Qui presentiamo un protocollo per misurare l'interazione eIF4E-eIF4G nelle cellule vive che consentirebbe all'utente di valutare la perturbazione indotta da farmaci delle dinamiche complesse eIF4F nei formati di screening.
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Articolo metodologico
Monitoraggio dell'assemblaggio eIF4F misurando l'interazione eIF4E-eIF4G nelle cellule vive
In questo articolo
Sommario
Abstract
La formazione del complesso eIF4F ha dimostrato di essere il nodo chiave a valle per la convergenza delle vie di segnalazione che spesso subiscono l'attivazione oncogenica nell'uomo. eIF4F è un complesso di legame cap coinvolto nella fase di reclutamento mRNA-ribosoma dell'iniziazione alla traduzione. In molti modelli cellulari e precli clinici di tumori, la deregolamentazione dell'eIF4F porta a una maggiore traduzione di specifici sottoinsiemi di mRNA coinvolti nella proliferazione e nella sopravvivenza del cancro. eIF4F è un complesso etero-trimerico costruito dalla subunità eIF4E legante il tappo, dall'elisocca eIF4A e dalla subunità di impalcature eIF4G. Fondamentale per l'assemblaggio di complessi attivi eIF4F è l'interazione proteina-proteina tra proteine eIF4E ed eIF4G. In questo articolo viene descritto un protocollo per misurare l'assembly eIF4F che monitora lo stato dell'interazione eIF4E-eIF4G nelle celle vive. Il saggio di interazione proteina-proteina a base cellulare eIF4e:4G consente inoltre di valutare in modo accurato e affidabile i cambiamenti indotti dai farmaci nell'integrità complessa di eIF4F. Immaginiamo che questo metodo possa essere applicato per verificare l'attività dei composti disponibili in commercio o per un ulteriore screening di nuovi composti o modalità che interrompono in modo efficiente la formazione del complesso eIF4F.
Introduzione
Il controllo dell'espressione genica gioca un ruolo fondamentale nella corretta esecuzione di programmi cellulari come la proliferazione e la differenziazione della crescita. Un meccanismo di controllo normativo può essere esercitato sia a livello di trascrizione genica che a livello di traduzione dell'mRNA. Nell'ultimo decennio, è diventato sempre più evidente che il controllo traslazionale per modulazione del processo di iniziazione piuttosto che le fasi successive di allungamento e terminazione possono regolare finemente la sintesi di sottoinsiemi specifici di proteine che svolgono una vasta gamma di funzioni biologiche.
Una maggiore tra....
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Protocollo
La linea cellulare HEK293 è stata utilizzata per il protocollo ed è stata coltivata nel Medium Aquila Modificata di Dulbecco integrato con il 10% di siero bovino fetale, 2 mM L-glutammina e 100 U/mL penicillina/streptomicina. Le cellule sono state coltivate a 37 °C con il 5% di CO2 in un ambiente umidificato.
1. Valutazione quantitativa dell'interruzione complessa del FEI4F tramite il saggio di completamento eIF4E:eIF4G604-646
- Coltura cellulare e transitoria transitoria del saggio di completamento eIF4E:eIF4G604-646
- Utilizzare cellule appena scongelate con meno di 20 passaggi per tutti gli ....
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Risultati
Al fine di convalidare la sensibilità del sistema di complementazione eIF4E:eIF4G604-646, l'inibizione mediata 4EBP1 dell'assemblaggio complesso eIF4F è stata valutata utilizzando inibitori mTOR. Inibendo la fosforilazione dipendente dalla chinasi mTORC1 della famiglia di proteine 4EBP, l'inibizione mTOR migliora l'associazione 4EBP1 all'eIF4E e, quindi, allo smontaggio eIF4F15. Sono state testate due classi di inibitori meccanisticamente diversi delle m.......
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Discussione
Il metodo descritto in questo articolo utilizza un saggio di complementazione basato sulla luciferasi per monitorare quantitativamente l'assemblaggio complesso eIF4F attraverso la misurazione diretta dell'interazione eIF4G-eIF4E nelle cellule vive. Abbiamo fornito dettagli per l'uso del sistema di completamento eIF4E-eIF4G e abbiamo anche dimostrato che il sistema è estremamente accurato nella misurazione della dissociazione mediata da 4EBP1 indotta da farmaci dell'interazione eIF4E-eIF4G16. Al fi.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dal budget principale del p53lab (BMSI, A*STAR) e dalla sovvenzione VIP JCO (A*STAR).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Cellule 293FT | Thermo Fisher Scientific | R70007 | |
| Micropiastra per colture cellulari 96 pozzetti, F-Bottom | greiner bio-one | 655083 | |
| Titolo cellulare Glo 2.0 | PROMEGA | G9241 | |
| Envision Lettore multilabel | PerkinElmer | non applicabile | |
| Finnpipette F2 Pipette multicanale 12 canali 30-300 ml | Thermo Fisher Scientific | 4662070 | |
| Pipette multicanale Finnpipette F2 12 canali 5-50 ml | Thermo Fisher Scientific | 4662050 | |
| FUGENE6 | PROMEGA | E2692 | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000015 | |
| NanoBiT PPI Starter Systems | PROMEGA | N2014 | |
| Optimem I Siero ridotto Mediun, senza rosso fenolo | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | |
| Agitatore orbitale | Eppendorf | non applicabile | |
| γ-Aminofenil-m7GTP (C10-distanziatore)-Agarosio | Jena Bioscience | AC-155S |
Riferimenti
- Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. Translational control in cancer. Nature Reviews Cancer. 10 (4), 254-266 (2010).
- Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular Mechanism of translational control. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 827-835 (2004).
- Bhat, M., ....
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Ristampe e permessi
