Descritto qui è un metodo per la delezione genica mirata e senza marcatori nella chlamydia trachomatis utilizzando la mutagenesi di scambio letale delle cassette scambiate, FLAEM.
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Articolo metodologico
Markerless Gene Deletion di Mamicino Scambio Allelicas in Chlamydia trachomatis
In questo articolo
Sommario
Abstract
La chlamydia trachomatis è un patogeno intracellulare obbligatorio che è stato storicamente difficile da manipolare geneticamente. Il progresso definitivo nel chiarire i meccanismi che C. trachomatis utilizza per creare e mantenere una nicchia intracellulare privilegiata è stato limitato a causa della mancanza di strumenti genetici. Fortunatamente, di recente ci sono stati diversi nuovi progressi nelle tecniche di manipolazione genetica. Tra questi vi è lo sviluppo della mutagenesi dello scambio allelico segnalato dalla fluorescenza (FRAEM). Questo metodo consente la delezione mirata del gene accoppiato con l'inserimento di una cassetta di selezione codifica resistenza agli antibiotici e proteina fluorescente verde (GFP). La dipendenza da questa strategia può essere complicata quando si prendono di mira i geni all'interno di operoni polcistronici a causa del potenziale di effetti polari sui geni a valle. La mutagenesi allelica dello scambio di cassette flosche (FLAEM), il cui protocollo è descritto qui, è stato sviluppato per alleviare gli effetti polari indotti da cassette. FLAEM utilizza l'editing del genoma Cre-loxP per rimuovere la cassetta di selezione dopo la cancellazione mirata per scambio allelico. I ceppi risultanti contengono delezioni geniche senza marcatori di una o più sequenze di codifica. Questa tecnica facilita la valutazione diretta della funzione genica ed espande il repertorio di strumenti per la manipolazione genetica in C. tracommata.
Introduzione
La clamidia transamata è la principale causa di malattie batteriche sessualmente trasmissibili e rappresenta un onere significativo per la salute umana. Oltre 100 milioni di persone sono infettate ogni anno da C. trachomatis1. Circa il 70% delle infezioni nelle donne sono asintomatiche nonostante gli effetti dannosi sulla salute riproduttiva, come la malattia infiammatoria pelvica, la gravidanza ectopica e/o l'infertilità. Il sequela della malattia è direttamente correlato all'immunopatologia iniziata da C. infezione da tracommatide 2. Un vaccino efficace deve ancora essere sviluppato; pertanto....
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Protocollo
1. Progettazione e assemblaggio di pSUmC-4.0 con armi homologia specifiche per il gene di interesse
- Identificare le regioni da 3 kb direttamente a monte e a valle del gene oggetto di delezione per fungere da braccia omologhe da 5' e 3' per la ricombinazione omologa (Figura 1).
- Progettare i primer PCR a 1) amplificare il braccio homology da 3 kb 5' dal DNA genomico micoldiale e 2) contenere una sporgenza di 15-30 bp specifica per il pSUmC-4.0 quando viene digerita nel sito dell'enzima di restrizione Sall. Assicurarsi che le regioni di primer sovrapposte al pSUmC-4.0 abbiano temperature di fusione pari a 55 gradi centigr....
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Risultati
Il metodo per la delezione del gene senza marcatori in C. trachomatis utilizzando FLAEM si basa su accurate tecniche di clonazione e trasformazione. Il successo della ricombinazione allelica è un primo passo essenziale e richiede l'identificazione e l'inserimento di bracci di omologia nel vettore di clonazione pSUmC-4.0 (Figura 1). Un secondo passo essenziale per la delezione genica senza marcatori è la rimozione del reporter di fluorescenza e cassetta di selezione antibiotica media.......
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Discussione
Il protocollo descritto qui per la generazione di delezioni di geni markerless in C. trachomatis da FLAEM consente la delezione mirata di geni non essenziali ed elimina gli effetti polari indotti da cassette. Il protocollo si basa su un'attenta progettazione di bracci di omologia 5' e 3' inseriti nel vettore suicida pSUmC 4.0, da una trasformazione efficiente della tracomatide DiC e da un attento screening di ceppi mutanti isolati. Il successo dell'ingegneria genomica tramite questo metodo produce batte.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del Servizio Sanitario Pubblico del National Institute of Health, NIAID (concede A1065530 e Al124649), a K.A. Fields.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Agarosio | KSE Scientific | BMK-A1705 | Grado di biologia molecolare |
| Anidrotetraciclina cloridrato | ACROS Organics | 233131000 | |
| CaCl2 tampone | 10 mM Tris pH 7,4, 50 mM Cloruro di calcio diidrato | ||
| Cloruro di calcio diidrato | Sigma | C7902-500G | Adatto per colture cellulari |
| Cycloheximide | Sigma | 7698-1G | |
| dam-/dcm- Competente E. coli | New England BioLabs | C2925H | |
| DMSO | ATCC | 4-X | Coltura cellulare filtrata sterile testata |
| Acido glutammico | Sigma | G8415-100G | dell'acido L-glutammico |
| #1 | Terreni RPMI 1640 integrati con il 10 % (vol/vol) di siero fetale bovino inattivato termicamente (FBS). | ||
| Terreno di crescita #2 | Terreni RPMI 1640 integrati con il 10% (vol/vol) di siero fetale bovino inattivato termicamente (FBS) e 1 µ g/mL cicloesimide | ||
| Soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS) (1x) | Gibco | 24020-117 | |
| Siero fetale bovino inattivato termicamente qualificato One Shot (FBS) | Gibco | A38402-02 | |
| Cellule McCoy ATCC | CRL-1696 | ||
| Kit miniprep plasmidico Monarch New | England BioLabs | T1010S | Purificazione |
| del DNA su piccola scalaNaH2PO4 | Sigma | S3139-250G | Fosfato di sodio monobasico |
| Na2HPO4 | Sigma | S5136-500G | Fosfato di sodio bibasico |
| NEB 10-beta Elettrocompetente E. coli Cells | New England BioLabs | C3020K | |
| NEBuilder HiFi Kit di clonazione per l'assemblaggio del DNA | Nuovo England BioLabs | E5520S | Gibson Kit di montaggio |
| Penicillina G sale sodico | Sigma | P3032-10MU | Bioreagente adatto per colture cellulari |
| QIAGEN Plasmide Maxi Kit | QIAGEN | 12162 | Purificazione del DNA su larga scala |
| Q5 Hot Start DNA polimerasi ad alta fedeltà | New England BioLabs | M0515 | Frammento PCR Polimerasi |
| RPMI 1640 Medium (1x) | Gibco | 11875-093 | Contenente 2mM di L-glutammina |
| Sall-HF | New England BioLabs | R3138S | |
| Sbfl-HF | New England BioLabs | R3642S | |
| Selection Media #1 | RMPI 10 % FBS, 1 &; g/mL di cicloesimide, 500 µ g/mL di spectinomicina e 50 ng/mL di tetraciclina anidra disciolte in DMSO | ||
| Selection Medium #2 | RMPI 10 % FBS, 1 &; g/mL di cicloesimide, 500 µ g/mL di Terreni di selezione della spectinomicina | ||
| #3 | RPMI 10 % FBS, 1 µ g/mL di cicloesimide, 50 ng/mL di aTc e 0,6 µ g/mL penicillina | ||
| Acetato di sodio soluzione tampone | Sigma | S7899-100ML | 3M |
| SOC Outgrowth Medium | New England BioLabs | B9020SVIAL | |
| Spectinomicina dicloridrato pentaidrato, grado di coltura cellulare | Alfa Aesar | J61820 | |
| saccarosio | Sigma | S1888-1KG | Bioreagente adatto per colture cellulari |
| Tampone saccarosio-fosfato-glutammato (SPG) | 37,5 g di saccarosio, 1,25 g di Na2HPO4, 0,18 g di NaH2PO4, 0,36 acido glutammico per 500 ml di acqua di coltura tissutale | ||
| Tris | AMRESCO | 0497-5KG | di grado ultrapuro |
| (1x) | Gibco | 25200-056 | 0,25% |
| Water | Sigma | W3500-500ML | Filtrato sterile, BioReagente, Adatto per colture cellulari |
Riferimenti
- World Health Organization. Global Incidence and Prevalence of Selected Curable Sexually Transmitted Infections: 2008: World Health Organization. Sexual and Reproductive Health Matters. 20, World Health Organization. World Health Organization, Department of Reproductive Health and Research, 2012 ISBN 978 92 4 1503839 207-208 (2012).
- Stephen, R. S.
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Ristampe e permessi
