Intubazione orotrachea ripetuta nei topi

Il topo di laboratorio è un modello animale comune per le malattie respiratorie umane. Così, ci sono diversi metodi pubblicati per l'intubazione del topo allo scopo sia di instillazione dei trattamenti e misurazione della meccanica respiratoria. La maggior parte delle procedure descritte richiede la visualizzazione della glottide attraverso la cavità orale con attrezzature specializzate come un largoscopio o una fonte di luce in fibra^{ottica 1,2,3,4,5,6,7}. Tuttavia, questo può essere difficile quando è necessaria una cannula relativamente grande, in quanto può oscurare la visione del ricercatore. Limjunyawong et al.⁸ hanno affrontato questa preoccupazione con un metodo di intubazione in cui una piccola incisione cutanea viene fatta lungo la linea mediana del collo ventrale che consente la visualizzazione della trachea. Dopo la procedura, l'incisione è chiusa con adesivo tissutale.

Per gli studi che richiedono frequenti intubazioni ripetute, incisione e chiusura successive di questo sito richiede il debridement dei margini della pelle e il trauma tissutale al collo ventrale. Lo scopo dell'approccio di visualizzazione tracheale transcutanea all'intubazione orale è quello di fornire una tecnica raffinata e non invasiva specificamente adatta per ripetuti studi di intubazione, nonché singoli eventi di intubazione nei topi.

Tutte le attività animali qui descritte sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Ohio State University e sono state condotte in strutture accreditate da AAALAC.

1. Preparazione della procedura

1. Costruire la piattaforma di intubazione. Per ottenere la pendenza della piattaforma appropriata, utilizzare un legante a 3 anelli da 3 pollici (7,6 cm). Piegare a metà una lunghezza di 15-20 cm di seta 3-0 o altro materiale filettatura e aderire alle estremità del filo nella parte superiore della piattaforma inclinata con nastro adesivo per creare un loop di sospensione (Figura 1).
2. Selezionare una cannula della dimensione e della lunghezza appropriate.
   NOT: Per un topo lungo 20-30 g, può essere utilizzato un catetere lungo 2,5,3,8 cm fino a 18 G. Per questo studio, sono stati utilizzati 18 topi c57BL/6 di 18 settimane di sesso femminile e c57BL/6 di 10 settimane (n - 3 di ogni ceppo). Una tènte di catetere bianco opaco fornisce la migliore visualizzazione transcutanea.
3. Tagliare uno smusso sulla punta distale del catetere e lisciare la superficie di taglio con carta abrasiva per creare una punta di smusso arrotondata. Creare delicatamente una leggera piegatura nella cannula a circa 1 cm dalla sveva (Figura 2).
   NOT: Per ogni mouse deve essere utilizzato un nuovo catetere.
4. Anestesizzare il topo con ketamina (5,4 mg/g di peso corporeo) e xylazina (16 g/g di peso corporeo) somministrata intraperitonealmente.  Applicare unguento oftalimico sterile agli occhi.
   NOT: Una corretta profondità anestetica si ottiene con la mancanza di risposta del mouse a un pizzico fermo.
5. Sospendere il mouse in una posizione supina sulla piattaforma di intubazione agganciando gli incisivi superiori intorno al filo di seta nella parte superiore della superficie angolata (Figura 3). Una volta che il mouse è posizionato esattamente nella recumbency dorsale, afferrare delicatamente la base della coda e ritrarre la coda verso il tavolo. Posizionare un pezzo di nastro adesivo sulla base della coda per fissare il mouse.
6. Applicare la crema depilatoria (Tabella dei Materiali) alla regione cervicale ventrale per 30-45 s quindi rimuovere tutta la crema depilatoria dalla regione cervicale utilizzando una garza secca. Ripetere il processo di applicazione, se necessario. Sciacquare accuratamente la pelle con acqua salina o distillata per rimuovere eventuali residui e asciugare.

2. Procedura di intubazione

1. Utilizzare pinze dritte e piatte nella mano non dominante per ritrarre delicatamente la lingua in modo che apra sufficientemente la bocca per l'introduzione della cannula.
   NOT: Le pinze dei denti del ratto non devono essere utilizzate in quanto questo danneggerà la lingua.
2. Con la mano dominante, far avanzare la cannula in bocca in modo che l'estremità che è distale alla leggera curva è contro il tetto della bocca del soggetto.
3. Rilasciare la lingua e far scorrere il bordo piatto delle pinze chiuse caudalmente lungo il collo ventrale fino a raggiungere il manubrio. Questo movimento sposta lateralmente le ghiandole salivari e appiattisce il muscolo che copre la trachea. La trachea appare transcutaneamente come una linea bianca (Figura 3A). Se necessario, ruotare le pinze in direzione craniodorsale mantenendo la tensione sulla pelle in direzione caudale per causare le ghiandole salivari spostate lateralmente al picco. Questa manovra crea più contrasto intorno alla trachea (Figura 3B).
   NOT: Evitare la forza eccessiva sul collo ventrale in quanto può collassare la trachea e compromettere la respirazione.
4. Avanzare la cannula mentre contemporaneamente fornire la punta distale della cannula ventralmente per supinazione della mano dominante con flessione simultanea del polso.
5. Il corretto posizionamento della cannula è indicato dalla visualizzazione della cannula opaca nella trachea (Figura 4B,D). Se la cannula è stata avanzata oltre il livello di origine del muscolo masseter e la visualizzazione della cannula nella trachea non è stata confermata, ritrarre la cannula e ritentare la manovra.
6. Confermare il corretto posizionamento della cannula collegando una lampadina di gonfiaggio polmonare alla cannula e osservando l'espansione toracica con la depressione simultanea del dispositivo.
7. Senza spostare la cannula, sganciare con cura gli incisivi del mouse dalla piattaforma di intubazione. Spostare il mouse su una piattaforma orizzontale (Table of Materials) e inserire la cannula nell'adattatore sul ventilatore. Dopo la profonda inflazione, ventilare il topo per 60 s quindi misurare la resistenza respiratoria.

3. Recupero

1. Una volta completata la procedura, spostare il mouse su una piattaforma riscaldata. Fornire una stimolazione costante tramite punta leggera o pizzichi della coda per incoraggiare la respirazione spontanea.
2. L'estubazione può verificarsi quando il mouse inizia a masticare. Afferrare la cannula a livello del mozzo e tirare delicatamente il tubo cranialmente e lontano dal mouse fino a quando la cannula è completamente rimosso dalla bocca del soggetto.
   NOT: È preferibile fornire supporto alle vie aeree con la cannula rigida il più a lungo possibile durante il processo di recupero.
3. Una volta estratto, trasferire il mouse in una gabbia di recupero pulita con supporto termico. Monitorare continuamente il mouse fino a quando non è completamente ambulatoriale, e il recupero è completo.

Monitoraggio seriale della funzione polmonare di base
Diciotto-settimana-vecchia femmina BALB/c e 10-settimana-vecchio C57BL/6 topi (n - 3 di ogni ceppo) sono stati intubati utilizzando il metodo descritto il giorno 0, 3, 10 e 17. A seguito di intubazione ogni giorno, il soggetto è stato collegato ad un ventilatore meccanico fornito con ossigeno al 100% (Tabella dei materiali). La resistenza respiratoria (Rrs) è stata misurata utilizzando la tecnica di oscillazione forzata per 60 s a seguito di un'inflazione profonda a 25 cm H2O tenuta per 5 s. Nessun errore software associato a questa trattenuta prolungata insieme ai valori Rrs all'interno della portata fisiologica forniscono ulteriore supporto per il corretto posizionamento della cannula. I dati non hanno rivelato differenze significative tra le Rr misurate osservate tra i punti temporali all'interno di ogniceppo( Figura 5 ). Si presume che l'assenza di un aumento di Rrs nel tempo indica mancanza di infiammazione associata a traumi nel sistema respiratorio in quattro punti temporali consecutivi.

Analisi statistica
Le statistiche descrittive (errore medio e standard) sono state calcolate utilizzando un software di analisi statistica (Tabella dei materiali). Il metodo Kolmogorov-Smirnov è stato utilizzato per verificare la distribuzione dei dati gaussiani. Le analisi statistiche dei set di dati sono state effettuate da ANOVA non accoppiato, con un post-test di confronto multiplo Post hoc Tukey-Kramer. Tutti i dati sono presentati come media : SEM. P < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.

Figura 1: Piattaforma di intubazione. La piattaforma di intubazione è costituita da un legante a tre anelli con un anello di filo di seta aderito alla parte superiore del legante per creare un ciclo di sospensione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: preparazione Cannula. (A)Vista laterale della cannula preparata. Si noti l'angolo delicato creato circa 1 cm dalla svela arrotondata all'estremità distale del catetere e l'orientamento dell'angolo cannula in relazione alla svela. (B) Vista Dorsoventrale della cannula preparata. Notare lo spigolo arrotondato e levigato dello smusso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: visualizzazione tracheale. (A) Le pinze sono poste sul collo ventrale e la pelle viene delicatamente ritratta caudalmente per spostare lateralmente le ghiandole salivari e forniscono la visualizzazione della trachea come una struttura bianca sulla linea mediana ventrale (freccia nera). (B) Rotazione craniodorsale delle pinze sul collo ventrale crea una sporgenza delle ghiandole salivari. La trachea è visualizzata come la struttura lineare bianca sulla linea mediana ventrale tra le ghiandole salivari (freccia nera). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Posizionamento corretto della cannula. (A) C57BL/6 mouse posizionato sulla piattaforma di intubazione con la cannula introdotta nella cavità orale prossimale. (B) C57BL/6 mouse con la cannula correttamente posizionata nella trachea. Si noti che la cannula può essere facilmente visualizzata come la struttura bianca all'interno della trachea (freccia bianca). (C) Mouse BALB/c posizionato sul tabellone di intubazione con la cannula introdotta nella cavità orale prossimale. (D) Mouse BALB/c con la cannula correttamente posizionata nella trachea. La cannula bianca può essere facilmente visualizzata all'interno della trachea (freccia nera). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Misurazione seriale della resistenza. Nessuna differenza significativa di Rr misurati osservati tra i punti temporali all'interno di ogni ceppo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.