Un protocollo di estrazione del genoma guidato dalla spettrometria di massa è stabilito e descritto qui. Si basa sulle informazioni sulla sequenza genomica e sull'analisi LC-MS/MS e mira a facilitare l'identificazione di molecole da complessi estratti microbici e vegetali.
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Articolo metodologico
Mass Spectrometry-Guided Genome Mining come strumento per scoprire nuovi prodotti naturali
In questo articolo
Sommario
Abstract
Lo spazio chimico coperto da prodotti naturali è immenso e ampiamente non riconosciuto. Pertanto, sono desiderate metodologie convenienti per eseguire una valutazione ad ampio raggio delle loro funzioni in natura e potenziali benefici umani (ad esempio, per applicazioni di scoperta di farmaci). Questo protocollo descrive la combinazione di estrazione del genoma (GM) e networking molecolare (MN), due approcci contemporanei che corrispondono alle annotazioni con codifica a cluster genico nel sequenziamento dell'intero genoma con le firme della struttura chimica da estratti metabolici grezzi. Questo è il primo passo verso la scoperta di nuove entità naturali. Questi concetti, se applicati insieme, sono qui definiti come estrazione genomica guidata da MS. In questo metodo, i componenti principali sono designati in precedenza (utilizzando MN) e i nuovi candidati strutturalmente correlati sono associati alle annotazioni della sequenza del genoma (utilizzando GM). La combinazione di GM e MN è una strategia redditizia per colpire nuove spinadorsali molecolari o raccogliere profili metabolici al fine di identificare analoghi da composti già noti.
Introduzione
Le indagini sul metabolismo secondario spesso consistono nello screening di estratti grezzi per specifiche attività biologiche seguite da purificazione, identificazione e caratterizzazione dei costituenti appartenenti a frazioni attive. Questo processo si è dimostrato efficiente, promuovendo l'isolamento di diverse entità chimiche. Tuttavia, al giorno d'oggi questo è visto come irrealizzabile, principalmente a causa degli alti tassi di riscoperta. Come l'industria farmaceutica rivoluzionato senza conoscenza dei ruoli e le funzioni di metaboliti specializzati, la loro identificazione è stata effettuata in condizioni di laboratorio che non rappresentavano con precisione....
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Protocollo
1. Estrazione del genoma per cluster genici biosintetici
- Eseguire il sequenziamento dell'intero genoma (WGS) come primo passo per eleggere un cluster genico biosintetico (BCG) per l'estrazione del genoma guidata dalla MS. L'intero genoma del ceppo di interesse (batteri) può essere ottenuto dalla tecnologia Illumina MiSeq utilizzando quanto segue con DNA genomico di alta qualità: fucile TruSeq PCR-Free library prep e Nextera Mate Pair Library Preparation Kit33.
NOTA: dopo la sequenza, è possibile assemblare la libreria del fucile Illumina e la libreria della coppia di accoppiamenti Illuminazione utilizzando Newbler v3.0 (Roche, 454)....
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Risultati
Il protocollo è stato esemplificato con successo utilizzando una combinazione di estrazione del genoma, espressione etetologa e approcci MS-guidato/codice per accedere a nuove molecole specializzate di analoghi di valinomicina. Il flusso di lavoro genoma-molecola per il bersaglio, la valiomicina (VLM), è rappresentato nella Figura 8. Il genoma del progetto CBMAI 2042 è stato analizzato in silico e il cluster genico VLM è stato quindi identificato e trasferito in un ospite etelogoo. .......
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Discussione
Il vantaggio più forte di questo protocollo è la sua capacità di dereplicare rapidamente i profili metabolici e le informazioni genomiche del ponte con i dati MS al fine di chiarire le strutture di nuove molecole, in particolare analoghi strutturali2. Sulla base di informazioni genomiche, è possibile studiare chemiotipi di prodotti naturali diversi, come i polionidi (PK), i peptidi non ribonsuici (NRP) e i prodotti naturali glicosillati (GNP), nonché gli screening metabolomici criptici. Così, un B.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Il sostegno finanziario a questo studio è stato fornito dalla Fondazione ricerca di San Paolo - FAPESP (2019/10564-5, 2014/12727-5 e 2014/50249-8 a L.G.O; 2013/12598-8 e 2015/01013-4 a R.S.; e 2019/08853-9 a C.F.F.A). B.S.P, C.F.F.A. e L.G.O. hanno ricevuto borse di studio dal Consiglio nazionale per lo sviluppo scientifico e tecnologico - CNPq (205729/2018-5, 162191/2015-4 e 313492/2017-4). L.G.O. è anche grato per il sostegno alla borsa di studio fornito dal programma For Women in Science (2008, edizione brasiliana). Tutti gli autori riconoscono CAPES (Coordinamento per il Miglioramento del Personale per l'Istruzione Superiore) per aver sostenuto i programmi post-la....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Acetonitrile | Tedia | AA1120-048 | HPLC grado |
| Agar | Oxoid | LP0011 | NA |
| Apramicina | Sigma Aldrich | A2024 | NA |
| Carbenicillina | Sigma Aldrich | C9231 | NA |
| Centrifuga | Eppendorf | NA | 5804 |
| Cloramfenicolo | Sigma Aldrich | C3175 | NA |
| Colonna C18 | Agilent Technologies | NA | ZORBAX RRHD Extend-C18, 80Å, 2,1 x 50 mm, 1,8 µ m, limite di pressione 1200 bar Art. 757700-902 |
| Kanamicina | Sigma Aldrich | K1377 | NA |
| Manitol P.A.- A.C.S. | Synth | NA | |
| NA Microcentrifuga | Eppendorf | NA | 5418 |
| Acido nalidixico | Sigma Aldrich | N4382 | NA |
| Phusion Flash PCR ad alta fedeltà Master Mix | ThermoFisher Scientific | F548S | NA |
| Q-TOF spettrometro di massa | Agilent technologies | NA | 6550 iFunnel Q-TOF LC/MS |
| Sacarosio P.A.- A.C.S. | Synth | NA | NA |
| Shaker/Incubator | Marconi | MA420 | NA |
| Cloruro di sodio | Synth | NA | P. A. - ACS Estratto di |
| soia | NA | NA | NA |
| Saccarosio | Synth | NA | P. A. - ACS |
| Cicli termici | Eppendorf | NA | Mastercycler Nexus Gradient |
| Thiostrepton | Sigma Aldrich | T8902 | NA |
| Triptone | Oxoid | LP0042 | NA |
| Triptone Brodo di soia | Oxoid | CM0129 | NA |
| UPLC | Agilent Technologies | NA | 1290 Infinity LC System |
| Estratto di lievito | Oxoid | LP0021 | NA |
Riferimenti
- Davies, J. Specialized microbial metabolites: functions and origins. The Journal of Antibiotics. 66 (7), Tokyo. 361-364 (2013).
- Ziemert, N., Alanjary, M., Weber, T. The evolution of genome mining in microbes - a review. Natural Product Reports. 33 (8)....
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Ristampe e permessi
