Un protocollo è descritto per la perfusione in situ del corpo inferiore del topo, tra cui la vescica, la prostata, gli organi sessuali, l'osso, il muscolo e la pelle del piede.
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Articolo metodologico
Creazione in Situ Circuito Chiuso Perfusione di Organi Addominali Inferiori e Arti Hind in Topi
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La perfusione ex vivo è un importante strumento fisiologico per studiare la funzione degli organi isolati (ad es. fegato, reni). Allo stesso tempo, a causa delle piccole dimensioni degli organi di topo, la perfusione ex vivo di ossa, vescica, pelle, prostata e organi riproduttivi è impegnativa o non fattibile. Qui, riportiamo per la prima volta un circuito di perfusione in situ inferiore del corpo nei topi che include i tessuti di cui sopra, ma bypassa i principali organi di clearance (rene, fegato e milza). Il circuito è stabilito cannulando l'aorta addominale e vena cava inferiore sopra l'arteria iliac e la vena e cauterizzare i vasi sanguigni periferici. La perfusione viene eseguita tramite una pompa peritale con flusso di perfnone mantenuto fino a 2 h. La colorazione in situ con lectina fluorescente e la soluzione Hoechst hanno confermato che la microvaslatura è stata perfusa con successo. Questo modello murino può essere uno strumento molto utile per studiare i processi patologici, nonché i meccanismi di somministrazione di farmaci, la migrazione/metastasi delle cellule tumorali circolanti in/dal tumore e le interazioni del sistema immunitario con organi e tessuti perfusi.
Introduzione
La perfusione di organi isolati è stata originariamente sviluppata per studiare la fisiologia degli organi per il trapianto1,2,3e ha permesso di comprendere le funzioni degli organi senza interferenze da altri sistemi corporei. Ad esempio, la perfusione isolata di reni e cardiaci è stata immensamente utile per comprendere i principi di base dell'emodinamica e degli effetti degli agenti vasoattivi, mentre la perfusione epatica era importante per comprendere la funzione metabolica, compreso il metabolismo dei farmaci nel tessuto sano e malato4,
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Protocollo
Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dal Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università del Colorado.
1. Preriscaldare il sistema di perfusione
- Preparare il sistema di perfusione prima dell'intervento chirurgico avviando un bagno d'acqua circolante di 37 gradi centigradi per tutti i componenti con rivestimenti ad acqua (serbatoio perfusati, camera umida e coperchio) come mostrato in una configurazione personalizzata nella Figura 1A. Assicurarsi che il tubo sia pulito e sostituire se necessario. Per limitare il volume del perfusate, utilizzare una trappola a bolle all'....
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Risultati
Abbiamo creato un sistema di perfusione a circuito chiuso attraverso la canonazione dell'aorta addominale e la vena cava inferiore di 8-10 settimane di topi anziani, mantenendo il volume di buffer perfusione inferiore a 10 mL. La figura 3A mostra le immagini confocali dopo aver perfuso i tessuti con la soluzione di Ringer contenente Hoechst 33342 e DyLight 649-lectin. Muscolo, midollo osseo, testicoli, vescica, prostata, e la pelle del piede mostrano efficiente colorazione nucleare e vascola.......
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Discussione
Il circuito descritto può essere utilizzato per sondare varie domande di ricerca, ad esempio il ruolo di diversi componenti del siero e barriere tissutali nella somministrazione di farmaci o nel traffico di cellule immunitarie e staminali. Diversi sistemi di somministrazione di farmaci (ad esempio, liposomi e nanoparticelle) possono essere aggiunti al perfusate per comprendere il ruolo dei fattori fisiologici e biochimici nella consegna. La durata della perfusione può variare, a seconda del tessuto studiato, degli obiett.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Lo studio è stato sostenuto dalla concessione NIH CA194058 a DS, Skaggs School of Pharmacy ADR seed grant program (DS); National Natural Science Foundation of China (Grant n. 31771093), il Progetto di Collaborazione Internazionale della Provincia di Jilin (No.201180414085GH), i Fondi di Ricerca Fondamentali per le Università Centrali, il Programma per JLU Science and Technology Innovative Research Team (2017TD-27, 2019TD-36).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| 3.5x-90x stereoscopio zoom su supporto a braccio con luce LED | Amscope | SKU: SM-3BZ-80S | |
| Anidride carbonica, USP | Airgas healthcare | 19087-5283 | |
| Microscopio confocale | NIKON | ECLIPSE Ti2 | |
| Penna sterile monouso per cauzione | FIAB | ad alta temperaturaF7244 | |
| Trappola a bolle a camera umida (parte 6 nella Figura 1) | Apparato Harvard | 733692 | Personalizzato come contenitore perfisato; abilitato anche la perfusione a pressione costante |
| Coperchio della camera umida con finestra in quarzo (parte 3 nella Figura 1) | Apparato Harvard | 733524 | mantenere la temperatura della camera |
| Camera umida con scambiatore di calore a tubi metallici | Apparato Harvard | 732901 | Camera umida rivestita d'acqua con coperchio per mantenere la temperatura del perfusato e del topo |
| Portaaghi Olsen-Hegar con taglierine per suture Strumenti per | scienze fini (FST) | 125014 | |
| Ossigeno compresso, USP | Airgas healthcare | C2649150AE06 | |
| Pompa a rulli (parte 4 nella Figura 1) | Apparecchio Harvard | 730113 | erogare il perfusato alla cannula nella camera |
| umidaServocomando SCP plugsys F/Perfusion (parte 1 nella Figura 1) | Apparato Harvard | 732806 | controllare la velocità di purfusione |
| Cuscinetto in silicone | Apparecchio | ||
| Set di tubi in silicone (frecce nella Figura 1) | Apparato Harvard (TYGON) | 733456 | |
| Pinza modello standard per studenti | Strumenti per scienze fini (FST) | 91100-12 | |
| Forbici | chirurgicheFine Science Tools (FST) | 14001-14 | |
| Tavolo per camera umida | Apparecchio Harvard | 734198 | |
| Termocircolatore (parte 2 nella Figura 1) | Apparato Harvard | 724927 | bagnomaria circolante per tutti i componenti con camicia d'acqua |
| Rubinetto a tre vie (parte 5 nella Figura 1) | Cole-Palmer | 30600-02 | |
| Macchina per anestesia veterinaria | Highland | HME109 | |
| Materiali | |||
| 19-G BD Ago PrecisionGlide | BD | 305186 | Per immobilizzare l'Insyte Autoguard Ago alato e graffiare l'osso corticale |
| 4-0 suture di seta | Keebomed-Hopemedical | 427411 | |
| 6-0 suture di seta | Keebomed-Hope | 427401 | |
| ( 0,2 µ m) | ThermoFisher | 42225-CA | Filtro per il 5% di BSA-RINGER' S |
| Pennarello indelebile | Staedtler | 342-9 | |
| Siringa (10 mL) | Fisher Scientific | 14-823-2E | |
| Siringa (60 mL) | BD | 309653 | Filtro per BSA-RINGER' al 5% S |
| Reagenti | |||
| 1% Blu di Evans ( p/v ) in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS, pH 7,5) | Sigma | 314-13-6 | |
| 10% formalina tamponata | velleyvet | 36692 | |
| Topi BALB/c (8-10 settimane di età) | Charles River | ||
| Baxter Viaflex lattato Soluzione di Ringer | EMRN Medical Supplies Inc. | JB2324 | |
| Siero bovino albumina | Thermo Fisher | 11021-037 | |
| Colla cianoacrilica | Krazy Colla | ||
| DyLight-649-lectin | Vector Laboratories, Inc. | ZB1214 | |
| Etanolo (70% (vol/vol)) | Pharmco | 111000190 | |
| Hoechst33342 | Life Technologies | H3570 | |
| Isoflurane | Piramal Enterprises Limited | 66794-017-25 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato | Gibco | 10010023 |
Riferimenti
- Ghaidan, H., et al. Ten year follow-up of lung transplantations using initially rejected donor lungs after reconditioning using ex vivo lung perfusion. Journal of Cardiothoracic Surgery. 14 (1), 125(2019).
- Kabagambe, S. K., et al.
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Ristampe e permessi
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