prima del test, assicurarsi che la temperatura della sala prove sia di 28 h.
    NOTA: I test comportamentali vengono di solito eseguiti nel pomeriggio.

5. Test comportamentale

  1. Test dell'angolo di locomozione e percorso
    1. Fare clic sull'icona di avvio sulla scrivania del computer per aprire il software (vedere Tabella dei materiali) che controlla l'enclosure di monitoraggio ad alta velocità effettiva per avviare il programma.
    2. Scegliere il modulo "Tracking, Rotations, Path Angles" per accedere all'interfaccia operativa.
    3. Trasferire la micropiastra ben 48 preparata al punto 4.3 sulla piattaforma di registrazione e tirare giù il coperchio.
    4. Fare clic sul pulsante "File" " "Genera protocollo" a sua volta nel software per iniziare a generare un nuovo protocollo.
    5. Immettere "48" nella posizione "Numero di ubicazione" e fare clic sul pulsante "OK".
    6. Fare clic sul pulsante "Parametri" " "Parametri protocollo""" a sua volta nel software. Impostare la durata dell'esperimento per 1 h e 10 min e impostare il periodo di integrazione su 60 s33.
    7. Disegnare le aree rilevate.
      1. Selezionare la forma ellittica e disegnare il primo cerchio intorno al primo riquadro in alto a sinistra.
      2. Seleziona il cerchio, fai clic sul pulsante "Copia" " "Primo-Destra "Incolla" "Seleziona" a sua volta, e usa il mouse per trascinare il cerchio copiato in alto a destra.
      3. Seleziona il cerchio, fai clic sul pulsante "Copia" " "Segno inferiore" "Incolla" "Seleziona" a sua volta, e usa il mouse per trascinare il cerchio copiato in basso a destra.
      4. Fare clic sul pulsante "Costruisci" "Cancella segni" a sua volta.
        NOTA: Il sistema attirerà automaticamente ogni altro pozzo della piastra. Le aree appena create dovrebbero perfettamente adattarsi ogni bene tra il pesce reale e la sua riflessione sul lato del pozzo.
    8. Fare clic sul pulsante "Disegna scala", disegnare una linea di calibrazione sullo schermo (un percorso diagonale o parallelo al lato della microplacca), immettere la sua lunghezza e impostare l'"Unità". Quindi fare clic sul pulsante "Applica al gruppo".
    9. Impostare il colore animale su "Nero" nel software.
    10. Impostare la soglia di rilevazione a 16-18 per consentire il rilevamento degli animali.
    11. Ingresso inattivo/piccolo/grande velocità a 0,5 cm/s e 2,5 cm/s rispettivamente.
    12. Impostare le classi dell'angolo di percorso. Immettere "-90, -30, -10, 0, 10, 30 e 90" per creare classi di angolo di percorso da -180 a 180 gradi.
    13. Impostare le condizioni della luce
      1. Fare clic sul pulsante "Parametri" " "Guida leggera" utilizza uno dei 3 metodi diattivazione sottoil pulsante " "Stimoli avanzati" per impostare le condizioni della luce.
      2. Scegli il pulsante "Bordo", quindi imposta un periodo buio di 10 min, seguito da tre cicli di alternanza di 10 min di periodi chiari e bui.
    14. Salvare il protocollo e abbassare la luce della sala prove.
    15. Acclimatare le larve nel sistema per 10 minuti e fare clic sul pulsante "Esperimento" "Esegui" a sua volta, quindi scegliere la cartella in cui vengono salvati i file dell'esperimento e immettere il nome del risultato.
    16. Fare clic sul pulsante "Sfondo" " "Start" a turno per avviare il test.
    17. Fare clic sul pulsante "Esperimento" "Stop" a turno per interrompere l'esperimento al termine del test.
      NOTA: il sistema mostra i dati testati all'arresto del sistema. I dati includono la distanza tracciata a tre classi di velocità e i numeri di angolo del percorso in otto classi angolo di ogni minuto. Per il test di locomozione nell'esempio presentato, viene calcolata la distanza totale in ogni periodo di luce (10 min) e la differenza tra il gruppo di controllo e i gruppi di trattamento confrontati.
    18. Trasferire la micropiastra 48 pozzetto nell'incubatrice leggera per altri esperimenti.
  2. Test di attività sociale
    1. Fare clic sull'icona di avvio sulla scrivania del computer per aprire il software che controlla l'enclosure di monitoraggio ad alta velocità effettiva per avviare il programma.
    2. Scegliere il modulo "Interazioni Sociali" per accedere all'interfaccia operativa.
    3. Trasferire la micropiastra ben preparato a 6 (gruppo di controllo) nel passaggio 4.4 sulla piattaforma di registrazione e tirare giù il coperchio.
    4. Fare clic sul pulsante "File" " "Genera protocollo" a sua volta nel software per iniziare a generare un nuovo protocollo.
    5. Immettere "6" nella posizione "Conteggio posizioni" e fare clic sul pulsante "OK".
    6. Fare clic sul pulsante "Parametri" " "Parametri protocollo""" a sua volta nel software. Impostare la durata dell'esperimento per 1 h e 10 min e impostare il periodo di integrazione su 60 s.
    7. Disegnare le aree rilevate.
      1. Selezionare la forma ellittica e disegnare il primo cerchio intorno al primo riquadro in alto a sinistra.
      2. Seleziona il cerchio, fai clic sul pulsante "Copia" " "Primo-Destra ""Incolla" "Seleziona" a sua volta, e usa il mouse per trascinare il cerchio copiato nel pozzo in alto a destra.
      3. Seleziona il cerchio, fai clic sul pulsante "Copia" " "Segno inferiore" "Incolla" "Seleziona" a sua volta, e usa il mouse per trascinare il cerchio copiato in basso a destra.
      4. Fare clic sul pulsante "Costruisci" "Cancella segni" a sua volta.
        NOTA: Le aree appena create dovrebbero adattarsi perfettamente a ciascuno e tra le larve effettive e la sua riflessione sul lato del pozzo.
    8. Fare clic sul pulsante "Disegna scala", disegnare una linea di calibrazione sullo schermo (un percorso diagonale o parallelo al lato della microplacca), immettere la sua lunghezza e impostare l'"Unità". Quindi fare clic sul pulsante "Applica al gruppo".
    9. Impostare la soglia di rilevazione a 16-18 per consentire il rilevamento degli animali.
    10. Fare clic sul pulsante "Black animal" nel software.
    11. Scegliere il pulsante "Soglia distanza" e inserire "5" nel software.
    12. Impostare le condizioni della luce.
      1. Fare clic sul pulsante "Parametri" " "Guida leggera" utilizza uno dei 3 metodi diattivazione sottoil pulsante " "Stimoli avanzati" per impostare le condizioni della luce.
      2. Scegli il pulsante "Bordo", quindi imposta un periodo buio di 10 min, seguito da tre cicli di alternanza di 10 min di periodi chiari e bui.
    13. Salvare il protocollo e abbassare la luce della stanza.
    14. Acclimatare le larve nel sistema per 10 minuti e fare clic sul pulsante "Esperimento" "Esegui" a sua volta, quindi scegliere la cartella in cui vengono salvati i file dell'esperimento e immettere il nome del risultato.
    15. Fare clic sul pulsante "Sfondo" " "Start" a turno per avviare il test.
    16. Fare clic sul pulsante "Esperimento" "Stop" a sua volta per interrompere l'esperimento nel software al termine del test.
      NOTA: il sistema mostra i dati testati all'arresto del sistema.
    17. Trasferire la micropiastra 6 pozzetto (gruppo di controllo) nell'incubatrice leggera per altri esperimenti.
    18. Trasferire le 6 microplacche (5 gruppi di g/L e 50 g/L) a turno sulla piattaforma di registrazione e ripetere i passaggi da 5.2.4 a 5.2.17 per ordinale.

6. Analisi dei dati

  1. Aprire il file del foglio di calcolo nei risultati della locomozione e dell'angolo del tracciato.
  2. Selezionare le tre colonne di distanza (inadico, smldista, lardist) e sommarle.
    NOTA: i dati di inadico, smldistae lardista indicano distanze diverse registrate dal sistema in diverse classi di velocità (inattive/piccole/grandi).
  3. Per ogni periodo di luce di 10 minuti riassumere la distanza di ogni pozzo, calcolare la distanza media di 16 pozzi, e confrontare i dati dei tre gruppi sotto stimoli leggeri.
  4. Per ogni periodo di luce di 10 minuti riassumere il numero di angolo di ogni pozzo in ogni durata di luce da cl01 a cl08 a sua volta, e confrontare i dati dei tre gruppi sotto stimoli leggeri.
    NOTA: i dati delle colonne da cl01 a cl08 indicano diversi numeri di angolo di percorso registrati dal sistema rispettivamente in diversi angoli di percorso.
  5. Aprire il file del foglio di calcolo nei risultati dell'attività social.
  6. Selezionare le colonne contct e contdur, e per ogni periodo di 10 min leggero riassumere i tempi sociali e la loro durata per ogni pozzo.
  7. Calcolare i tempi sociali medi e la durata di un gruppo in ogni durata della luce e confrontare i dati dei tre gruppi sotto stimoli leggeri.

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Risultati

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Qui, descriviamo un protocollo per studiare gli effetti neurocomportamentali degli inquinanti ambientali utilizzando larve di pesce zebra sotto stimoli leggeri. I test di locomozione, angolo di percorso e attività sociale sono definiti nell'introduzione. Di seguito sono riportate le impostazioni delle microplacche nei test di locomozione e di angolo di percorso e le immagini del software. Inoltre, i nostri risultati della ricerca sono presentati come esempi. Due studi presentano gli effet...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro fornisce un protocollo sperimentale dettagliato per valutare la neurotossicità degli inquinanti ambientali utilizzando larve di pesce zebra. Il pesce zebra passa attraverso il processo dagli embrioni alle larve durante il periodo di esposizione, il che significa che una buona cura degli embrioni e delle larve è essenziale. Tutto ciò che influenza lo sviluppo degli embrioni e delle larve può influenzare il risultato finale. Qui vengono discussi l'ambiente culturale, il processo di esposizione e le condizioni...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori sono grati per il sostegno finanziario della National Natural Science Foundation of China (21876135 e 21876136), il National Major Science and Technology Project of China (2017-X07502003-03, 2018 Laboratorio chiave per la salute ambientale dei bambini (CEH201807-5) e il Consiglio svedese della ricerca (n. 639-2013-6913).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Micropiastra a 48 pozzettiCorning3548Alloggiamento Embyros
Micropiastra a 6 pozzettiCorning3471Custodia Embyros
BDE-47AccuStandard5436-43-1Inquinante
DMSOSigma67-68-5Microscopio a cosolvente
osservazioneOlympusSZX 16
PipettaEppendorf3120000267Soluzione di trasferimento
ZebraboxViewpointZebraBoxStrumento di comportamento
ZebrafishShanghai FishBio Co., Ltd.TubingenZebrafish fornitore
ZebraLabViewpointZebraLabBehavior software
Strumento di

Riferimenti

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