Caratterizzazione della differenziazione in vitro dei cheratinociti primari umani mediante analisi RNA-Seq

Jos G.A. Smits; Jieqiong Qu; Hanna Niehues; Huiqing Zhou

doi:10.3791/60905

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Articolo metodologico

Caratterizzazione della differenziazione in vitro dei cheratinociti primari umani mediante analisi RNA-Seq

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DOI:

10.3791/60905

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16 maggio 2020

Jos G.A. Smits^*¹ , Jieqiong Qu^*¹ , Hanna Niehues² , Huiqing Zhou¹^,³

¹Department of Molecular Developmental Biology, Faculty of Science, Radboud Institute for Molecular Life Sciences, Radboud University, Nijmegen, The Netherlands, ²Department of Dermatology, Radboud University Medical Center, Radboud Institute for Molecular Life Sciences, Nijmegen, The Netherlands, ³Department of Human Genetics, Radboud University Medical Center, Nijmegen, The Netherlands

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Qui è presentata una procedura graduale per la differenziazione in vitro dei cheratinociti primari umani per inibizione del contatto seguita dalla caratterizzazione a livello molecolare mediante analisi RNA-seq.

Abstract

I cheratinociti primari umani sono spesso usati come modelli in vitro per studi sulla differenziazione epidermica e sulle malattie correlate. Sono stati riportati metodi per la differenziazione in vitro dei cheratinociti coltivati in modo sommerso bidimensionale (2D) utilizzando varie condizioni di induzione. Qui descritta è una procedura per il metodo di differenziazione dei cheratinociti in vitro 2D per inibizione del contatto e successiva caratterizzazione molecolare da parte dell'RNA-seq. In breve, i cheratinociti vengono coltivati in un mezzo cheratinocita definito integrato con fattori di crescita fino a quando non sono completamente confluenti. La differenziazione è indotta da stretti contatti tra i cheratinociti e ulteriormente stimolata escludendo i fattori di crescita nel mezzo. Usando analisi RNA-seq, è dimostrato che entrambi 1) cheratinociti differenziati mostrano firme molecolari distinte durante la differenziazione e 2) il modello di espressione genica dinamica assomiglia in gran parte alle cellule durante la stratificazione epidermica. Per quanto riguarda il confronto con la normale differenziazione dei cheratinociti, i cheratinociti che trasportano mutazioni del fattore di trascrizione p63 mostrano morfologia alterata e firme molecolari, coerenti con i loro difetti di differenziazione. In conclusione, questo protocollo descrive in dettaglio i passaggi per la differenziazione dei cheratinociti in vitro 2D e la sua caratterizzazione molecolare, con particolare attenzione all'analisi bioinformatica dei dati RNA-seq. Poiché l'estrazione dell'RNA e le procedure RNA-seq sono state ben documentate, non è al centro di questo protocollo. La procedura sperimentale di differenziazione dei cheratinociti in vitro e di pipeline di analisi bioinformatica può essere utilizzata per studiare eventi molecolari durante la differenziazione epidermica in cheratinociti sani e materici.

Introduzione

I cheratinociti primari umani derivati dalla pelle umana sono spesso usati come modello cellulare per studiare la biologia dell'epidermide^1,^2,^3,⁴. La stratificazione dell'epidermide può essere modellata dalla differenziazione dei cheratinociti, sia in modo monostrato sommerso 2D che nel modello organotipico di sollevamento dell'aria 3D^2,^3,^5,^6,⁷. Sebbene i modelli 3D siano diventat....