Sintesi di nanoparticelle magnetiche funzionalizzate, la loro coniugazione con la feroxamina Sideroforo e la sua valutazione per il rilevamento dei batteri

I metodi di rilevamento dei batteri utilizzando MNP si basano sul riconoscimento molecolare di anticorpi, aptamers, bioproteine, carboidrati coniugati a MNP dai batteri patogeni¹. Tenendo conto che i siderofori sono riconosciuti da recettori specifici sulla membrana esterna dei batteri, potrebbero anche essere collegati a MNP per aumentare la loro specificità². I siderofori sono piccole molecole organiche coinvolte nell'assorbimento di Fe³ dai batteri^3,,4. La preparazione di coniugati tra siderophores e MNP insieme alla loro valutazione per la cattura e l'isolamento dei batteri non è ancora stata segnalata.

Uno dei passaggi cruciali nella sintesi di coniugati di nanoparticelle magnetiche con piccole molecole è la selezione del tipo di legame o di interazione tra di loro per garantire che la piccola molecola sia attaccata alla superficie del MNP. Per questo motivo, la procedura per preparare il coniugato tra nanoparticelle magnetiche e feroxamina - il sideroforo riconosciuto da Yersinia enterocolitica- si è concentrata sulla generazione di una superficie modificabile dell'MNP per consentire il collegamento covalente al sideroforo dalla chimica del carbodicolo. Al fine di ottenere una nanoparticelle magnetite uniformi (MNP) e per migliorare la nucleazione e il controllo delle dimensioni, una reazione di solvosi con alcool benzileè è stata trasportata in un blocco termico senza agitare⁵. Poi, un rivestimento di silice è stato generato dal metodo St'ber per conferire protezione e migliorare la stabilità delle sospensioni nanoparticelle in un supporto acquoso⁶. Tenendo conto della struttura della ferosamina, l'introduzione di gruppi di ammina è necessaria per produrre nanoparticelle adatte (MNP@SiO₂@NH₂) da coniugare con il siderophore. Ciò è stato ottenuto condensando (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) con i gruppi alcolici presenti sulla superficie delle nanoparticelle modificate di silice (MNP@SiO₂₎utilizzando un metodo sol-gel⁷.

Parallelamente, il complesso di ferro di ferosamina(III) è stato preparato con la complessità della deferoxamina disponibile in commercio con acetonato di acetil di ferro in soluzione aques. N-succinylferoxamina, recante gruppi di succinyl che fungeranno da linker, è stata ottenuta dalla reazione della feroxamina con anidride succinica.

La coniugazione tra MNP@SiO₂@NH₂ e N-succinylferoxamine per dare MNP@SiO₂@NH_-Fa è stata effettuata attraverso la chimica del carbodiimide utilizzando come reagenti di accoppiamento benzotriazole-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-fosofanio esafluorofosfato (BOP) e 1-idrossibenzotriazolo (HOBt) in un supporto di base morbido per attivare il gruppo di acido terminale in N-succinylferoxamine⁸.

Una volta che gli MNP sono stati caratterizzati, abbiamo valutato le capacità delle nanoparticelle magnetiche nude e funzionaliste per catturare il tipo selvaggio (WC-A) e un mutante di Y. enterocolitica privo del recettore della feroxamina FoxA (FoxA WC-A 12-8). Gli MNP semplici, gli MNP funzionalizzati e i coniugati MNP@SiO₂@NH_-Fa sono stati autorizzati a interagire con ogni ceppo Y. enterocolitica. Gli aggregati battericoconiugi sono stati separati dalla sospensione dei batteri dall'applicazione di un campo magnetico. Gli aggregati separati sono stati sciacquati due volte con la salina tampina tamponata di fosfato (PBS), ri-sospesi in PBS per preparare le diluizioni seriali e poi, sono stati placcati per il conteggio delle coccie. Questo protocollo dimostra ogni fase della sintesi di MNP@SiO₂@NH@Fa, la caratterizzazione strutturale di tutti gli intermedi e il coniugato, e un analisi di cattura del batterio come un modo semplice per valutare la specificità del coniugato in relazione agli intermedi. 9 (in ^vie

NOTA: Per le reazioni eseguite in condizioni di atmosfera inerte, tutte le vetrerie sono state precedentemente essiccate in forno a 65 gradi centigradi, sigillate con un setto di gomma e eliminate con argon tre volte.

1. Sintesi di nanoparticelle magnetiche coniugate con feroxamina

1. Sintesi di Fe₃O₄ nanoparticelle magnetiche (MNP)
   1. Aggiungere 0,5 g di Fe (acac)₃ in una fiala di vetro da 20 mL e quindi mescolare con 10 mL di alcool benzile.
   2. Sonicare questa miscela per 2 min, quindi trasferire in un blocco di riscaldamento e riscaldare a 180 gradi centigradi per 72 h.
   3. Una volta completata la reazione, lasciare raffreddare le fiale, sciacquare le nanoparticelle con 96% etanolo e centrifugare a 4000 x g per 30 min. Ripetere la centrifuga almeno due volte.
   4. Separare le nanoparticelle dal supernatante per attrazione magnetica utilizzando un magnete neodimium (NdFeB) e scartare il solvente residuo.
   5. Risciacquare con 96% etanolo ripetendo il passo 1.1.4. e scartare il supernatante alternando alla sonicazione in un bagno per 1 min a 40 kHz fino a quando il solvente sembra chiaro.
2. Nanoparticelle magnetiche Rivestimento SiO₂ (MNP@SiO₂)
   1. Preparare una sospensione di 2 g di MNP in 80 mL di isopropanolo e quindi aggiungere 4 mL di 21% ammoniaca, 7,5 mL di acqua distillata e 0,56 mL di orthosilicate tetraetil (TEOS) (in questo ordine) in un fiascheggio inferiore rotondo con una barra di agitazione magnetica.
   2. Riscaldare il composto a 40 gradi centigradi per 2 h con agitazione continua e poi sonicare per 1 ora.
   3. Separare l'MNP con un magnete, scartare il supernatante e disperderlo in 30 mL di isopropanolo.
   4. Ripetere i passaggi 1.2.1. e 1.2.2.
   5. Rimuovere e lavare la barra magnetica di agitazione con 96% di etanolo per recuperare tutto il materiale.
   6. Separare le nanoparticelle dal supernatante per attrazione magnetica utilizzando un magnete.
   7. Scartare il supernatante e sciacquare le nanoparticelle con il 96% di etanolo tre volte alternandosi alla sonicazione.
   8. Asciugare le nanoparticelle sotto vuoto a temperatura ambiente per 12 ore.
3. Funzionalizzazione del MNP@SiO₂ con (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES)
   1. Risciacquare 500 mg del MNP@SiO₂ ottenuto dal passaggio precedente con N,N-dimethylformamide (DMF) sotto atmosfera inerte e poi sonicare per 1 min a 40 kHz. Quindi, scartare il supernatante e ripetere questo processo tre volte.
   2. Sospendere nuovamente le particelle in un flacone inferiore rotondo, sotto agitazione con una barra di stirazione magnetica e aggiungere 9 mL di APTES.
   3. Mescolare il composto a 60 gradi centigradi per 12 h.
   4. Scartare il supernatante e sciacquare le nanoparticelle con il 96% di etanolo tre volte alternandosi alla sonicazione.
4. Sintesi di feroxamina
   1. Sciogliere 100 mg (0,15 mmol) di sale di deferoxamina mesylate e 53,0 mg (0,15 mmol) di Fe(acac)₃ in 5 mL di acqua distillata e mescolare la miscela durante la notte a temperatura ambiente.
   2. Lavare il prodotto risultante tre volte con 20 mL di EtOAc in un imbuto di separazione e quindi rimuovere il solvente organico sotto vuoto utilizzando un evaporatore rotatorio.
   3. Asciugare a secco la fase acquosa per permettersi la feroxamina come solido rosso.
5. Sintesi di N-succinylferoxamine
   1. Aggiungere 350 mg (3,50 mmol) di anidride succinica a una soluzione di 100 mg (0,17 mmol) di feroxamina in 5 mL di pilride in una fiaschetta rotonda da 50 mL sotto atmosfera inerte.
   2. Mescolare la miscela risultante a temperatura ambiente per 16 h. Dopo quel tempo, rimuovere l'eccesso di piridina sotto pressione ridotta in un evaporatore rotatorio per dare un solido rosso scuro.
   3. Sciogliere il greggio di reazione in 3 mL di metanolo.
   4. Trasferire la soluzione metanolica in una colonna di Sephadex (20 cm di Sephadex in una colonna di diametro di 20 mm) ed elutare a 0,5 mL/min.
   5. Raccogliere la frazione rossa e rimuovere il metanolo sotto vuoto utilizzando un evaporatore rotatoria.
6. Sintesi del coniugato MNP@SiO₂@NH@Fa
   1. Risciacquare 30 mg di MNP@SiO secco₂@NH₂ due volte con DMF e sonicare le nanoparticelle in una fiaschetta Erlenmeyer da 100 ml per 30 min sotto atmosfera inerte.
   2. Preparare una soluzione di N-succinylferoxamine (200 mg, 0,30 mmol), benzotriazole-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-fosofanio hexafluorophofosfato (BOP, 173 mg, 0,45 mmol), 1-idrossibenzotriazole (HOBt, 46 mg, 0,39 mmol) e N,N-diisopropylethylamine (DIPEA, 128,8 mg, 1,21mmol) in 10 mL di DMF (Mix A) in un'atmosfera di flistre a fondo rotondo da 50 mL.
   3. Sospendere il MNP@SiO_{precedentemente}sciacquato 2 @NH₂ in 3 mL di DMF sotto la sonicazione a secco in condizioni di assenza di ossigeno utilizzando un'atmosfera di gas argon (Mix B).
   4. Aggiungere il mix A per mescolare B dropwise.
   5. Agitare la miscela finale utilizzando uno shaker orbitale a temperatura ambiente durante la notte.
   6. Separare il coniugato risultante (MNP@SiO₂@NH@Fa) dalla sospensione utilizzando un magnete.
   7. Sciacquare il solido risultante e poi, sonicare cinque volte con 10 mL di etanolo.
   8. Asciugare il solido sotto vuoto per 24 ore.

2. L'assaggio batterico con ceppi di Y. enterocolitica per quantificare la cattura di batteri patogeni con nanoparticelle

1. Preparare una sospensione di tutte le nanoparticelle intermedie e il coniugato finale in PBS a 1 mg/mL in sterili tubi da 2 mL.
2. Preparare una cultura di Y. enterocolitica in 5 mL di luria Bertani (LB) inincubazione durante la notte a 37 gradi centigradi.
3. Preparare un 5 mL di brodo di soia triplicato (TSB) di 5 mL aggiungendo 50 -L di 10 mMM 2,2'-bipyridyl.
4. Inoculare i 5 mL di TSB carente di ferro con 50 -L della cultura notturna di Y. enterocolitica e poi, incubare a 37 s con agitazione fino a quando non viene raggiunto un OD₆₀₀ - 0.5-u20120.8.
5. Prendere 100 l della coltura ottenuta al passo 2.4 e diluire in un tubo da 2,0 mL contenente 900 -L di PBS per ottenere una prima diluizione di 1/10. Quindi, preparare una diluizione di 1/100 dalla prima diluizione utilizzando la stessa procedura per ottenere una concentrazione di cellule batteriche a 1 x 10⁶ unità formanti colonia (CFU)/mL circa.
6. Aggiungete 100 l di sospensione nanoparticelle a 1 mg/mL a 1 mL della diluizione di 1/100 della sospensione batterica in un tubo da 2,0 mL e omogeneizzare con il vortice.
7. Incubare la coltura a 20 gradi centigradi per 1 ora.
8. Separare gli aggregati MNP/batteri utilizzando un magnete e scartare attentamente il supernatale.
9. Sciacquare le nanoparticelle separate due volte con 1 mL PBS utilizzando un vortice.
10. Sospendere le nanoparticelle in 1 mL di PBS per contare la quantità di cattura batterica in CFU/mL.
11. Preparare quattro diluizioni successive 1/10 dalla precedente sospensione fino a raggiungere una diluizione 1 x 10^-4.
12. Piastra 10 -L di ciascuna piastre di agar TS e incubarle a 37 gradi durante la notte.
13. Fotografare la piastra con un digitaliizzatore gel in modalità epi bianco. Elaborare l'immagine con un software appropriato per amplificare un punto per contare il numero di singole colonie.
    NOTA: Ogni intermedio MNP è stato caratterizzato per seguire l'avanzamento della sintesi. In primo luogo, gli MP nudi sono stati studiati da XRD per controllare la struttura cristallina. Quindi, è stato eseguito lo spettro FT-IR di ogni intermedio per verificare i cambiamenti che si sono verificati nella reazione corrispondente. È stata inoltre effettuata un'analisi spettroscopia Raman di ogni intermedio al fine di confermare le conclusioni dedotte dagli spettri FT-IR. L'analisi TGA ci ha permesso di stimare il peso di perdita degli intermedi recanti materiale organico nella sua struttura. La morfologia e le dimensioni di ogni intermedio sono state studiate da TEM. Infine, l'analisi XPS è stata fondamentale per determinare gli stati di ossidazione dell'atomo su ciascuna superficie intermedia MNP e per confermare la formazione di legami covalenti nel coniugato MNP@SiO₂@NH@Fa.

Viene effettuata una caratterizzazione strutturale esaustiva al fine di determinare la morfologia e le proprietà di ogni intermedio e il coniugato finale. A tale scopo, le tecniche XRD, FT-IR, Raman spettroscopy, TGA, TEM, mappatura EDX e XPS sono utilizzati al fine di dimostrare la formazione del coniugato. Gli stati di ossidazione degli atomi sulla superficie delle nanoparticelle acquisite dalla spettroscopia fotoelettronica a raggi X (XPS) sono i dati più rilevanti per confermare la formazione di legami covalenti tra la nanoparticella e il sideroforo. In accordo con questi risultati, questo protocollo è riproducibile.

MNP bare, MNP funzionalizzati e coniugati sono mescolati con ogni ceppo Y. enterocolitica nella soluzione PBS. Gli aggregati batteri-MNP sono separati dalla sospensione utilizzando un magnete. Dopo aver risciacquato gli aggregati due volte con PBS, vengono risospesi in PBS per preparare le diluizioni seriali che vengono placcate per il conteggio delle coccie.

Gli intermedi e il coniugato finale preparato con questo protocollo sono stati sottoposti a diverse tecniche per visualizzare i cambiamenti che avvengono in ogni fase della sintesi. La spettroscopia a infrarossi e Raman costituisce un modo semplice e veloce per monitorare ogni fase della sintesi. La presenza di bande caratteristiche corrispondenti agli spettri Si-O, C-Si-C, Fe-O, Amide vibrazione, vibrazione dell'acido idramico di O-C-N negli spettri FT-IR e Raman (vedi sotto) sono stati i primi indicatori dei cambiamenti chimici che si stavano verificando sulla superficie delle nanoparticelle magnetiche in ogni fase della sintesi.

Diffractogramma XRD

La figura 1 mostra l'analisi XRD utilizzata per confermare la composizione e la struttura cristallina delle nanoparticelle magnetiche sintetiche (MNP) della magnetite rispetto al file JCPDS 00-003-0863.

Analisi TEM

Figura 2C visualizza i punti luminosi del modello di diffrazione degli elettroni che corrispondono con le distanze (111), (220), (311), (400), (422), (511) e (440) i piani di diffrazione della magnetite corrispondenti rispettivamente a d-spacings di 4.9, 2.9, 2.4, 2.0, 1.7, 1.6 e 1.4 . D'altra parte, la figura 2D e la figura 4E mostrano le immagini TEM di MNP@SiO2@NH2@Fa corrispondenti a particelle MNP disperse (10 nm) incorporate nel materiale amorfo inorganico-organico. Lo spessore del rivestimento è di oltre 10 nm.

Analisi EDX

Le mappe EDX mostrano la distribuzione degli elementi Fe, O, Si e C sulla superficie. Figura 3A mostra chiaramente la presenza di Si sulla superficie del MNP@SiO2. Dopo la funzionalizzazione dell'ammina e la coniugazione con la feroxamina, l'incremento di C sulla superficie delle nanoparticelle per MNP@SiO2@NH@Fa è mostrato nella Figura 3B come prova di una coniugazione di successo.

Analisi IR

Gli spettri FTIR di MNP bare,MNP@SiO 2, MNP@SiO2@NH2 eMNP@SiO 2@NH@Fa sono illustrati nella Figura 4. Tutti gli spettri FTIR mostrano l'inizio di una banda all'interno della gamma spettrale dell'analisi a 600 cm-1 che era legato alle vibrazioni Fe-O. La presenza di una banda larga a 1050 cm-1- attribuita alla vibrazione si-O-Si - negli spettri FTIR di MNP@SiO2,MNP@SiO2@NH2 e MNP@SiO2@NH@Fa confermato il rivestimento in silice.

Lo spettro FTIR di MNP@SiO2 (Figura 4) mostra una larga fascia tra 830 e 1275 cm-1 (legame Si-O); diventa più intenso dopo la sua funzionalizzazione con APTES nello spettro FTIR di MNP@SiO2@NH2, probabilmente a causa del legame Si-C (previsto tra 1175 e 1250 cm-1). Infine, le bande a 2995 cm-1 (c-H allungando i legami), 1640 cm-1 (vibrazione di amide II) e 1577 cm-1 (vibrazione dell'acido idramico O-C-N) osservate nello spettro FTIR di MNP@SiO2@NH@Fa confermato la coniugazione della ferosamina con le nanoparticelle10.

Analisi termogravimetria

I dati termogravimetrici sono mostrati nella Figura 5, che visualizza la perdita di peso dovuta all'aggiunta di materiale organico e acqua.

Raman analisi

Il rivestimento e la funzionalizzazione in silice dell'MNP nudo sono stati confermati anche dall'analisi Raman di ogni intermedio e MNP@SiO2@NH@Fa (Figura 6). Tutti gli spettri Raman mostrano picchi a 305.8, 537.2 e 665.6 cm-1, corrispondente alle vibrazioni Fe-O (Figura 6A)11e una spalla sul picco a 713.5 cm-1, relativo alle vibrazioni Si-O-Si (Figura 6B)12. Dopo la funzionalizzazione di APTES, lo spettro Raman di MNP@SiO2@NH2 visualizza picchi intensi a 1001,5 e 1027,4 cm-1, corrispondenti alla presenza di SiO2e a 1578,6 e 1597,9 cm-1,confermando la formazione di legami Si-C. Inoltre, la presenza di una spalla del picco a 703,0 cm-1 ha confermato anche la presenza di APTES (Figura 6C)13,14. Infine, l'ampio picco tra 1490 e 1700 cm-1 (centrato a 1581 cm-1), corrispondente ai legami Si-C e amide gruppi nello spettro Raman di MNP@SiO2@NH@Fa, sono in accordo con la formazione del coniugato (Figura 6D)14.

Analisi XPS

Lo studio dello stato di ossidazione degli atomi sulla superficie è stato effettuato mediante l'analisi XPS e ha confermato la formazione dei legami nelle strutture. Nella figura 7 sono illustrati gli spettri XPS degli MNP sbarrati e diversi. Per MNP, un picco stretto in C1 potrebbe essere dovuto a impurità nella manipolazione del campione durante la sintesi. L'introduzione del carbonio è osservata come legami C-C e C-H in MNP@SiO2@NH2 e MNP@SiO2spettri di @NH@Fa. L'analisi del picco a 399 eV negli spettri N1 spettrali insieme alla sua attenuazione osservata per MNP@SiO2@NH@Fa conferma la formazione di legami amide tra i MNP@SiO2@NH2 e la feroxamina. Inoltre, l'esistenza del legame N-O di moieties idrossimiche è in accordo con la presenza di un picco a 402 eV. La presenza di un picco a 102 eV in spettri stretti Si2p in tutti gli intermedi e il coniugato è in accordo con l'energia legante per il gruppo siloxane15,16.

Potenziale

I valori potenziali sono visualizzati nella tabella 1. I risultati sono negativi, rispettivamente -25,21 e -29,35 mV, rispettivamente per MNP e MNP@SiO2. La funzionalizzazione con APTES per dare a MNP@SiO2@NH2 ha cambiato la carica superficiale da negativa a positiva. Questo fatto è stato attribuito ai gruppi di ammine e la carica superficiale rimane positiva per MNP@SiO2@NH@Fa. La superficie positiva - potenziale potrebbe spiegare l'interazione tra i batteri (la cui superficie è negativa) e il coniugato17,18,19.

I batteri catturano il saggio

Il numero di cellule di Y. enterocolitica WC-A e FoxA WC-A 12-8 catturate con gli intermedi MNP e MNP@SiO2@NH@Fa sono state quantificate in quelle diluizioni in cui le colonie 40-u201260 sono state separate e facilmente visualizzate. Il numero di celle acquisite da bare, MNP@SiO2e MNP@SiO2@NH2 non mostra differenze significative tra di esse (Figura 8). Le forze elettrostatiche dovute a gruppi di ammine libere in MNP@SiO2@NH2 e la bassa concentrazione di recettore della membrana della ferosamina nei batteri potrebbero giustificare la mancanza di una specificità di legame attesa.

Questo protocollo potrebbe essere applicato nella sintesi di diversi tipi di coniugati, principalmente quelli che utilizzano la chimica del carbodimide. È abbastanza versatile per introdurre modifiche al fine di ottenere risultati migliori. La caratterizzazione completa di tutti gli intermedi e del coniugato finale, utilizzando le tecniche descritte, permette di seguire ogni fase della sintesi e confermare la formazione del legame del desiderio. Il conteggio delle colonie nei batteri cattura il saggio, usando una caduta di 10 gradi, permette di testare tutti i campioni contemporaneamente in una piastra che rende più facile ottenere repliche ed eseguire saggi in condizioni diverse.

Figura 1: Confronto dei diffractogrammi MNP (Fe3O4) (viola) e magnetite pattern (nero).
Questa cifra è stata modificata da Martènez-Matamoros etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Immagini TEM e diffrazione di elettroni a campo luminoso di MNP (A, B e C) e di MNP@SiO2@NH@Fa (D, E ed F).
Le immagini sono a risoluzione media e alta. Questa cifra è stata modificata da Martènez-Matamoros etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: mappe EDX di MNP@SiO2: Immagine HAADF e le corrispondenti mappe Fe, Si, O e C di A. MNP@SiO2 e B. MNP@SiO2@NH@Fa.
Questa cifra è stata modificata da Martènez-Matamoros etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: spettri FT-IR di ossido di ferro nudo (Fe3O4) MNP, MNP@SiO2,MNP@SiO2@NH2 e MNP@SiO2@NH@Fa (4).
Questa cifra è stata modificata da Martènez-Matamoros etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Analisi termogravimetrica di MNP,MNP@SiO 2@NH2e MNP@SiO2@NH@Fa.
Questa cifra è stata modificata da Martènez-Matamoros etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: spettri raman di ossido di ferro nudo (Fe3O4) MNP (A), MNP@SiO2 (B), MNP@SiO2@NH2 (C) e MNP@SiO2@NH@Fa (D).
(*) APTES, (a)) Altre fasi di ossido di ferro, probabilmente formate dalla trasformazione della magnetite da parte della potenza laser. Questa cifra è stata modificata da Martènez-Matamoros etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: spettri stretti XPS di MNP, MNP@SiO2@NH2 e MNP@SiO2@NH@Fa. Questa cifra è stata modificata da Martènez-Matamoros etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: CFU di Y. enterocolitica catturata per 100 g di nanoparticelle magnetiche: nuda, MNP@SiO2, MNP@SiO2@NH2 e MNP@SiO2@NH@Fa.
(A) WC-A (tipo selvaggio) (B) FoxA WC-A 12-8 (mutante privo di recettore feroxamina FoxA) e immagine SEM di MNP@SiO2@NH@Fa che interagiscono con Y. enterocolitica. Questa cifra è stata modificata da Martènez-Matamoros etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: : misure potenziali. Questa tabella è stata ottenuta da Martènez-Matamoros etal.

Non abbiamo niente da rivelare.