Consegna di mRNA modificato in un modello di topo di infarto miocardico

La terapia genica è un potente strumento che coinvolge la consegna di acidi nucleici per il trattamento, la cura o la prevenzione delle malattie umane. Nonostante i progressi compiuti negli approcci diagnostici e terapeutici per le malattie cardiache, c'è stato un successo limitato nella fornitura di geni nell'infarto miocardico (MI) e nell'insufficienza cardiaca (HF). Per quanto semplice sembri il processo di terapia genica, si tratta di un approccio marcatamente complesso considerando i molti fattori che devono essere ottimizzati prima di impiegare un particolare veicolo di consegna. Il vettore di consegna corretto deve essere non immunogenico, efficiente e stabile all'interno del corpo umano. Gli sforzi in questo campo hanno generato due tipi di sistemi di consegna: virali o non virali. I sistemi virali ampiamente utilizzati, tra cui il trasferimento genico mediante adenovirus, retrovirus, lentivirus o virus adeno-associato, hanno dimostrato un'eccezionale capacità di trasduzione. Tuttavia, il loro uso nelle cliniche è limitato a causa della forte risposta immunitaria indotta¹, rischio di tumorigenesi², o la presenza di anticorpi neutralizzanti³, che rimangono tutti un grande ostacolo all'applicazione ampia ed efficace di vettori virali nella terapia genica umana. D'altra parte, nonostante il loro impressionante modello di espressione, la consegna di DNA plasmide nudo mostra una bassa efficienza di trasfezione, mentre il trasferimento di mRNA presenta un'elevata immunogenicità e suscettibilità alla degradazione da parte di RNase⁴.

Con la vasta ricerca nel campo dell'mRNA, modRNA è diventato uno strumento attraente per la consegna di geni al cuore e vari altri organi a causa dei suoi numerosi vantaggi rispetto ai vettori tradizionali⁵. La sostituzione completa dell'uridina con pseudouridina naturale si traduce in un'espressione proteica più robusta e transitoria, con minima induzione di risposta immunitaria innata e rischio di integrazione genomica⁶. I protocolli stabiliti di recente utilizzano una quantità ottimizzata di analogico anti-tap-tap inganompio (ARCA) che migliora ulteriormente la traduzione delle proteine aumentando la stabilità e la transabilità del mRNA sintetico⁷.

Rapporti precedenti hanno dimostrato l'espressione di vari reporter o geni funzionali forniti da modRNA nel miocardio del roditore dopo l'MI. Con le applicazioni modRNA, aree significative del miocardio, tra cui cardiomiociti e non cardiomiociti, sono stati trasettati con successo lesioni post-cardiache⁸ per indurre l'angiogenesi^9,10, la sopravvivenza delle cellule cardiache¹¹, e la proliferazione cardiomiocite¹². Una singola somministrazione di modRNA codificato per follistatina umana mutata 1 induce la proliferazione di TRI adulti topo e aumenta significativamente la funzione cardiaca, diminuisce la dimensione della cicatrice e aumenta la densità capillare 4 settimane dopo-MI¹². Uno studio più recente ha riferito una migliore funzione cardiaca dopo l'MI con l'applicazione del modRNA VEGFA in un modello suina¹⁰.

Così, con la maggiore popolarità del modRNA in campo cardiaco, è essenziale sviluppare e ottimizzare un protocollo per la consegna di modRNA al cuore post-MI. Herein è un protocollo che descrive la preparazione e la consegna di modRNA purificato e ottimizzato in una formulazione citrate-salina biocompatibile che fornisce una robusta e stabile espressione proteica senza stimolare alcuna risposta immunitaria. Il metodo mostrato in questo protocollo e video dimostra la procedura chirurgica standard di un MI del mouse mediante legatura permanente dell'arteria discendente anteriore sinistra (LAD), seguita da tre iniezioni intracardiache del sito di modRNA. L'obiettivo di questo documento è definire chiaramente un metodo altamente accurato e riproducibile di consegna del modRNA al miocardio murino per rendere l'applicazione del modRNA ampiamente accessibile per la terapia genica cardiaca.

Tutte le procedure sugli animali qui descritte sono state approvate dalla Icahn School of Medicine del Comitato per la cura e l'uso istituzionale del Monte Sinai.

1. Sintesi di modRNA

NOTA: I dettagli della sintesi di modRNA sono disponibili in Kondrat et^al.

1. Ordinare i modelli di plasmide (Tabella dei materiali) e generare un prodotto PCR pulito da utilizzare come modello mRNA.
2. Preparare i modRNA per trascrizione in vitro con una miscela personalizzata di ribonucleoside dei seguenti (Tabella dei materiali): kit di trascrizione T7, 6 mM anti-reverse cap analogico (ARCA) 30-O-Me-m7G(50) ppp(50)G, 75 mM guanosine trhosphate, 75 mM adenosina trefosfato, 75 mM citidine triposfato, 100 mM pseudouridina-5-trefosfati, e T7 DNas.
3. Purificare il modRNA realizzato nel passaggio 1.2 con un kit di pulizia della trascrizione (Table of Materials) e trattarlo con fosfofofasi antartico. Quindi, ripurificare il modRNA con il kit di pulizia della trascrizione e quantificarlo utilizzando uno spettrofotometro.
4. Precipitare il modRNA con etanolo e acetato di ammonio e risospendere in 10 mM Tris-HCl e 1 mM EDTA.
5. Concentrare il modRNA per la consegna in vivo da filtri centrifughi e misurare la qualità utilizzando una piattaforma di elettroforesi automatizzata (Tabella dei materiali).

2. Preparazione dell'iniezione di modRNA per la somministrazione in vivo

1. Calcolare il volume necessario per 100 g di luciferasi (Luc)/Cre modRNA injection in base alla concentrazione di modRNA.
2. Mescolare il volume calcolato del modRNA con parti uguali della soluzione di saccarosio preparate in acqua priva di nuclea (0,3 g/mL) e soluzione di citrato di 0,1 m (pH - 7) (20 - ciascuno consigliato).
3. Portare il volume finale dell'iniezione a 60 gradi l aggiungendo una soluzione salina.

3. Chirurgia infarto miocardico

1. Anestesia e preparazione dell'animale
   NOTA: Questo studio utilizza topi CFW maschi e femmine di 8-12 settimane di età.
   1. Anestesizzare il topo con 2% isoflurane utilizzando una camera di induzione e posizionare l'animale sulla schiena in una posizione dorsale con una maschera facciale sopra il naso e la bocca per mantenere l'anestesia. Mantenere l'anestesia con ventilazione meccanica utilizzando un respiratore dotato di un tubo delle vie aeree da 7,8 mm e un filtro.
   2. Per immobilizzare il mouse sulla piattaforma chirurgica, fissare gli arti con nastro chirurgico. radere la zona del collo e il lato sinistro della gabbia toracica e disinfettare con il 70% di etanolo e iodio povidone. Ripetere la fase di disinfezione due volte. Controllare i suoi riflessi, pizzicando la coda e piedi posteriori per valutare la profondità dell'anestesia.
   3. Monitorare e mantenere continuamente la temperatura corporea del corpo a normothermia (37,5,38 gradi centigradi).
   4. Mantenere una via respiratoria aperta eseguendo intubazione intratracheale. Per fare questo, posizionare il mouse in una posizione ventrale con la bocca rivolta verso lo sperimentatore e tirare delicatamente fuori la lingua. Regolare l'angolo del collo e raddrizzare il percorso di intubazione e spingere nella cannula di intubazione.
   5. Nel caso in cui l'animale non sia in grado di respirare attraverso di esso, la tracheostomia può essere eseguita. Eseguire un'incisione cervicale lungo la linea mediana isolando la pelle, il muscolo e il tessuto delineando la trachea utilizzando un microscopio. Quando la trachea è chiaramente visibile, inserire il tubo endotracheale nel tessuto tra due anelli di cartuccia sotto la glottide facendo un piccolo foro e tenendo la parte cranica della trachea utilizzando pinze microchirurgiche.
   6. Osservare il movimento toracico del topo per verificare che entrambi i polmoni ricevano ossigeno. La frequenza respiratoria (RR) dovrebbe essere di circa 120 respiri al minuto, con una pressione inspirata di 17-18 cm H₂O.
2. Legatura arteria discendente anteriore sinistra (LAD)
   1. Per eseguire la legatura LAD, ruotare il mouse con attenzione in modo che sia sdraiato sul suo lato destro. Sollevare la pelle ed eseguire una toracotomia sul lato sinistro tra la terza e la quarta costola e sezionare attentamente il tessuto e il muscolo. Usare un cauterio per prevenire il sanguinamento.
   2. Aprire il torace con attenzione e una volta aperto, trovare il cuore, senza toccare il polmone con qualsiasi oggetto tagliente. Posizionare i retrattori nell'incisione per mantenere aperta la cavità toracica e avere una visione chiara del cuore. Ora spostare i polmoni sul bordo dell'incisione e rimuovere la parte del sacco pericardico che copre il cuore per accedere alla superficie anteriore del cuore.
   3. Identificare attentamente il LAD, che può essere visto come un vaso rosso chiaro profondo situato tra l'arteria polmonare e il auricolo sinistro. Ligate il procuratore di laS prossimale con una sola sutura di una sutura di seta 7-0. Mettere un tubo toracico (28 G, catetere venale), tra la quarta e la 5a costola.
   4. Chiudere l'incisione toracica negli strati. Utilizzare le suture da corsa in seta 6-0 per adattare le costole e utilizzare suture di corsa in seta 5-0 per chiudere la pelle. Assicurarsi di lasciare una finestra adeguata per la misurazione ecocardiografica futura.
   5. Scolare con cura il torace con soluzione isotonica calda (9 g di cloruro di sodio in 1 L di acqua) utilizzando una siringa da 2 mL. Posizionare il mouse sulla schiena. Se si esegue la tracheostomia, estrarre il tubo endotracheale e utilizzare suture di seta 7-0 adattare gli anelli delle cartucce tracheali con un solo punto. Posizionare la maschera del viso sul mouse e chiudere la pelle utilizzando suture in seta 5-0.
   6. Per la fase di recupero, scollegare la cannula di intubazione dal ventilatore e consentire la respirazione spontanea. Posizionare l'animale sotto una lampada termica fino a raggiungere la coscienza. Non lasciare l'animale incustodito dopo l'intervento chirurgico fino a quando non è completamente sveglio.
   7. Gestire la terapia del dolore con buprenophine a 0,1 mg/kg di peso corporeo, iniettato sottocutaneamente per i prossimi 3 giorni a intervalli di 12 h.

4. Consegna cardiaca di modRNA

1. Fornire un totale di 60 l del modRNA preparato al passo 2.3 intramuscolare (IM) utilizzando una siringa di insulina (31 G) dopo un MI.
   1. Iniettare 20 l del modRNA in tre diversi siti del muscolo cardiaco che circondano l'area infarto (due su entrambi i lati della legatura e uno nell'apice). Eseguire le iniezioni immediatamente dopo il LAD, prima di chiudere il torace.
      NOTA: Immagini rappresentative di siti di iniezione di modRNA possono essere visualizzate nella figura 1.

5. Convalida dell'espressione proteica nel cuore post MI

1. Espressione modRNA Luciferase utilizzando un sistema di imaging a bioluminescenza
   NOTA: Un totale di 100 g di Luc mRNA preparato in 60 -L del tampone di citrati di saccarosio viene iniettato direttamente nel cuore dei topi CFW dopo l'MI.
   1. A 24 h dopo l'iniezione di MI e modRNA, anestesizzare i topi con 2% isoflurane utilizzando una camera di induzione e intraperitialmente iniettare luciferina (150 mg/g peso corporeo) per convalidare il segnale Luc in vivo.
   2. Immagina i topi usando un sistema di imaging a bioluminescenza ogni 2 min fino a quando il segnale Luc non raggiunge la saturazione.
   3. Quantifica i dati di imaging raccolti con il software di analisi delle immagini. Utilizzare i topi iniettati con salina solo come lettura di base per l'espressione Luc e sottrarre il segnale di fondo raccolto dai topi iniettati dalla salina.
      NOTA: il segnale Luc è espresso in p/s/cm²/sr x 10⁶.
2. Immunostaining per la convalida della trasfezione del Cre
   1. Per convalidare la trasfezione con Cre, sacrificare gli animali 24 h postiniezione utilizzando un'iniezione intraperitoneale di 100 mg/kg di ketamina e 10 mg/kg di xilola seguita da lussazione cervicale. Prima di fare un'incisione, disinfettare il torace e l'addome utilizzando un tampone alcolico del 70%.
   2. Aprire la cavità toracica facendo un'incisione trasversale di 1 cm più bassa dello sterno e spostare le forbici verso la testa, tagliando attraverso la gabbia toracica.
   3. Aprire il torace e iniettare 1 mL di PBS sterile nella camera ventricolare destra per rimuovere il sangue in eccesso. Asciso il cuore immediatamente e metterlo nel PBS sterile per lavare via il sangue rimanente.
   4. Fissare il cuore in 4% paraformaldeide (PFA) per 24 h, seguito da incubazione notturna in soluzione 30% di saccarosio a 4 gradi centigradi. Il giorno seguente incorporare i cuori in mezzo di temperatura di taglio ottimale e seziono ad uno spessore di 10 m utilizzando un criostato.
   5. Macchia le sezioni con anticorpo primario contro la troponina cardiaca I (cTNI) ed etichettale con un anticorpo secondario fluorescente. Per identificare il nucleo, macchia con 4',6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) per 5 min. Immagine dei vetrini utilizzando un microscopio fluorescente.

6. Analisi statistica

1. Tracciare un grafico a barre in base all'espressione luc in mouse salini e con iniettatura di Luc e riportare i valori come media : SEM. Confrontare i due gruppi utilizzando un test a t non accoppiato ().

I topi da otto a dieci settimane sono stati anestesizzati con isoflurane e intubati. Dopo che l'animale era sotto anestesia, la regione toracica sinistra è stata rasata e sterilizzata con etanolo, e il cuore è stato esposto per la legatura LAD. L'arteria coronaria sinistra è stata occlusa annoccando saldamente la sutura sotto l'arteria (rappresentazione diagramma Figura 1A). Dopo un infarto di successo (indicato dall'accoglimento della parete libera ventricolare sinistra), un'iniezione diretta di 100 g di modRNA Luc o Cre sciolto nel cuscinetto di citrato di saccarosio è stata consegnata direttamente nel miocardio in tre diversi siti (Figura 1B) che circondano l'area della lesione utilizzando una siringa di insulina. La procedura MI con iniezioni di modRNA è durata 30-45 min per animale. Gli animali hanno mostrato circa il 90% del tasso di sopravvivenza post-procedura. Dopo la procedura, il torace e la pelle sono stati saldamente suturati in strati e l'animale è stato rimosso dalla ventilazione non appena ha iniziato a respirare normalmente.

Dopo aver condotto la legatura LAD e la successiva somministrazione dell'iniezione di Luc modRNA, abbiamo convalidato la trasfezione modRNA Luc controllando l'espressione della proteina Luc 24 h post-iniezione utilizzando un sistema di imaging a bioluminescenza (Figura 2A). Abbiamo stabilito in pubblicazioni precedenti che anche se l'espressione proteica può essere visto fino al giorno 6 posttrafezione, la più alta efficienza di trasfezione di modRNA è osservata a 24 h8. Allo stesso modo, abbiamo rilevato con successo il segnale Luc nel cuore trattato con iniezione di modRNA Luc (1,76 x 108) rispetto ai topi iniettati con buffer di citrato di saccarosio dopo MI (3.0 x 105) (Figura 2B).

Inoltre, abbiamo cercato di convalidare l'espressione di modRNA controllandone la traduzione e la biodistribuzione in un mouse transgenico Rosa26mTmG. Questo sistema di modello del mouse esprime l'espressione di fluorescenza tdTomato (mT) localizzata nella membrana cellulare in tutte le cellule/tessuti del corpo e le modifiche all'espressione di fluorescenza EGFP (mG) localizzata nella membrana cellulare sulla ricombinazione Cre. Così, per osservare l'espressione del modRNA Cre, 100 g Cre modRNA è stato iniettato direttamente nel miocardio post-MI in rosa26mTmG topi maschi e femmine, e gli animali sono stati sacrificati 24 h post-chirurgia. I cuori sono stati fissati ed elaborati per l'immunostaining con marcatore cardiomiocito cTNI e marcatore nucleare DAPI (Figura 3A). Il successo dell'espressione Cre era evidente a causa della comparsa di cellule di colore verde (Figura 3B), che erano il risultato della ricombinazione con il modRNA Cre consegnato al mouse, rappresentato dal cambiamento del colore tdTomato a EGFP intorno al sito di iniezione Cre (Figura 3C).

Figura 1: legatura LAD e consegna cardiaca di modRNA. (A) Diagramma schematico che mostra l'area di legatura LAD e tre siti di iniezione di modRNA. (B) Immagini rappresentative dell'intero cuore del topo poste da un MI di successo indotto dalla legatura permanente(a) e siti di iniezione di modRNA a seguito del MI. I 100 g di modRNA disciolti in 60 gradi di cuscinetto di citrato di saccarosio sono stati consegnati nell'area della zona di confine che circonda l'infarto, due su entrambi i lati della legatura (b,c) e uno nell'apice (d). Barra della scala : 1 cm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Analisi dell'espressione Luc dopo l'iniezione di modRNA. Il cuscinetto per citrati di sucrosi contenente 100 g di modRNA Luc è stato iniettato direttamente nel miocardio dei topi CFW in un intervento chirurgico a torace aperto. Il sistema di imaging della bioluminescenza è stato utilizzato per calcolare l'espressione della proteina Luc a 24 ore dopo l'iniezione. (A) Immagini bioluminescenti comparative di topi di controllo (trasincati solo con buffer) e topi iniettati con Luc modRNA. (B) Quantificazione del segnale Luc rispetto ai topi di controllo misurati dopo 24 ore utilizzando imager a bioluminescenza. La barra di errore rappresenta SEM con p < 0.0001. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Convalida dell'espressione Cre in vivo. Immagini rappresentative di sezioni trasversali cardiache trafette (vista a asse corto) che convalidano l'espressione del modRNA Cre nel mouse Rosa26mTmG dopo 24 ore di post-iniezione. (A) I cardiomiociti immunostained con cTNI (rosso). (B) Le cellule di colore verde rappresentano le cellule trasfetate Cre. (C) Immagine unita che mostra le cellule attivate Cre intorno alle due iniezioni. Il blu è la macchia nucleare DAPI. Barra della scala : 1 cm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.