Campionamento e analisi dei segnali di profumo animale

Si sa molto poco dei cambiamenti chimici alla base dei segnali olfattivi negli animali^1,anche a causa delle sfide metodologiche nella registrazione e quantificazione dei profili chimici volatili degli odori². Ci sono diverse potenziali insidie quando si lavora con matrici chimiche altamente complesse; questi includono durante il campionamento e l'analisi dei campioni di odore³.

Al Rosalind Franklin Science Center, Università di Wolverhampton, stiamo intraprendendo l'analisi di odori e segni di profumo per capire come possono essere utilizzati dagli animali. Combiniamo la semiochimica con l'ecologia comportamentale, l'endocrinologia e la citologia per migliorare la nostra comprensione del ruolo svolto dai segnali olfattivi nella comunicazione animale.

Abbiamo sviluppato una metodologia e poi analizzato odori e marcature di una varietà di specie tra cui diversi primati non umani (cioè lemuri coronati, lemuri arruffati di rosso, macachi giapponesi, babbuini d'oliva, scimpanzé) e altri mammiferi (ad esempio gatti, mucche). Abbiamo raccolto e analizzato una varietà di campioni, tra cui urina, feci, capelli e secrezioni di odori di ghiandola profumata. Questi odori e segni di profumo consistono in miscele complesse di composti e quindi qualsiasi metodologia utilizzata per la loro analisi deve includere una qualche forma di tecnica separatoria. Come illustrato, si verificano anche in una serie di matrici che richiedono l'uso di tecniche per estrarre i componenti di interesse.

^Studi precedenti di Vaglio et al. In particolare, il campionamento dinamico dello spazio di testa comporta l'eliminazione dello spazio della testa con un volume noto di gas inerte che alla fine rimuove tutti i composti volatili ad eccezione di quelli che mostrano una forte affinità per la matrice del campione (ad esempio, composti polari in campioni acquosi).

Per l'attuale metodologia, abbiamo adottato la tecnica della microesezione in fase solida headspace (HS-SPME) abbinata a GC-MS. In particolare, abbiamo sviluppato e migliorato la metodologia già utilizzata da Vaglioet al.

Le tecniche di estrazione senza solventi sono molto efficaci per analizzare composti piccoli e altamente volatili (che altrimenti possono essere persi facilmente da un campione) perché questi metodi immobilizzano i composti su un supporto di fase stabile e solido. L'HS-SPME utilizza una fibra rivestita con un polimero adsorbente per catturare composti volatili nello spazio della testa del campione o per estrarre composti disciolti per immersione in un fluido biologico acquoso¹¹. Il rivestimento polimerico non lega fortemente i composti, quindi riscaldando nella porta di iniezione del GC possono essere rimossi. Questo metodo è più potente delle tecniche di estrazione dei solventi e anche più efficace del DHS.

Nell'approccio corrente i campioni sono contenuti all'interno di fiale di vetro. Queste fiale vengono riscaldate a una temperatura di 40 °C per simulare la temperatura corporea animale al fine di promuovere i componenti volatili del marchio di profumo per occupare lo spazio della testa del flaconcino. Una fibra SPME, rivestita con 65 μm di polidimetilsiloxano/divinilbenzene (PDMS/DVB) materiale assorbente, è esposta all'ambiente dello spazio della testa e i componenti volatili del campione vengono adsorbiti sulla fibra. Al riscaldamento della fibra nella porta di ingresso di un GC-MS, i componenti volatili vengono desorbiti dalla fibra e quindi separati dal GC. I modelli di frammentazione spettrale di massa sono ottenuti per ogni componente utilizzando la SM. Rispetto a questi spettri di massa rispetto ai database spettrali di massa, può essere possibile identificare provvisoriamente i componenti del marchio di profumo. Attraverso l'uso di un campionatore automatico, siamo in grado di analizzare più campioni in lotti in modo coerente.

Dato che ogni tipo di fibra SPME ha una diversa affinità con le sostanze chimiche polari, la fibra viene solitamente scelta a seconda della polarità e/o del peso molecolare dei composti chimici bersaglio. Inoltre, le condizioni gc vengono modificate a seconda del tipo di colonna GC e delle caratteristiche dei composti chimici bersaglio.

Questa tecnica consente l'analisi semi-quantitativa dei componenti volatili delle marcature olmografiche consentendo la separazione e l'identificazione provvisoria dei componenti nel campione, seguita dall'analisi dei rapporti di area di picco per cercare tendenze che potrebbero significare componenti della marcatura del profumo che possono essere coinvolte nella segnalazione.

I principali punti di forza di questo approccio attuale sono:

• Intervallo di tipi di campione che possono essere analizzati.
• Non sono richieste complesse preparazione o estrazioni del campione.
• La capacità di analizzare componenti volatili.
• La capacità di separare i componenti di una miscela.
• Per essere in grado di identificare i componenti rilevati.
• La capacità di fornire informazioni semi-quantitative e potenzialmente quantitative sui componenti rilevati.

1. Raccolta dei campioni

1. Odori campione che sono uno dei seguenti:
   1. Raccogliere spontaneamente rilasciato da soggetti di studio abituati (ad esempio, primati dello zoo) attraverso la marcatura del profumo su carta filtrante sterile (ad esempio, secrezioni di odori di ghiandola profumata) o direttamente in fiale (ad esempio urina).
   2. Raccogliere strofinando tamponi di cotone sterili dopo aver allenato le materie di studio utilizzando un allenamento di rinforzo positivo.
   3. Raccogliere strofinando tamponi di cotone sterili dopo la sedazione di soggetti di studio.
2. Posizionare i campioni in flaconcini di vetro trasparente sterili con cappuccio a vite da 10 mL e sigillare con tappi con viti con setti FTFE /silicone. Conservarli immediatamente a -20 °C.
   NOTA: È fondamentale utilizzare dispositivi di protezione individuale puliti, come guanti di nitrile; cambiarli frequentemente; evitare il contatto diretto della pelle con campioni e fiale. Si preferisce utilizzare fiale nuove di zecca; tuttavia, in caso di flaconcini usati, è fondamentale pre-pulire le fiale e quindi utilizzare lo stesso protocollo.
3. Prendi gli spazi vuoti ambientali ogni volta che vengono raccolti segni di profumo. Ad esempio, raccogliere i mezzi di campionamento (ad esempio, carta da filtro o tampone) e una fiala headspace esposta all'ambiente durante il campionamento.

2. Preparazione del campione

1. Preparare i campioni sul campo tagliando con una lama un quadrato di circa 10 mm da una carta da filtro marcata dal profumo, o la testa del tampone, e posizionandolo in un flaconcino head-space con punta a vite da 10 mL.
2. Dopo aver preparato ciascun campione, smaltire o pulire la lama utilizzata per tagliare il supporto di campionamento utilizzando un'appropriata salvietta antibatterica e/o alcool e asciugare accuratamente.
3. Conservare tutti i campioni a -20 °C.
   NOTA: Preferito a -20 °C o comunque il più basso possibile sul campo.

3. Preparazione all'analisi

1. Rimuovere i campioni dal congelatore e lasciare riscaldare naturalmente a temperatura ambiente per almeno 1 h.
2. Impostare il metodo analitico sul GC-MS come segue:
   1. Per le condizioni di analisi SPME, seguire le indicazioni del produttore per condizionare le fibre SPME prima del primo utilizzo: pre-condizione della fibra (260 °C per 5 minuti), incubazione del campione (40 °C per 2 min), tempo di estrazione (15 min), tempo di desorbimento (2 min) e post-condizione della fibra (260 °C per 20 min).
   2. Utilizzare le seguenti condizioni GC: colonna (HP5-MS 30 m x 0,25 mm; 0,25 μm), temperatura dell'iniettore (270 °C), portata (1 mL/min), modalità di iniezione (splitless), profilo del forno GC (45 °C per 2 min; da 4 °C/min a 170 °C; da 20 °C/min a 300 °C), linea di trasferimento MSD (280 °C).
      NOTA: per migliorare tra la coerenza del tempo di conservazione del campione, il metodo analitico è bloccato nel tempo di conservazione).
   3. Utilizzare le seguenti condizioni MSD: ritardo del solvente (2,5 min) e intervallo di scansione (da 29 a 400 amu).
      NOTA: Un intervallo da 10 a 400 è stato utilizzato nei protocolli precedenti⁴.
3. Assicurarsi che l'alimentazione del gas di spurgo all'unità di condizionamento della fibra sia accesa.
   NOTA: È fondamentale che l'assieme SPME sia installato correttamente nel campionatore automatico e che sia allineato ai vassoi del campionatore automatico, all'unità di condizionamento della fibra e alla porta di ingresso GC. Un allineamento errato potrebbe causare danni o distruzione della fibra SPME.

4. Analisi

1. Posizionare una fiala vuota dello spazio di teste (per fungere da vuoto di sistema) nella prima posizione del vassoio del campionatore automatico GC-MS. Posizionare il vuoto ambientale nella seconda posizione del vassoio del campionatore automatico. Posizionare i campioni per l'analisi nelle posizioni successive del vassoio del campione automatico.
2. Creare una sequenza analitica per analizzare ogni campione all'interno del vassoio del campione.
   1. Nella schermata iniziale di MassHunter, selezionate Sequenza | Sequenza di carico.
   2. Completare la tabella delle sequenze per tutti gli spazi vuoti e i campioni inserendo le informazioni appropriate. Salvare la tabella delle sequenze completata.
      NOTA: Le informazioni esatte per la tabella di sequenza dipenderanno dalla formattazione dei laboratori per la tabella. Le informazioni minime includerebbero normalmente il tipo di campione, il nome del campione, la posizione e il numero del flaconcino, il metodo analitico e il percorso e il nome del file di dati (l'allocazione di un nome di file di dati corrispondente al nome del campione aiuta l'elaborazione futura dei dati). Ulteriori campioni possono essere aggiunti alla sequenza durante l'analisi.
3. Eseguite la sequenza selezionando Sequenza (Sequence | Eseguire la sequenza.
4. Dopo l'analisi, riportare i campioni nel congelatore il prima possibile.
   NOTA: può essere possibile rianalizzare i campioni, ma va notato che alcuni componenti volatili possono essere stati completamente estratti durante l'analisi iniziale e alcuni composti possono essere stati sottoposti a decomposizione termica e batterica a 40 °C, quindi il cromatogramma risultante potrebbe non essere completamente rappresentativo della marcatura olografica originale.

5. Analisi dei dati

NOTA: L'analisi iniziale dei dati include l'integrazione di cromatogrammi per ottenere il tempo di conservazione e i dati delle ore di picco insieme all'identificazione provvisoria dei picchi utilizzando il software ChemStation e i database spettrali di massa NIST (National Institute of Standards and Technology), versione MSD F.01.01.2317. L'analisi dei dati può essere effettuata manualmente o con un metodo semi-automatizzato. Se si utilizza il metodo semi-automatizzato, a volte è utile intraprendere un certo grado di analisi manuale dei dati per verificare le identificazioni provvisorie.

1. Aprire il file di dati facendo clic sul file appropriato nella barra di spostamento sinistra. Il cromatogramma ionico totale (TIC) verrà visualizzato nella finestra superiore della schermata di analisi dei dati.
2. Per integrare il TIC utilizzando l'integratore RTE, selezionare Chromatogram | Integrare.
3. Regolare i parametri di integrazione in modo da integrare picchi superiori a 3 volte il rumore di base. Selezionare cromatogramma | Parametri di integrazione del segnale MS. Nella casella di uscita regolare l'area di picco minima in base alle esigenze (1.0 produce risultati accettabili nei nostri esempi).
4. Per identificare i picchi e generare un report riepilogativo, selezionare Esporta report | Report dei risultati della ricerca nella libreria a XLS.
   NOTA: Le librerie spettrali da cercare insieme al numero di corrispondenze di libreria da visualizzare devono essere preimpostate all'interno del software prima di poter eseguire una ricerca in libreria.
5. Il report foglio di calcolo risultante contiene i dati di integrazione per ogni picco e una corrispondenza provvisoria della libreria spettrale per assegnare l'identità. In genere, la corrispondenza qualità/libreria libreria deve essere >80 per accettare l'identificazione provvisoria. Salvare il foglio di calcolo.
6. Identificare un picco direttamente dal TIC.
   1. Scegli il picco di interesse.
   2. Se il picco è piccolo, ingrandire disegnando una casella intorno al picco tenendo premuto il pulsante sinistro del mouse, allungare la casella sul picco e rilasciarlo.
   3. Posizionare la linea del cursore in modo che si trova nel punto più alto del picco (o subito dopo).
   4. Fare doppio clic sul pulsante destro del mouse e lo spettro di massa per il picco apparirà nella finestra inferiore della schermata di analisi dei dati.
   5. Per cercare nella libreria spettrale, spostare il cursore in un punto qualsiasi della finestra spettrale e fare doppio clic con il pulsante destro del mouse. I risultati della ricerca nella raccolta verranno visualizzati in una nuova finestra.
   6. Per rimuovere il rumore di fondo da uno spettro di interesse, fare doppio clic con il pulsante destro del mouse sul picco in questione. Quindi fare doppio clic sul pulsante destro del mouse in un'area senza picchi immediatamente di fronte al picco di interesse. Selezionare cromatogramma | Sottrarre spettri. Lo spettro sottratto verrà visualizzato nella finestra inferiore della schermata di analisi dei dati e mostrerà '(-)' accanto ai dati SCAN nell'intestazione della finestra.

A seguito di questo protocollo, abbiamo provvisoriamente identificato un totale di 32 composti chimici volatili dall'analisi di 14 segni di profumo ano-genitale rilasciati spontaneamente su carta filtrante da lemuri arruffati di rosso(Varecia variegata rubra)e confrontato i profili degli odori con le caratteristiche del segnalatore12. All'interno di questi profili erano presenti composti volatili presenti in natura, come idrocarburi, terpeni, alcoli terpenici e chetoni, che includevano composti che in precedenza erano stati trovati come feromoni sessuali e segnali di idoneità in altre specie animali. I composti che sono stati provvisoriamente identificati sono elencati nella tabella 1. I cromatogrammi rappresentativi (1 da un controllo e 1 da un segno di profumo del lemure) sono riportati nella figura 1. Il numero e l'abbondanza relativa dei componenti variavano da campione a campione tra diverse materie di studio. Tuttavia, sei composti (benzaldeide, 2-etile-1-esaanolo, p-cresolo, cis-p-mentha-2,8-dien-1-olo, 2-pinen-4-one, pentadecano) erano presenti in tutti i campioni.

I risultati di questo studio hanno suggerito che i lemuri arruffati di rosso usano la marcatura del profumo per trasmettere informazioni sul sesso e sull'età femminile, con la marcatura ano-genitale che gioca un ruolo nella comunicazione socio-sessuale.

Un altro risultato rappresentativo dopo l'uso di questo protocollo è stato il nostro studio della pubblicità della fertilità da parte di babbuini di olive femminili (Papio anubis) (Dati vaglio et al. inediti). Abbiamo identificato un totale di 74 composti volatili dall'analisi di 385 campioni di odore vaginale di babbuino femminile. Questi composti comprendevano una serie di composti volatili odorosi presenti in natura come chetoni, alcoli, aldeidi, terpeni, acidi grassi volatili e idrocarburi. I cromatogrammi tipici utilizzati per confrontare il controllo vuoto e i campioni di odori vaginali di babbuino femminile provenienti da periodi fertili e non fertili sono mostrati nella figura 2. Abbiamo esaminato le relazioni tra profili di odore vaginale e ricettività sessuale dei babbuini femminili. I nostri risultati hanno mostrato che la quantità totale di odore vaginale differisce con la fertilità suggerendo che l'odore potrebbe svolgere un ruolo nel segnalare la fertilità del babbuino femminile. Abbiamo anche trovato differenze nell'odore vaginale tra i tipi di gruppo, ma non siamo stati in grado di distinguere gli effetti della composizione di gruppo, dell'età femminile e della parità.

Figura 1. Cromatogrammi di esempio; (cromatogramma superiore -'controllo') il campione di controllo, che mostra contaminanti; (cromatogramma inferiore -'marchio profumo lemure') una femmina adulta di secrezioni di odori ano-genitali al lemure rosso-arruffato, che mostra contaminanti e composti biologici significativi. Le frecce rosse indicano i sei composti biologici significativi che sono stati trovati in tutti i campioni: (a) benzaldeide; b 2-etile-1 esanolo; c p-cresolo; d cis-p-mentha-2,8-dien-1-ol; e 2-pinen-4-one; f pentadecano. Questa cifra è stata modificata da Janda etal. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Esempio di cromatogramma del campione di controllo (cromatogramma superiore -'controllo'), che mostra contaminanti; (cromatogramma medio -'babbuino odore non fertile') babbuino di oliva femmina, campione di odore vaginale di periodo non fertile; e (cromatogramma inferiore -'babbuino odore fertile') babbuino di oliva femmina, campione di odore vaginale di periodo fertile. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

La tabella 1. Composti volatili presenti in campioni di carta filtrante da secrezioni di odori ano-genitali di lemure rosso-arruffato di donne identificate provvisoriamente utilizzando il software ChemStation e database spettrali di massa NIST, versione MSD F.01.01.2317. Questa tabella è stata modificata a partire da Janda etal.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.