Differenziazione efficiente dei neuroni simpatici postganglionici utilizzando cellule staminali pluripotenti umane in condizioni di coltura senza alimentatore e definite chimicamente

Summary

In questo protocollo, descriviamo una strategia di differenziazione stabile e altamente efficiente per la generazione di neuroni simpatici postganglionici dalle cellule staminali pluripotenti umane. Questo modello renderà i neuroni disponibili per l'uso di studi di disturbi autonomici multipli.

Abstract

Le cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) sono diventate un potente strumento per la modellazione della malattia e lo studio dello sviluppo embrionale umano in vitro. In precedenza abbiamo presentato un protocollo di differenziazione per la derivazione dei neuroni autonomi con carattere simpatico che è stato applicato ai pazienti con neuropatia autonomica. Tuttavia, il protocollo è stato costruito su Knock Out Serum Replacement (KSR) e sulle condizioni di coltura basate sull'alimentatore, e per garantire un'elevata efficienza di differenziazione, lo smistamento cellulare era necessario. Questi fattori causano un'elevata variabilità, costi elevati e bassa riproducibilità. Inoltre, le proprietà simpatiche mature, compresa l'attività elettrica, non sono state verificate. Qui, presentiamo un protocollo ottimizzato in cui la cultura e la differenziazione del PSC vengono eseguite in condizioni di coltura senza alimentatore e definite chimicamente. Sono identificati marcatori genetici che identificano la cresta neurale del tronco. Un'ulteriore differenziazione nei neuroni simpatici postganglionici si ottiene dopo 20 giorni senza la necessità di smistamento cellulare. La registrazione elettrofisiologica mostra ulteriormente l'identità del neurone funzionale. La cottura rilevata dai nostri neuroni differenziati può essere potenziata dalla nicotina e soppressa dall'antagonista del recettore adrenergico. I progenitori neurali simpatici intermedi in questo protocollo possono essere mantenuti come sferoidi neurali fino a 2 settimane, il che consente l'espansione delle colture. In sintesi, il nostro protocollo di differenziazione del neurone simpatico aggiornato mostra un'elevata efficienza di differenziazione, una migliore riproducibilità, una maggiore flessibilità e una migliore maturazione neurale rispetto alla versione precedente. Questo protocollo fornirà ai ricercatori le cellule necessarie per studiare i disturbi umani che colpiscono il sistema nervoso autonomo.

Introduction

I neuroni simpatici postganglionici (symN) appartengono al sistema nervoso autonomo (ANS) e hanno molteplici ruoli importanti nel rispondere e regolare l'omeostasi del corpo indipendente dalla coscienza. Ad esempio, lo stress stimola i simN ed evoca la risposta di lotta o volo che porta ad un aumento della frequenza cardiaca, della pressione sanguigna e della sudorazione. Le simn sono colpite da molteplici disturbi umani a causa di genetica, tossicità/lesioni o come compagni di altre malattie. Un esempio di neuropatia genetica è il disturbo infantile Familial Dysautonomia (FD), dove una grave disregolazione delle simile provoca crisi disautonomica, evidente sudorazion....

Protocol

NOTA: la linea di reporter H9 PHOX2B:GFP è stata fornita da Oh et^al. Alcuni primer qPCR utilizzati in questo articolo sono stati ottenuti da OriGene Technologies, mentre alcune sequenze sono ottenute da Frith et al.^20,30.

1. Set-up per il rivestimento dei piatti, la preparazione dei supporti e la manutenzione hPSC

1. Rivestimento per piatti
   1. Rivestimento vitronectina (VTN)
      1. Mettere le fiale di VTN in un bagno d'acqua a 37 gradi fino a completa scongelazione, quindi mescolare accuratamente.
      2. Per una parabola....

Results

In questo protocollo vengono fornite istruzioni su come generare symN da hPSCs. Le condizioni di coltura qui illustrate sono state migliorate da un protocollo pubblicato in precedenza^23,24 (Figura 1A) a condizioni prive di alimentatore e definite chimicamente ( Figura1B). Vengono fornite due opzioni, una in cui le simN vengono realizzate entro 20 giorni e un'altra in cui le CNC possono essere espanse per.......

Discussion

Recentemente abbiamo pubblicato due recensioni, una che discute l'uso di symN derivati da hPSC per la modellazione delle malattie^31, nonché un confronto approfondito dei protocolli di differenziazione disponibili²². Così, qui ci concentriamo sulla risoluzione dei problemi del protocollo attuale per aiutare il ricercatore interessato a riuscire a fare simN. Durante l'intero processo di differenziazione, al fine di ottenere dati coerenti e cellule differenziate sane, la conta.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
piastre per coltura cellulare da 100 mm	Falcon	353003
Provette coniche per coltura tissutale da 15 mL	VWR/Corning	89039-664
Piastre per coltura tissutale a 24 pozzetti	Falcon	353047
Piastre a bassissimo attacco	Corning	07 200 601 e 07 200 602
Incubatore per coltura tissutale 5% CO2/20% O2	Thermo Fisher/Life Tecnologie	Heracell VIOS 160i
Provette coniche per coltura tissutale da 50 ml	VWR/Corning	89039-656
Piastre per coltura tissutale a 6 pozzetti	Costar	3516
Accutase	Innovation Cell Technologies	AT104500	Soluzione di dissociazione cellulare
Anticorpo anti-AP2a	Abcam	ab108311	Ospite: Coniglio; diluizione
1:400Anticorpo anti-Ascl1	BD Pharmingen	556604	Ospite: IgG1 di topo; diluizione 1:200
Anticorpo anti-CD49D	BioLegend	304313	Ospite: IgG1 di topo; 5 μ l/milione di cellule in 100 μ l volume
Anticorpo anti-CD49D (isotipo)	BioLegend	400125	Ospite: IgG1 di topo; 5 μ l/milione di cellule in 100 μ l volume
colorante DAPI	Sigma	D9542	diluizione 1:1000
Anticorpo anti-DBH	Immunostar	22806	Ospite: Coniglio; diluizione 1:500
Anticorpo anti-GFP	Abcam	ab13970	Ospite: Pollo; diluizione 1:1000
Anticorpo anti-HOXC9	Abcam	ab50839	Ospite: Topo; diluizione 1:100
Anticorpo anti-NET1	Mab	NET17-1	Ospite: Topo; diluizione 1:1000
Anticorpo anti-PRPH	Santa Cruz Biotechnology	SC-377093/H0112	Ospite: IgG2a di topo; diluizione 1:200
Anticorpo anti-SOX10	Santa Cruz Biotechnology	sc-365692	Host: IgG1 di topo; diluizione 1:100
Anticorpo anti-TH	Pel-Freez	P40101- 150	Ospite: Coniglio; diluizione 1:500 Acido
ascorbico	Sigma	A8960-5G	Concentrazione di base: 100 mM
di integratore di B27	Thermo Fisher/Life Technologies	12587-010	Concentrazione di base: 50x
BDNF	R& D Systems	248-BD	Concentrazione di base: 10 μ g/mL
BMP4	R& D Systems	314-BP	Concentrazione di riserva: 6 mM
Contatore di cellule	Thermo Fisher/Life Technologies	Countess II
Vetrini per camera di conteggio delle cellule	Invitrogen	C10312
Centrifuga	Eppendorf	57021& 5424R
CHIR99021	R& D Systems	4423	Concentrazione delle scorte: 6 mM
Cryo-vial	Thermo Fisher/Life Technologies	375353
dbcAMP	Sigma	D0627	Concentrazione delle scorte: 100 mM
DMEM	Thermo Fisher/Life Technologies	10829-018	Concentrazione delle scorte: 1x
DMEM/F12	Thermo Fisher/Life Technologies	11330-057	Concentrazione delle scorte: 1x
DMSO	Thermo Fisher/Life Technologies	BP231-100
E6	gibco	A15165-01
E8	gibco	A15169-01	Concentrazione di riserva: 1x
integratore E8	gibco	A15171-01	Concentrazione di riserva: 50x
EDTA	Sigma	ED2SS	Concentrazione di riserva: 0,5 M
Piastre per elettrofisiologia (AXION cytoview MEA96)	Axion BioSystems	M768-tMEA-96W
Macchina FACS	Beckman Coulter	CytoFLEX (per FACS)
Macchina FACS	Beckman Coulter	MoFlo Astrios EQ (per smistamento)
Tubi FACS (tappo filtro blu)	Tubi Falcon	352235
FACS (tappo bianco)	Falcon	352063
Siero fetale bovino (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150
GDNF	PeproTech	450	Concentrazione di riserva: 10 μ g/mL
di Geltrex	Invitrogen	A1413202	Matrice di membrana basale; Concentrazione di riserva: 100x
hPSCs	Thomson et al., (1998)	WA09
hPSCs	Oh et al. (2016)	H9-PHOX2B::eGFP
Fibronectina umana (FN)	VWR/Corning	47743-654	Concentrazione di riserva: 1 mg/mL
di L-glutammina	Thermo Fisher/Gibco	25030-081	Concentrazione di riserva: 200 mM
LN tank	Custom Biogenic Systems	V-1500AB
Lettore MEA	Axion BioSystems	Maestro Pro
Mouse laminin I (LM)	R& D Systems	3400-010-01	Concentrazione di riserva: 1 mg/mL
di integratore di N2	Thermo Fisher/Life Technologies	17502-048	Concentrazione di riserva: 100x
Medium neurobasale	gibco	21103-049	Concentrazione di riserva: 1x
NGF	PeproTech	450-01	Concentrazione di riserva: 25 μ g/mL
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Gibco	14190-136	Concentrazione di riserva: 1x
Bromidrato di poli-L-ornitina (PO)	Sigma	P3655	Concentrazione di riserva: 15 mg/mL
Primocin (antibiotici)	InvivoGen	ANTPM1	Concentrazione di riserva: 50 mg/mL
macchina qPCR	Piastre Bio-Rad Laboratories	C1000 Touch
qPCR	Bio-Rad Laboratories	HSP9601
FGF2 ricombinante	R& D Systems	233-FB/CF	Concentrazione di base: 10 μ g/mL
Acido retinoico	Sigma	R2625	Concentrazione di base: 1 mM
SB431542	Tocris/R& D Systems	1614	Concentrazione di base: 10 mM
Blu di tripano	Corning	MT-25-900-CI
Vitronectina (VTN)	Thermo Fisher/Life Technologies	A14700	Concentrazione di base: 0,5 mg/mL
Bagno d'acqua	VWR/Corning	706308
Y27632	R& D Systems	1254	Concentrazione di magazzino: 10 mM