L'obiettivo di questo articolo è quello di descrivere un metodo raffinato di intubazione del topo di laboratorio. Il metodo non è invasivo e, quindi, ideale per studi che richiedono il monitoraggio seriale della funzione respiratoria e/o l'instillazione di trattamenti nel polmone.
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Articolo metodologico
Intubazione orotrachea ripetuta nei topi
In questo articolo
Sommario
Abstract
La letteratura descrive diversi metodi per l'intubazione del topo che richiedono la visualizzazione della glottide attraverso la cavità orale o l'incisione nel collo ventrale per la conferma diretta del posizionamento della cannula nella trachea. La difficoltà relativa o il trauma tissutale indotto al soggetto da tali procedure può essere un ostacolo alla capacità di un ricercatore di eseguire studi longitudinali. Questo articolo illustra una tecnica in cui la manipolazione fisica del topo dopo l'uso di un depilatorio per rimuovere i capelli dal collo ventrale consente la visualizzazione transcutanea della trachea per l'intubazione orotracheale indipendentemente dal grado di pelle Pigmentazione. Questo metodo è innocuo per il soggetto e facilmente raggiungibile con una comprensione limitata dell'anatomia murina. Questo approccio raffinato facilita l'intubazione ripetuta, che può essere necessaria per monitorare la progressione della malattia o l'instillazione dei trattamenti. L'utilizzo di questo metodo può comportare una riduzione del numero di animali e abilità tecniche necessarie per misurare la funzione polmonare nei modelli murini delle malattie respiratorie.
Introduzione
Il topo di laboratorio è un modello animale comune per le malattie respiratorie umane. Così, ci sono diversi metodi pubblicati per l'intubazione del topo allo scopo sia di instillazione dei trattamenti e misurazione della meccanica respiratoria. La maggior parte delle procedure descritte richiede la visualizzazione della glottide attraverso la cavità orale con attrezzature specializzate come un largoscopio o una fonte di luce in fibraottica 1,2,3,4,5,6,7. Tuttavia, questo può essere difficile quando è necessaria una cannula relativamente grande, in quanto può oscurare la visione del ricercatore. Limjunyawong et al.8 hanno affrontato questa preoccupazione con un metodo di intubazione in cui una piccola incisione cutanea viene fatta lungo la linea mediana del collo ventrale che consente la visualizzazione della trachea. Dopo la procedura, l'incisione è chiusa con adesivo tissutale.
Per gli studi che richiedono frequenti intubazioni ripetute, incisione e chiusura successive di questo sito richiede il debridement dei margini della pelle e il trauma tissutale al collo ventrale. Lo scopo dell'approccio di visualizzazione tracheale transcutanea all'intubazione orale è quello di fornire una tecnica raffinata e non invasiva specificamente adatta per ripetuti studi di intubazione, nonché singoli eventi di intubazione nei topi.
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Protocollo
Tutte le attività animali qui descritte sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Ohio State University e sono state condotte in strutture accreditate da AAALAC.
1. Preparazione della procedura
- Costruire la piattaforma di intubazione. Per ottenere la pendenza della piattaforma appropriata, utilizzare un legante a 3 anelli da 3 pollici (7,6 cm). Piegare a metà una lunghezza di 15-20 cm di seta 3-0 o altro materiale filettatura e aderire alle estremità del filo nella parte superiore della piattaforma inclinata con nastro adesivo per creare un loop di sospensione (Figura 1).
- Selezionare una cannula della dimensione e della lunghezza appropriate.
NOT: Per un topo lungo 20-30 g, può essere utilizzato un catetere lungo 2,5,3,8 cm fino a 18 G. Per questo studio, sono stati utilizzati 18 topi c57BL/6 di 18 settimane di sesso femminile e c57BL/6 di 10 settimane (n - 3 di ogni ceppo). Una tènte di catetere bianco opaco fornisce la migliore visualizzazione transcutanea. - Tagliare uno smusso sulla punta distale del catetere e lisciare la superficie di taglio con carta abrasiva per creare una punta di smusso arrotondata. Creare delicatamente una leggera piegatura nella cannula a circa 1 cm dalla sveva (Figura 2).
NOT: Per ogni mouse deve essere utilizzato un nuovo catetere. - Anestesizzare il topo con ketamina (5,4 mg/g di peso corporeo) e xylazina (16 g/g di peso corporeo) somministrata intraperitonealmente. Applicare unguento oftalimico sterile agli occhi.
NOT: Una corretta profondità anestetica si ottiene con la mancanza di risposta del mouse a un pizzico fermo. - Sospendere il mouse in una posizione supina sulla piattaforma di intubazione agganciando gli incisivi superiori intorno al filo di seta nella parte superiore della superficie angolata (Figura 3). Una volta che il mouse è posizionato esattamente nella recumbency dorsale, afferrare delicatamente la base della coda e ritrarre la coda verso il tavolo. Posizionare un pezzo di nastro adesivo sulla base della coda per fissare il mouse.
- Applicare la crema depilatoria (Tabella dei Materiali) alla regione cervicale ventrale per 30-45 s quindi rimuovere tutta la crema depilatoria dalla regione cervicale utilizzando una garza secca. Ripetere il processo di applicazione, se necessario. Sciacquare accuratamente la pelle con acqua salina o distillata per rimuovere eventuali residui e asciugare.
2. Procedura di intubazione
- Utilizzare pinze dritte e piatte nella mano non dominante per ritrarre delicatamente la lingua in modo che apra sufficientemente la bocca per l'introduzione della cannula.
NOT: Le pinze dei denti del ratto non devono essere utilizzate in quanto questo danneggerà la lingua. - Con la mano dominante, far avanzare la cannula in bocca in modo che l'estremità che è distale alla leggera curva è contro il tetto della bocca del soggetto.
- Rilasciare la lingua e far scorrere il bordo piatto delle pinze chiuse caudalmente lungo il collo ventrale fino a raggiungere il manubrio. Questo movimento sposta lateralmente le ghiandole salivari e appiattisce il muscolo che copre la trachea. La trachea appare transcutaneamente come una linea bianca (Figura 3A). Se necessario, ruotare le pinze in direzione craniodorsale mantenendo la tensione sulla pelle in direzione caudale per causare le ghiandole salivari spostate lateralmente al picco. Questa manovra crea più contrasto intorno alla trachea (Figura 3B).
NOT: Evitare la forza eccessiva sul collo ventrale in quanto può collassare la trachea e compromettere la respirazione. - Avanzare la cannula mentre contemporaneamente fornire la punta distale della cannula ventralmente per supinazione della mano dominante con flessione simultanea del polso.
- Il corretto posizionamento della cannula è indicato dalla visualizzazione della cannula opaca nella trachea (Figura 4B,D). Se la cannula è stata avanzata oltre il livello di origine del muscolo masseter e la visualizzazione della cannula nella trachea non è stata confermata, ritrarre la cannula e ritentare la manovra.
- Confermare il corretto posizionamento della cannula collegando una lampadina di gonfiaggio polmonare alla cannula e osservando l'espansione toracica con la depressione simultanea del dispositivo.
- Senza spostare la cannula, sganciare con cura gli incisivi del mouse dalla piattaforma di intubazione. Spostare il mouse su una piattaforma orizzontale (Table of Materials) e inserire la cannula nell'adattatore sul ventilatore. Dopo la profonda inflazione, ventilare il topo per 60 s quindi misurare la resistenza respiratoria.
3. Recupero
- Una volta completata la procedura, spostare il mouse su una piattaforma riscaldata. Fornire una stimolazione costante tramite punta leggera o pizzichi della coda per incoraggiare la respirazione spontanea.
- L'estubazione può verificarsi quando il mouse inizia a masticare. Afferrare la cannula a livello del mozzo e tirare delicatamente il tubo cranialmente e lontano dal mouse fino a quando la cannula è completamente rimosso dalla bocca del soggetto.
NOT: È preferibile fornire supporto alle vie aeree con la cannula rigida il più a lungo possibile durante il processo di recupero. - Una volta estratto, trasferire il mouse in una gabbia di recupero pulita con supporto termico. Monitorare continuamente il mouse fino a quando non è completamente ambulatoriale, e il recupero è completo.
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Risultati
Monitoraggio seriale della funzione polmonare di base
Diciotto-settimana-vecchia femmina BALB/c e 10-settimana-vecchio C57BL/6 topi (n - 3 di ogni ceppo) sono stati intubati utilizzando il metodo descritto il giorno 0, 3, 10 e 17. A seguito di intubazione ogni giorno, il soggetto è stato collegato ad un ventilatore meccanico fornito con ossigeno al 100% (Tabella dei materiali). La resistenza respiratoria (Rrs) è stata misurata utilizzando la tecnica di oscillazione forzata per 60 s a ...
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Discussione
L'intubazione mediante la tecnica di visualizzazione tracheale transcutanea offre un approccio raffinato al metodo standard di incisione cutanea. Con particolare attenzione a diversi passaggi chiave, l'intubazione può essere facilmente e rapidamente raggiunta. L'animale deve essere posizionato esattamente in recumbency dorsale sulla piattaforma di intubazione con il mouse fissato in delicata retrazione. Questo estenderà l'animale in allineamento verticale e corretto posizionamento per l'intubazione. Inoltre, la crema dep...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano Lucia Rosas, Lauren Doolittle, Lisa Joseph e Lindsey Ferguson per la loro assistenza tecnica e il Laboratorio universitario Animal Resources per il loro supporto alla cura degli animali. Questo lavoro è finanziato da NIH T35OD010977 e R01-HL102469.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Catetere endovenoso da 18 G x 1 1/4", Safelet | Fisher Scientific | #14-841-14 | Cannula per intubazione |
| etanolo al 70%, 10 L | Fisher Scientific | 25467025 | Cannula per la pulizia |
| Carta abrasiva (carta vetrata) | Porter-Cable | 74001201 | Preparazione della cannula |
| AnaSed (xilazina soluzione sterile) iniezione (100 mg/mL) | Akorn Animal Health | NDC# 59399-111-50 | per anestesia |
| (0,5 pollici x 14 yds) | Fisher Scientific | 15966 | Ritenuta sulla piattaforma di intubazione |
| Sutura in seta intrecciata senza ago, non sterile, (3-0) | Henry Schein | Articolo #1007842 | Piattaforma di intubazione |
| Cuscinetto isotermico Deltaphase | Braintree Scientific | 39DP | Termoregolazione e recupero del mouse |
| Funzionamento Deltaphase Scheda | Braintree Scientific | 39OP | Recupero del topo (prima dell'estubazione) |
| Acqua distillata | ThermoFisher | 15230253 | Pulizia del topo dopo la depilazione |
| Forbici per gli occhi, angolate, affilate/affilate | Apparecchio Harvard | 72-8437 | Preparazione della cannula |
| FlexiVent (FX Module 2) | Scireq | N/A | Registrare i dati di funzionalità polmonare (non necessari per eseguire la procedura, utilizzati in questo studio per convalidare la procedura) |
| Spugne di garza | Fisher scientific | 13-761-52 | Depilazione |
| Heavy-Duty 3" 3-Ring View Leganti | Graffe | 24690CT | Piattaforma di intubazione |
| Software Instat | Graphpad | N/A | Software di analisi statistica |
| Siringa da insulina (0,5 cc, U100) | Fisher Somministrazione di | 329461 | anestesia |
| Iniezione di ketamina HCl, USP (100 mg/mL) | Llyod Laoratories | Elenco n. 4871 | Anestesia |
| Bulbo di gonfiaggio polmonare | Apparecchio di Harvard | 72-9083 | Confermare il posizionamento della cannula |
| Micro pinze, curvo e liscio | Apparecchio di Harvard | 72-0445 | Ritrarre la lingua e creare tensione sul collo per la visualizzazione |
| della cannulaNair (lozione depilatoria), bottiglia da 9 once | Chiesa & Dwight | 42010440 | Epilazione |
| Soluzione salina sterile (0,9%), 10 mL | Fisher Scientific NC9054335 | Anesthesia, pulizia della pelle dopo la depilazione |
Riferimenti
- Spoelstra, E. N., et al. A novel and simple method for endotracheal intubation of mice. Laboratory Animals. 41 (1), 128-135 (2007).
- Rivera, B., Miller, S. R., Brown, E. M., Price, R. E. A Novel Method for Endotracheal Intubation of Mice and Rats Used in Imaging Studies. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 44 (2), 52-55 (2005).
- Sparrowe, J., Jimenez, M., Rullas, J., Martinez, A. E., Ferrer, S. Refined Intratracheal Intubation Technique in the Mouse, Complete Protocol Description for Lower Airway Models. Global Journal of Animal Scientific Research. 3 (2), 363-369 (2015).
- Deyo, D. J., Wei, J. A Novel Method of Intubation and Ventilation in Mice. Anesthesia & Analgesia. 88 (2), 179(1999).
- Vergari, A., et al. A new method of orotracheal intubation in mice. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 8 (3), 103-106 (2004).
- Brown, R. H., Walters, D. M., Greenberg, R. S., Mitzner, W. A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice. Journal of Applied Physiology. 87 (6), 2362-2365 (1999).
- Das, S., MacDonald, K., Chang, H. S., Mitzner, W. A Simple Method of Mouse Lung Intubation. Journal of Visualized Experiments. (73), e50318(2013).
- Limjunyawong, N., Mock, J., Mitzner, W. Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research. Journal of Visualized Experiments. (102), e52964(2015).
- Qin, W., Baran, U., Wang, W. Lymphatic response to depilation-induced inflammation assessed with label-free optical lymphangiography. Lasers in Surgery and Medicine. 47 (8), 669-676 (2015).
- McGovern, T. K., Robichaud, A., Fereydoonzad, L., Schuessler, T. F., Martin, J. G. Evaluation of Respiratory System Mechanics in Mice using the Forced Oscillation Technique. Journal of Visualized Experiments. (75), e50107(2013).
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Ristampe e permessi
