Monitoraggio dell'assemblaggio eIF4F misurando l'interazione eIF4E-eIF4G nelle cellule vive

Summary

Qui presentiamo un protocollo per misurare l'interazione eIF4E-eIF4G nelle cellule vive che consentirebbe all'utente di valutare la perturbazione indotta da farmaci delle dinamiche complesse eIF4F nei formati di screening.

Abstract

La formazione del complesso eIF4F ha dimostrato di essere il nodo chiave a valle per la convergenza delle vie di segnalazione che spesso subiscono l'attivazione oncogenica nell'uomo. eIF4F è un complesso di legame cap coinvolto nella fase di reclutamento mRNA-ribosoma dell'iniziazione alla traduzione. In molti modelli cellulari e precli clinici di tumori, la deregolamentazione dell'eIF4F porta a una maggiore traduzione di specifici sottoinsiemi di mRNA coinvolti nella proliferazione e nella sopravvivenza del cancro. eIF4F è un complesso etero-trimerico costruito dalla subunità eIF4E legante il tappo, dall'elisocca eIF4A e dalla subunità di impalcature eIF4G. Fondamentale per l'assemblaggio di complessi attivi eIF4F è l'interazione proteina-proteina tra proteine eIF4E ed eIF4G. In questo articolo viene descritto un protocollo per misurare l'assembly eIF4F che monitora lo stato dell'interazione eIF4E-eIF4G nelle celle vive. Il saggio di interazione proteina-proteina a base cellulare eIF4e:4G consente inoltre di valutare in modo accurato e affidabile i cambiamenti indotti dai farmaci nell'integrità complessa di eIF4F. Immaginiamo che questo metodo possa essere applicato per verificare l'attività dei composti disponibili in commercio o per un ulteriore screening di nuovi composti o modalità che interrompono in modo efficiente la formazione del complesso eIF4F.

Introduction

Il controllo dell'espressione genica gioca un ruolo fondamentale nella corretta esecuzione di programmi cellulari come la proliferazione e la differenziazione della crescita. Un meccanismo di controllo normativo può essere esercitato sia a livello di trascrizione genica che a livello di traduzione dell'mRNA. Nell'ultimo decennio, è diventato sempre più evidente che il controllo traslazionale per modulazione del processo di iniziazione piuttosto che le fasi successive di allungamento e terminazione possono regolare finemente la sintesi di sottoinsiemi specifici di proteine che svolgono una vasta gamma di funzioni biologiche.

Una maggiore tra....

Protocol

La linea cellulare HEK293 è stata utilizzata per il protocollo ed è stata coltivata nel Medium Aquila Modificata di Dulbecco integrato con il 10% di siero bovino fetale, 2 mM L-glutammina e 100 U/mL penicillina/streptomicina. Le cellule sono state coltivate a 37 °C con il 5% di CO₂ in un ambiente umidificato.

1. Valutazione quantitativa dell'interruzione complessa del FEI4F tramite il saggio di completamento eIF4E:eIF4G^604-646

1. Coltura cellulare e transitoria transitoria del saggio di completamento eIF4E:eIF4G^604-646
   1. Utilizzare cellule appena scongelate con meno di 20 passaggi per tutti gli ....

Results

Al fine di convalidare la sensibilità del sistema di complementazione eIF4E:eIF4G^604-646, l'inibizione mediata 4EBP1 dell'assemblaggio complesso eIF4F è stata valutata utilizzando inibitori mTOR. Inibendo la fosforilazione dipendente dalla chinasi mTORC1 della famiglia di proteine 4EBP, l'inibizione mTOR migliora l'associazione 4EBP1 all'eIF4E e, quindi, allo smontaggio eIF4F¹⁵. Sono state testate due classi di inibitori meccanisticamente diversi delle m.......

Discussion

Il metodo descritto in questo articolo utilizza un saggio di complementazione basato sulla luciferasi per monitorare quantitativamente l'assemblaggio complesso eIF4F attraverso la misurazione diretta dell'interazione eIF4G-eIF4E nelle cellule vive. Abbiamo fornito dettagli per l'uso del sistema di completamento eIF4E-eIF4G e abbiamo anche dimostrato che il sistema è estremamente accurato nella misurazione della dissociazione mediata da 4EBP1 indotta da farmaci dell'interazione eIF4E-eIF4G¹⁶. Al fi.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cellule 293FT	Thermo Fisher Scientific	R70007
Micropiastra per colture cellulari 96 pozzetti, F-Bottom	greiner bio-one	655083
Titolo cellulare Glo 2.0	PROMEGA	G9241
Envision Lettore multilabel	PerkinElmer	non applicabile
Finnpipette F2 Pipette multicanale 12 canali 30-300 ml	Thermo Fisher Scientific	4662070
Pipette multicanale Finnpipette F2 12 canali 5-50 ml	Thermo Fisher Scientific	4662050
FUGENE6	PROMEGA	E2692
Lipofectamine 3000	Thermo Fisher Scientific	L3000015
NanoBiT PPI Starter Systems	PROMEGA	N2014
Optimem I Siero ridotto Mediun, senza rosso fenolo	Thermo Fisher Scientific	11058021
Agitatore orbitale	Eppendorf	non applicabile
γ-Aminofenil-m7GTP (C10-distanziatore)-Agarosio	Jena Bioscience	AC-155S