Questo protocollo presenta un modo semplice e coerente per eseguire l'upregolazione transitoria di un gene di interesse usando modRNA dopo l'infarto miocardico nei topi.
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Articolo metodologico
Consegna di mRNA modificato in un modello di topo di infarto miocardico
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'infarto miocardico (MI) è una delle principali cause di morbilità e mortalità nel mondo occidentale. Nell'ultimo decennio, la terapia genica è diventata un'opzione di trattamento promettente per le malattie cardiache, grazie alla sua efficienza e agli eccezionali effetti terapeutici. Nel tentativo di riparare il tessuto danneggiato post-MI, vari studi hanno impiegato la terapia genica virale o basata sul DNA, ma hanno affrontato notevoli ostacoli a causa della scarsa e incontrollata espressione dei geni consegnati, dell'edema, dell'aritmia e dell'ipertrofia cardiaca. L'mRNA modificato sintetico (modRNA) presenta un nuovo approccio alla terapia genica che offre un'elevata, transitoria, sicura, non immunogenica e controllata e controllata esodaal tessuto cardiaco senza alcun rischio di integrazione genomica. Grazie a queste notevoli caratteristiche combinate con la sua farmacocinetica a forma di campana nel cuore, il modRNA è diventato un approccio attraente per il trattamento delle malattie cardiache. Tuttavia, per aumentare la sua efficacia in vivo, è necessario seguire un metodo di consegna coerente e affidabile. Quindi, per massimizzare l'efficienza di consegna del modRNA e la coerenza di rendimento nell'uso di modRNA per applicazioni in vivo, viene presentato un metodo ottimizzato di preparazione e somministrazione dell'iniezione intracardiaca del modRNA in un modello MI del mouse. Questo protocollo renderà la consegna di modRNA più accessibile per la ricerca di base e traslazionale.
Introduzione
La terapia genica è un potente strumento che coinvolge la consegna di acidi nucleici per il trattamento, la cura o la prevenzione delle malattie umane. Nonostante i progressi compiuti negli approcci diagnostici e terapeutici per le malattie cardiache, c'è stato un successo limitato nella fornitura di geni nell'infarto miocardico (MI) e nell'insufficienza cardiaca (HF). Per quanto semplice sembri il processo di terapia genica, si tratta di un approccio marcatamente complesso considerando i molti fattori che devono essere ottimizzati prima di impiegare un particolare veicolo di consegna. Il vettore di consegna corretto deve essere non immunogenico, efficiente e stabile ....
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Protocollo
Tutte le procedure sugli animali qui descritte sono state approvate dalla Icahn School of Medicine del Comitato per la cura e l'uso istituzionale del Monte Sinai.
1. Sintesi di modRNA
NOTA: I dettagli della sintesi di modRNA sono disponibili in Kondrat etal.
- Ordinare i modelli di plasmide (Tabella dei materiali) e generare un prodotto PCR pulito da utilizzare come modello mRNA.
- Preparare i modRNA per trascrizione in vitro con una miscela personalizzata di ribonucleoside dei seguenti (Tabella dei materiali): kit di trascrizione T7, 6 mM ....
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Risultati
I topi da otto a dieci settimane sono stati anestesizzati con isoflurane e intubati. Dopo che l'animale era sotto anestesia, la regione toracica sinistra è stata rasata e sterilizzata con etanolo, e il cuore è stato esposto per la legatura LAD. L'arteria coronaria sinistra è stata occlusa annoccando saldamente la sutura sotto l'arteria (rappresentazione diagramma Figura 1A). Dopo un infarto di successo (indicato dall'accoglimento della parete libera ventricolare sinistra), un'iniezione diret.......
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Discussione
La terapia genica ha mostrato un enorme potenziale per far progredire significativamente il trattamento delle malattie cardiache. Tuttavia, gli strumenti tradizionali impiegati negli studi clinici iniziali per il trattamento di HF hanno dimostrato un successo limitato e sono associati a gravi effetti collaterali. L'RNA modificato presenta una distribuzione di geni non virali che sta guadagnando continuamente popolarità come strumento di trasferimento genico nel cuore. ModRNA non richiede alcuna localizzazione nucleare de.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori riconoscono Ann Anu Kurian per il suo aiuto con questo manoscritto. Questo lavoro è stato finanziato da una borsa di studio di cardiologia assegnata al laboratorio di zangi e anche dalla sovvenzione NIH R01 HL142768-01
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Adenosina trifosfato | Invitrogen | AMB13345 | Incluso nel kit Megascript |
| Antarctic Phosphatase | New England Biolabs | M0289L | |
| Analogo del cappuccio anti-inversione, 30-O-Mem7G(50) ppp(50)G | TriLink Biotechnologies | N-7003 | |
| Sistema di imaging a bioluminescenza | Perkin Elmer | 124262 | IVIS100 sistema di imaging per dispositivi ad accoppiamento di carica |
| Divaricatori contundenti | FST | 18200-09 | |
| Tropina cardiaca I | Abcam | 47003 | |
| Citidina trifosfato | Invitrogen | AMB13345 | Incluso nel kit Megascript |
| Doppio sistema di anestesia | Harvard Apparatus | 75-2001 | |
| Forcipe - Adson | FST | 91106-12 | |
| Forcipe - Dumont #7 | FST | 91197-00 | |
| Guanosina trifosfato | Invitrogen | AMB13345 | Incluso nel kit Megascript |
| Kit di trascrizione in vitro | Invitrogen | AMB13345 | Kit 5X MEGAscript T7 |
| Cannula per intubazione | Apparecchio Harvard Kit | ||
| Megaclear Life | Technologies | ||
| Ventilatore per topi | Apparecchio Harvard | 73-4279 | |
| N1-metilpseudouridina-5-trifosfato | TriLink Biotechnologies | N-1081 | |
| Spettrometro NanoDrop | Thermo Scientific | ||
| Olsen porta aghi hegar con forbici da sutura | FST | 12002-12 | |
| Modelli di plasmidi | GeneArt, Thermo Fisher Scientific | ||
| Forbici da dissezione a punta affilata | FST | 14200-12 | |
| Stereomicroscopio | Zeiss | ||
| Sutures | Ethicon | Y433H | 5.00 |
| Suture | Ethicon | Y432H | 6.00 |
| Suture | Ethicon | 7733G | 7.00 |
| T7 Enzima DNasi | Invitrogen | AMB13345 | Incluso nel kit Megascript |
| Stazione a nastro | Aligent | 4200 | |
| Kit di pulizia della trascrizione | Invitrogen | AM1908 | Megaclear |
| Ultra-4 filtri centrifughi 10k | Amicon UFC801096 |
Riferimenti
- Muruve, D. A. The innate immune response to adenovirus vectors. Human Gene Therapy. 15 (12), 1157-1166 (2004).
- Donsante, A., et al. Observed incidence of tumorigenesis in long-term rodent studies of rAAV vectors. Gene Therapy. 8 (17), 1343-1346 ....
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Ristampe e permessi
