Caratterizzazione della differenziazione in vitro dei cheratinociti primari umani mediante analisi RNA-Seq

Sommario

Qui è presentata una procedura graduale per la differenziazione in vitro dei cheratinociti primari umani per inibizione del contatto seguita dalla caratterizzazione a livello molecolare mediante analisi RNA-seq.

Abstract

I cheratinociti primari umani sono spesso usati come modelli in vitro per studi sulla differenziazione epidermica e sulle malattie correlate. Sono stati riportati metodi per la differenziazione in vitro dei cheratinociti coltivati in modo sommerso bidimensionale (2D) utilizzando varie condizioni di induzione. Qui descritta è una procedura per il metodo di differenziazione dei cheratinociti in vitro 2D per inibizione del contatto e successiva caratterizzazione molecolare da parte dell'RNA-seq. In breve, i cheratinociti vengono coltivati in un mezzo cheratinocita definito integrato con fattori di crescita fino a quando non sono completamente confluenti. La differenziazione è indotta da stretti contatti tra i cheratinociti e ulteriormente stimolata escludendo i fattori di crescita nel mezzo. Usando analisi RNA-seq, è dimostrato che entrambi 1) cheratinociti differenziati mostrano firme molecolari distinte durante la differenziazione e 2) il modello di espressione genica dinamica assomiglia in gran parte alle cellule durante la stratificazione epidermica. Per quanto riguarda il confronto con la normale differenziazione dei cheratinociti, i cheratinociti che trasportano mutazioni del fattore di trascrizione p63 mostrano morfologia alterata e firme molecolari, coerenti con i loro difetti di differenziazione. In conclusione, questo protocollo descrive in dettaglio i passaggi per la differenziazione dei cheratinociti in vitro 2D e la sua caratterizzazione molecolare, con particolare attenzione all'analisi bioinformatica dei dati RNA-seq. Poiché l'estrazione dell'RNA e le procedure RNA-seq sono state ben documentate, non è al centro di questo protocollo. La procedura sperimentale di differenziazione dei cheratinociti in vitro e di pipeline di analisi bioinformatica può essere utilizzata per studiare eventi molecolari durante la differenziazione epidermica in cheratinociti sani e materici.

Introduzione

I cheratinociti primari umani derivati dalla pelle umana sono spesso usati come modello cellulare per studiare la biologia dell'epidermide^1,2,3,4. La stratificazione dell'epidermide può essere modellata dalla differenziazione dei cheratinociti, sia in modo monostrato sommerso 2D che nel modello organotipico di sollevamento dell'aria 3D^2,3,5,6,7. Sebbene i modelli 3D siano diventat....

Protocollo

Le biopsie cutanee sono state prelevate dal tronco di volontari sani o pazienti con mutazioni p63, per impostare la coltura primaria di cheratinociti. Tutte le procedure relative alla creazione di cheratinociti primari umani sono state approvate dal comitato etico del Radboud University Nijmegen Medical Centre ("Commissie Mensgebonden Onderzoek Arnhem-Nijmegen"). È stato ottenuto il consenso informato.

1. Differenziazione dei cheratinociti primari umani per inibizione del contatto

1. Preparare il mezzo di crescita dei cheratinociti (KGM) dal mezzo basale cheratinocita(tabella dei materiali)quando necessario.

Risultati

Differenziazione normale dei cheratinociti e analisi RNA-seq
In questo esperimento, le linee cheratinociti derivate da cinque individui sono state utilizzate per la differenziazione e le analisi RNA-seq. La figura 1 riassume la procedura sperimentale di differenziazione e i risultati dell'analisi RNA-seq. Una panoramica delle procedure di differenziazione in vitro dei cheratinociti normali e dei cambiamenti della morfologia cellulare durante la differenziazione è illustra.......

Discussione

Questo lavoro descrive un metodo per indurre la differenziazione dei cheratinociti umani e la successiva caratterizzazione usando analisi RNA-seq. Nella letteratura attuale, molti studi sulla differenziazione dei cheratinociti umani usano altri due metodi, con un'alta concentrazione di calcio o con siero come metodi per indurre la^{differenziazione 2,3,23}. Una relazione precedente ha confrontato attentamente questi tre diversi

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Bioanalizzatore 2100	Agilent	G2929BA
Estratto ipofisario bovino (BPE)	Lonza		Parte del bulletKit
CFX96 Sistema in tempo reale	Bio-Rad		qPCR Macchina
salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS)	Sigma-Aldrich	D8537
Fattore di crescita epidermico (EGF)	Lonza		Parte del bulletKit
Etanolammina >= 98%	Sigma-Aldrich	E9508
Chip di DNA ad alta sensibilità	Agilent	5067-4626
Idrocortison	Lonza		Parte del bulletKit
Insulina	Lonza		Parte del bulletKit
iQ SYBR Green Kit	BioRad	170-8886
Sintesi iScript cDNA	Bio rad	1708890
KAPA Library Quant Kit	Roche	07960255001	Kit di misurazione a bassa concentrazione
KAPA RNA HyperPrep Kit con RiboErase	Roche	KK8540	Kit RNAseq
KGM Gold Keratinocyte Medium Growth BulletKit	Lonza	192060
Nanodrop	deNovix	DS-11 FX (modello)	Nanodrop e Qbit per misure di DNA e RNA
Codici a barre NEXTflex DNA -24	Illumnia	NOVA-514103	6 bp primer lunghi
Penicillina-Streptomicina	Gibco	15140122
RNA Pico Chip	Agilent	5067-1513