Stable Knockdown of Genes Encoding Extracellular Matrix Proteins nella linea cell Myoblast C2C12 Utilizzando Small-Hairpin (sh)RNA

Nandaraj Taye; Sarah Stanley; Dirk Hubmacher

doi:10.3791/60824

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Articolo metodologico

Stable Knockdown of Genes Encoding Extracellular Matrix Proteins nella linea cell Myoblast C2C12 Utilizzando Small-Hairpin (sh)RNA

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DOI:

10.3791/60824

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12 febbraio 2020

Nandaraj Taye¹ , Sarah Stanley¹ , Dirk Hubmacher¹

¹Orthopaedic Research Laboratories, Leni & Peter W. May Department of Orthopaedics, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

In questo articolo

Sommario

Forniamo un protocollo per abbattere stabilmente i geni che codificano le proteine eCM (Extracellular Matrix) nei mioblasti C2C12 usando l'RNA per piccoli capellini (sh). Mirando ad ESEMPIO ad ADAMTSL2, descriviamo i metodi per la convalida dell'efficienza di abbattimento a livello mRNA, proteina e cellulare durante il mioblasto C2C12 alla differenziazione del miotubo.

Abstract

Le proteine a matrice extracellulare (ECM) sono fondamentali per lo sviluppo muscolare scheletrico e l'omeostasi. L'abbattimento stabile dei geni che codificano per le proteine ECM nei mioblasti C2C12 può essere applicato per studiare il ruolo di queste proteine nello sviluppo muscolare scheletrico. Qui, descriviamo un protocollo per esaurire la proteina ECM ADAMTSL2 come esempio, usando l'RNA small-hairpin (sh) nelle cellule C2C12. Dopo la trafezione di plasmidi shRNA, le cellule stabili sono state selezionate in batch utilizzando la panina puromicina. Descriviamo inoltre il mantenimento di queste linee cellulari e l'analisi fenotipica tramite l'espressione mRNA, l'espressione proteica e la differenziazione C2C12. I vantaggi del metodo sono la generazione relativamente veloce di cellule knockdown C2C12 stabili e la differenziazione affidabile delle cellule C2C12 in miotubi multinuletti al momento dell'esaurimento del siero nel mezzo di coltura cellulare. La differenziazione delle cellule C2C12 può essere monitorata mediante microscopia da campo brillante e misurando i livelli di espressione dei geni dei marcatori canonici, come MyoD, miogenina o miosina a catena pesante (MyHC) che indica la progressione della mioblastizzazione C2C12 nei miotubi. A differenza dell'abbattimento transitorio di geni con RNA a piccole interferenze (si), i geni che vengono espressi in seguito durante la differenziazione del C2C12 o durante la maturazione del miotubo possono essere mirati in modo più efficiente generando cellule C2C12 che esprimono stabilmente lo shRNA. Le limitazioni del metodo sono una variabilità nell'efficienza del knockdown, a seconda dello shRNA specifico che può essere superato utilizzando strategie di knockout genico basate su CRISPR/Cas9, così come potenziali effetti fuori bersaglio dello shRNA che dovrebbero essere considerati.

Introduzione

Le proteine della matrice extracellulare (ECM) forniscono supporto strutturale per tutti i tessuti, mediano la comunicazione cellulare-cellula e determinano il destino cellulare. La formazione e il rimodellamento dinamico di ECM è quindi fondamentale per mantenere l'omeostasi dei tessuti e degli organi¹^,². Varianti patologiche in diversi geni codificando per le proteine ECM danno origine a disturbi muscolo-scheletrici con fenotipi che vanno dalle distrofie muscolari alla costruzione pseudomouscolare³^,⁴. Ad esempio, le varianti patogene in ADAMTSL2<....