Consegna di mRNA modificato in un modello di topo di infarto miocardico

Summary

Questo protocollo presenta un modo semplice e coerente per eseguire l'upregolazione transitoria di un gene di interesse usando modRNA dopo l'infarto miocardico nei topi.

Abstract

L'infarto miocardico (MI) è una delle principali cause di morbilità e mortalità nel mondo occidentale. Nell'ultimo decennio, la terapia genica è diventata un'opzione di trattamento promettente per le malattie cardiache, grazie alla sua efficienza e agli eccezionali effetti terapeutici. Nel tentativo di riparare il tessuto danneggiato post-MI, vari studi hanno impiegato la terapia genica virale o basata sul DNA, ma hanno affrontato notevoli ostacoli a causa della scarsa e incontrollata espressione dei geni consegnati, dell'edema, dell'aritmia e dell'ipertrofia cardiaca. L'mRNA modificato sintetico (modRNA) presenta un nuovo approccio alla terapia genica che offre un'elevata, transitoria, sicura, non immunogenica e controllata e controllata esodaal tessuto cardiaco senza alcun rischio di integrazione genomica. Grazie a queste notevoli caratteristiche combinate con la sua farmacocinetica a forma di campana nel cuore, il modRNA è diventato un approccio attraente per il trattamento delle malattie cardiache. Tuttavia, per aumentare la sua efficacia in vivo, è necessario seguire un metodo di consegna coerente e affidabile. Quindi, per massimizzare l'efficienza di consegna del modRNA e la coerenza di rendimento nell'uso di modRNA per applicazioni in vivo, viene presentato un metodo ottimizzato di preparazione e somministrazione dell'iniezione intracardiaca del modRNA in un modello MI del mouse. Questo protocollo renderà la consegna di modRNA più accessibile per la ricerca di base e traslazionale.

Introduction

La terapia genica è un potente strumento che coinvolge la consegna di acidi nucleici per il trattamento, la cura o la prevenzione delle malattie umane. Nonostante i progressi compiuti negli approcci diagnostici e terapeutici per le malattie cardiache, c'è stato un successo limitato nella fornitura di geni nell'infarto miocardico (MI) e nell'insufficienza cardiaca (HF). Per quanto semplice sembri il processo di terapia genica, si tratta di un approccio marcatamente complesso considerando i molti fattori che devono essere ottimizzati prima di impiegare un particolare veicolo di consegna. Il vettore di consegna corretto deve essere non immunogenico, efficiente e stabile ....

Protocol

Tutte le procedure sugli animali qui descritte sono state approvate dalla Icahn School of Medicine del Comitato per la cura e l'uso istituzionale del Monte Sinai.

1. Sintesi di modRNA

NOTA: I dettagli della sintesi di modRNA sono disponibili in Kondrat et^al.

1. Ordinare i modelli di plasmide (Tabella dei materiali) e generare un prodotto PCR pulito da utilizzare come modello mRNA.
2. Preparare i modRNA per trascrizione in vitro con una miscela personalizzata di ribonucleoside dei seguenti (Tabella dei materiali): kit di trascrizione T7, 6 mM ....

Results

I topi da otto a dieci settimane sono stati anestesizzati con isoflurane e intubati. Dopo che l'animale era sotto anestesia, la regione toracica sinistra è stata rasata e sterilizzata con etanolo, e il cuore è stato esposto per la legatura LAD. L'arteria coronaria sinistra è stata occlusa annoccando saldamente la sutura sotto l'arteria (rappresentazione diagramma Figura 1A). Dopo un infarto di successo (indicato dall'accoglimento della parete libera ventricolare sinistra), un'iniezione diret.......

Discussion

La terapia genica ha mostrato un enorme potenziale per far progredire significativamente il trattamento delle malattie cardiache. Tuttavia, gli strumenti tradizionali impiegati negli studi clinici iniziali per il trattamento di HF hanno dimostrato un successo limitato e sono associati a gravi effetti collaterali. L'RNA modificato presenta una distribuzione di geni non virali che sta guadagnando continuamente popolarità come strumento di trasferimento genico nel cuore. ModRNA non richiede alcuna localizzazione nucleare de.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosina trifosfato	Invitrogen	AMB13345	Incluso nel kit Megascript
Antarctic Phosphatase	New England Biolabs	M0289L
Analogo del cappuccio anti-inversione, 30-O-Mem7G(50) ppp(50)G	TriLink Biotechnologies	N-7003
Sistema di imaging a bioluminescenza	Perkin Elmer	124262	IVIS100 sistema di imaging per dispositivi ad accoppiamento di carica
Divaricatori contundenti	FST	18200-09
Tropina cardiaca I	Abcam	47003
Citidina trifosfato	Invitrogen	AMB13345	Incluso nel kit Megascript
Doppio sistema di anestesia	Harvard Apparatus	75-2001
Forcipe - Adson	FST	91106-12
Forcipe - Dumont #7	FST	91197-00
Guanosina trifosfato	Invitrogen	AMB13345	Incluso nel kit Megascript
Kit di trascrizione in vitro	Invitrogen	AMB13345	Kit 5X MEGAscript T7
Cannula per intubazione	Apparecchio Harvard Kit
Megaclear Life	Technologies
Ventilatore per topi	Apparecchio Harvard	73-4279
N1-metilpseudouridina-5-trifosfato	TriLink Biotechnologies	N-1081
Spettrometro NanoDrop	Thermo Scientific
Olsen porta aghi hegar con forbici da sutura	FST	12002-12
Modelli di plasmidi	GeneArt, Thermo Fisher Scientific
Forbici da dissezione a punta affilata	FST	14200-12
Stereomicroscopio	Zeiss
Sutures	Ethicon	Y433H	5.00
Suture	Ethicon	Y432H	6.00
Suture	Ethicon	7733G	7.00
T7 Enzima DNasi	Invitrogen	AMB13345	Incluso nel kit Megascript
Stazione a nastro	Aligent	4200
Kit di pulizia della trascrizione	Invitrogen	AM1908	Megaclear
Ultra-4 filtri centrifughi 10k		Amicon UFC801096