Consegna di mRNA modificato in un modello di topo di infarto miocardico

Sommario

Questo protocollo presenta un modo semplice e coerente per eseguire l'upregolazione transitoria di un gene di interesse usando modRNA dopo l'infarto miocardico nei topi.

Abstract

L'infarto miocardico (MI) è una delle principali cause di morbilità e mortalità nel mondo occidentale. Nell'ultimo decennio, la terapia genica è diventata un'opzione di trattamento promettente per le malattie cardiache, grazie alla sua efficienza e agli eccezionali effetti terapeutici. Nel tentativo di riparare il tessuto danneggiato post-MI, vari studi hanno impiegato la terapia genica virale o basata sul DNA, ma hanno affrontato notevoli ostacoli a causa della scarsa e incontrollata espressione dei geni consegnati, dell'edema, dell'aritmia e dell'ipertrofia cardiaca. L'mRNA modificato sintetico (modRNA) presenta un nuovo approccio alla terapia genica che offre un'elevata, transitoria, sicura, non immunogenica e controllata e controllata esodaal tessuto cardiaco senza alcun rischio di integrazione genomica. Grazie a queste notevoli caratteristiche combinate con la sua farmacocinetica a forma di campana nel cuore, il modRNA è diventato un approccio attraente per il trattamento delle malattie cardiache. Tuttavia, per aumentare la sua efficacia in vivo, è necessario seguire un metodo di consegna coerente e affidabile. Quindi, per massimizzare l'efficienza di consegna del modRNA e la coerenza di rendimento nell'uso di modRNA per applicazioni in vivo, viene presentato un metodo ottimizzato di preparazione e somministrazione dell'iniezione intracardiaca del modRNA in un modello MI del mouse. Questo protocollo renderà la consegna di modRNA più accessibile per la ricerca di base e traslazionale.

Introduzione

La terapia genica è un potente strumento che coinvolge la consegna di acidi nucleici per il trattamento, la cura o la prevenzione delle malattie umane. Nonostante i progressi compiuti negli approcci diagnostici e terapeutici per le malattie cardiache, c'è stato un successo limitato nella fornitura di geni nell'infarto miocardico (MI) e nell'insufficienza cardiaca (HF). Per quanto semplice sembri il processo di terapia genica, si tratta di un approccio marcatamente complesso considerando i molti fattori che devono essere ottimizzati prima di impiegare un particolare veicolo di consegna. Il vettore di consegna corretto deve essere non immunogenico, efficiente e stabile all'interno del corpo umano. Gli sforzi in questo campo hanno generato due tipi di sistemi di consegna: virali o non virali. I sistemi virali ampiamente utilizzati, tra cui il trasferimento genico mediante adenovirus, retrovirus, lentivirus o virus adeno-associato, hanno dimostrato un'eccezionale capacità di trasduzione. Tuttavia, il loro uso nelle cliniche è limitato a causa della forte risposta immunitaria indotta¹, rischio di tumorigenesi², o la presenza di anticorpi neutralizzanti³, che rimangono tutti un grande ostacolo all'applicazione ampia ed efficace di vettori virali nella terapia genica umana. D'altra parte, nonostante il loro impressionante modello di espressione, la consegna di DNA plasmide nudo mostra una bassa efficienza di trasfezione, mentre il trasferimento di mRNA presenta un'elevata immunogenicità e suscettibilità alla degradazione da parte di RNase⁴.

Con la vasta ricerca nel campo dell'mRNA, modRNA è diventato uno strumento attraente per la consegna di geni al cuore e vari altri organi a causa dei suoi numerosi vantaggi rispetto ai vettori tradizionali⁵. La sostituzione completa dell'uridina con pseudouridina naturale si traduce in un'espressione proteica più robusta e transitoria, con minima induzione di risposta immunitaria innata e rischio di integrazione genomica⁶. I protocolli stabiliti di recente utilizzano una quantità ottimizzata di analogico anti-tap-tap inganompio (ARCA) che migliora ulteriormente la traduzione delle proteine aumentando la stabilità e la transabilità del mRNA sintetico⁷.

Rapporti precedenti hanno dimostrato l'espressione di vari reporter o geni funzionali forniti da modRNA nel miocardio del roditore dopo l'MI. Con le applicazioni modRNA, aree significative del miocardio, tra cui cardiomiociti e non cardiomiociti, sono stati trasettati con successo lesioni post-cardiache⁸ per indurre l'angiogenesi^9,10, la sopravvivenza delle cellule cardiache¹¹, e la proliferazione cardiomiocite¹². Una singola somministrazione di modRNA codificato per follistatina umana mutata 1 induce la proliferazione di TRI adulti topo e aumenta significativamente la funzione cardiaca, diminuisce la dimensione della cicatrice e aumenta la densità capillare 4 settimane dopo-MI¹². Uno studio più recente ha riferito una migliore funzione cardiaca dopo l'MI con l'applicazione del modRNA VEGFA in un modello suina¹⁰.

Così, con la maggiore popolarità del modRNA in campo cardiaco, è essenziale sviluppare e ottimizzare un protocollo per la consegna di modRNA al cuore post-MI. Herein è un protocollo che descrive la preparazione e la consegna di modRNA purificato e ottimizzato in una formulazione citrate-salina biocompatibile che fornisce una robusta e stabile espressione proteica senza stimolare alcuna risposta immunitaria. Il metodo mostrato in questo protocollo e video dimostra la procedura chirurgica standard di un MI del mouse mediante legatura permanente dell'arteria discendente anteriore sinistra (LAD), seguita da tre iniezioni intracardiache del sito di modRNA. L'obiettivo di questo documento è definire chiaramente un metodo altamente accurato e riproducibile di consegna del modRNA al miocardio murino per rendere l'applicazione del modRNA ampiamente accessibile per la terapia genica cardiaca.

Protocollo

Tutte le procedure sugli animali qui descritte sono state approvate dalla Icahn School of Medicine del Comitato per la cura e l'uso istituzionale del Monte Sinai.

1. Sintesi di modRNA

NOTA: I dettagli della sintesi di modRNA sono disponibili in Kondrat et^al.

1. Ordinare i modelli di plasmide (Tabella dei materiali) e generare un prodotto PCR pulito da utilizzare come modello mRNA.
2. Preparare i modRNA per trascrizione in vitro con una miscela personalizzata di ribonucleoside dei seguenti (Tabella dei materiali): kit di trascrizione T7, 6 mM anti-reverse cap analogico (ARCA) 30-O-Me-m7G(50) ppp(50)G, 75 mM guanosine trhosphate, 75 mM adenosina trefosfato, 75 mM citidine triposfato, 100 mM pseudouridina-5-trefosfati, e T7 DNas.
3. Purificare il modRNA realizzato nel passaggio 1.2 con un kit di pulizia della trascrizione (Table of Materials) e trattarlo con fosfofofasi antartico. Quindi, ripurificare il modRNA con il kit di pulizia della trascrizione e quantificarlo utilizzando uno spettrofotometro.
4. Precipitare il modRNA con etanolo e acetato di ammonio e risospendere in 10 mM Tris-HCl e 1 mM EDTA.
5. Concentrare il modRNA per la consegna in vivo da filtri centrifughi e misurare la qualità utilizzando una piattaforma di elettroforesi automatizzata (Tabella dei materiali).

2. Preparazione dell'iniezione di modRNA per la somministrazione in vivo

1. Calcolare il volume necessario per 100 g di luciferasi (Luc)/Cre modRNA injection in base alla concentrazione di modRNA.
2. Mescolare il volume calcolato del modRNA con parti uguali della soluzione di saccarosio preparate in acqua priva di nuclea (0,3 g/mL) e soluzione di citrato di 0,1 m (pH - 7) (20 - ciascuno consigliato).
3. Portare il volume finale dell'iniezione a 60 gradi l aggiungendo una soluzione salina.

3. Chirurgia infarto miocardico

1. Anestesia e preparazione dell'animale
   NOTA: Questo studio utilizza topi CFW maschi e femmine di 8-12 settimane di età.
   1. Anestesizzare il topo con 2% isoflurane utilizzando una camera di induzione e posizionare l'animale sulla schiena in una posizione dorsale con una maschera facciale sopra il naso e la bocca per mantenere l'anestesia. Mantenere l'anestesia con ventilazione meccanica utilizzando un respiratore dotato di un tubo delle vie aeree da 7,8 mm e un filtro.
   2. Per immobilizzare il mouse sulla piattaforma chirurgica, fissare gli arti con nastro chirurgico. radere la zona del collo e il lato sinistro della gabbia toracica e disinfettare con il 70% di etanolo e iodio povidone. Ripetere la fase di disinfezione due volte. Controllare i suoi riflessi, pizzicando la coda e piedi posteriori per valutare la profondità dell'anestesia.
   3. Monitorare e mantenere continuamente la temperatura corporea del corpo a normothermia (37,5,38 gradi centigradi).
   4. Mantenere una via respiratoria aperta eseguendo intubazione intratracheale. Per fare questo, posizionare il mouse in una posizione ventrale con la bocca rivolta verso lo sperimentatore e tirare delicatamente fuori la lingua. Regolare l'angolo del collo e raddrizzare il percorso di intubazione e spingere nella cannula di intubazione.
   5. Nel caso in cui l'animale non sia in grado di respirare attraverso di esso, la tracheostomia può essere eseguita. Eseguire un'incisione cervicale lungo la linea mediana isolando la pelle, il muscolo e il tessuto delineando la trachea utilizzando un microscopio. Quando la trachea è chiaramente visibile, inserire il tubo endotracheale nel tessuto tra due anelli di cartuccia sotto la glottide facendo un piccolo foro e tenendo la parte cranica della trachea utilizzando pinze microchirurgiche.
   6. Osservare il movimento toracico del topo per verificare che entrambi i polmoni ricevano ossigeno. La frequenza respiratoria (RR) dovrebbe essere di circa 120 respiri al minuto, con una pressione inspirata di 17-18 cm H₂O.
2. Legatura arteria discendente anteriore sinistra (LAD)
   1. Per eseguire la legatura LAD, ruotare il mouse con attenzione in modo che sia sdraiato sul suo lato destro. Sollevare la pelle ed eseguire una toracotomia sul lato sinistro tra la terza e la quarta costola e sezionare attentamente il tessuto e il muscolo. Usare un cauterio per prevenire il sanguinamento.
   2. Aprire il torace con attenzione e una volta aperto, trovare il cuore, senza toccare il polmone con qualsiasi oggetto tagliente. Posizionare i retrattori nell'incisione per mantenere aperta la cavità toracica e avere una visione chiara del cuore. Ora spostare i polmoni sul bordo dell'incisione e rimuovere la parte del sacco pericardico che copre il cuore per accedere alla superficie anteriore del cuore.
   3. Identificare attentamente il LAD, che può essere visto come un vaso rosso chiaro profondo situato tra l'arteria polmonare e il auricolo sinistro. Ligate il procuratore di laS prossimale con una sola sutura di una sutura di seta 7-0. Mettere un tubo toracico (28 G, catetere venale), tra la quarta e la 5a costola.
   4. Chiudere l'incisione toracica negli strati. Utilizzare le suture da corsa in seta 6-0 per adattare le costole e utilizzare suture di corsa in seta 5-0 per chiudere la pelle. Assicurarsi di lasciare una finestra adeguata per la misurazione ecocardiografica futura.
   5. Scolare con cura il torace con soluzione isotonica calda (9 g di cloruro di sodio in 1 L di acqua) utilizzando una siringa da 2 mL. Posizionare il mouse sulla schiena. Se si esegue la tracheostomia, estrarre il tubo endotracheale e utilizzare suture di seta 7-0 adattare gli anelli delle cartucce tracheali con un solo punto. Posizionare la maschera del viso sul mouse e chiudere la pelle utilizzando suture in seta 5-0.
   6. Per la fase di recupero, scollegare la cannula di intubazione dal ventilatore e consentire la respirazione spontanea. Posizionare l'animale sotto una lampada termica fino a raggiungere la coscienza. Non lasciare l'animale incustodito dopo l'intervento chirurgico fino a quando non è completamente sveglio.
   7. Gestire la terapia del dolore con buprenophine a 0,1 mg/kg di peso corporeo, iniettato sottocutaneamente per i prossimi 3 giorni a intervalli di 12 h.

4. Consegna cardiaca di modRNA

1. Fornire un totale di 60 l del modRNA preparato al passo 2.3 intramuscolare (IM) utilizzando una siringa di insulina (31 G) dopo un MI.
   1. Iniettare 20 l del modRNA in tre diversi siti del muscolo cardiaco che circondano l'area infarto (due su entrambi i lati della legatura e uno nell'apice). Eseguire le iniezioni immediatamente dopo il LAD, prima di chiudere il torace.
      NOTA: Immagini rappresentative di siti di iniezione di modRNA possono essere visualizzate nella figura 1.

5. Convalida dell'espressione proteica nel cuore post MI

1. Espressione modRNA Luciferase utilizzando un sistema di imaging a bioluminescenza
   NOTA: Un totale di 100 g di Luc mRNA preparato in 60 -L del tampone di citrati di saccarosio viene iniettato direttamente nel cuore dei topi CFW dopo l'MI.
   1. A 24 h dopo l'iniezione di MI e modRNA, anestesizzare i topi con 2% isoflurane utilizzando una camera di induzione e intraperitialmente iniettare luciferina (150 mg/g peso corporeo) per convalidare il segnale Luc in vivo.
   2. Immagina i topi usando un sistema di imaging a bioluminescenza ogni 2 min fino a quando il segnale Luc non raggiunge la saturazione.
   3. Quantifica i dati di imaging raccolti con il software di analisi delle immagini. Utilizzare i topi iniettati con salina solo come lettura di base per l'espressione Luc e sottrarre il segnale di fondo raccolto dai topi iniettati dalla salina.
      NOTA: il segnale Luc è espresso in p/s/cm²/sr x 10⁶.
2. Immunostaining per la convalida della trasfezione del Cre
   1. Per convalidare la trasfezione con Cre, sacrificare gli animali 24 h postiniezione utilizzando un'iniezione intraperitoneale di 100 mg/kg di ketamina e 10 mg/kg di xilola seguita da lussazione cervicale. Prima di fare un'incisione, disinfettare il torace e l'addome utilizzando un tampone alcolico del 70%.
   2. Aprire la cavità toracica facendo un'incisione trasversale di 1 cm più bassa dello sterno e spostare le forbici verso la testa, tagliando attraverso la gabbia toracica.
   3. Aprire il torace e iniettare 1 mL di PBS sterile nella camera ventricolare destra per rimuovere il sangue in eccesso. Asciso il cuore immediatamente e metterlo nel PBS sterile per lavare via il sangue rimanente.
   4. Fissare il cuore in 4% paraformaldeide (PFA) per 24 h, seguito da incubazione notturna in soluzione 30% di saccarosio a 4 gradi centigradi. Il giorno seguente incorporare i cuori in mezzo di temperatura di taglio ottimale e seziono ad uno spessore di 10 m utilizzando un criostato.
   5. Macchia le sezioni con anticorpo primario contro la troponina cardiaca I (cTNI) ed etichettale con un anticorpo secondario fluorescente. Per identificare il nucleo, macchia con 4',6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) per 5 min. Immagine dei vetrini utilizzando un microscopio fluorescente.

6. Analisi statistica

1. Tracciare un grafico a barre in base all'espressione luc in mouse salini e con iniettatura di Luc e riportare i valori come media : SEM. Confrontare i due gruppi utilizzando un test a t non accoppiato ().

Risultati

I topi da otto a dieci settimane sono stati anestesizzati con isoflurane e intubati. Dopo che l'animale era sotto anestesia, la regione toracica sinistra è stata rasata e sterilizzata con etanolo, e il cuore è stato esposto per la legatura LAD. L'arteria coronaria sinistra è stata occlusa annoccando saldamente la sutura sotto l'arteria (rappresentazione diagramma Figura 1A). Dopo un infarto di successo (indicato dall'accoglimento della parete libera ventricolare sinistra), un'iniezione diret...

Discussione

La terapia genica ha mostrato un enorme potenziale per far progredire significativamente il trattamento delle malattie cardiache. Tuttavia, gli strumenti tradizionali impiegati negli studi clinici iniziali per il trattamento di HF hanno dimostrato un successo limitato e sono associati a gravi effetti collaterali. L'RNA modificato presenta una distribuzione di geni non virali che sta guadagnando continuamente popolarità come strumento di trasferimento genico nel cuore. ModRNA non richiede alcuna localizzazione nucleare de...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Adenosina trifosfato	Invitrogen	AMB13345	Incluso nel kit Megascript
Antarctic Phosphatase	New England Biolabs	M0289L
Analogo del cappuccio anti-inversione, 30-O-Mem7G(50) ppp(50)G	TriLink Biotechnologies	N-7003
Sistema di imaging a bioluminescenza	Perkin Elmer	124262	IVIS100 sistema di imaging per dispositivi ad accoppiamento di carica
Divaricatori contundenti	FST	18200-09
Tropina cardiaca I	Abcam	47003
Citidina trifosfato	Invitrogen	AMB13345	Incluso nel kit Megascript
Doppio sistema di anestesia	Harvard Apparatus	75-2001
Forcipe - Adson	FST	91106-12
Forcipe - Dumont #7	FST	91197-00
Guanosina trifosfato	Invitrogen	AMB13345	Incluso nel kit Megascript
Kit di trascrizione in vitro	Invitrogen	AMB13345	Kit 5X MEGAscript T7
Cannula per intubazione	Apparecchio Harvard Kit
Megaclear Life	Technologies
Ventilatore per topi	Apparecchio Harvard	73-4279
N1-metilpseudouridina-5-trifosfato	TriLink Biotechnologies	N-1081
Spettrometro NanoDrop	Thermo Scientific
Olsen porta aghi hegar con forbici da sutura	FST	12002-12
Modelli di plasmidi	GeneArt, Thermo Fisher Scientific
Forbici da dissezione a punta affilata	FST	14200-12
Stereomicroscopio	Zeiss
Sutures	Ethicon	Y433H	5.00
Suture	Ethicon	Y432H	6.00
Suture	Ethicon	7733G	7.00
T7 Enzima DNasi	Invitrogen	AMB13345	Incluso nel kit Megascript
Stazione a nastro	Aligent	4200
Kit di pulizia della trascrizione	Invitrogen	AM1908	Megaclear
Ultra-4 filtri centrifughi 10k		Amicon UFC801096