Nel protocollo attuale, spieghiamo come elaborare e coltura facilmente le cellule mononucleari tonsillare da esseri umani sani sottoposti a tonsillectomia chirurgica parziale per studiare le risposte immunitarie innate dopo l'attivazione, imitando l'infezione virale nei tessuti mucosali.
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Articolo metodologico
Isolamento delle cellule mononucleari del Tonsillar per studiare le risposte immunitarie innate Ex Vivo in un tessuto linfoide mucosale umano
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Lo studio di cellule isolate da tessuti linfoidi associati alla mucosa (MALT) consente di comprendere la risposta delle cellule immunitarie nelle patologie che coinvolgono l'immunità mucosale, perché possono modellare le interazioni ospite-patogeno nel tessuto. Mentre le cellule isolate derivate dai tessuti sono state il primo modello di coltura cellulare, il loro uso è stato trascurato perché il tessuto può essere difficile da ottenere. Nel protocollo attuale, spieghiamo come elaborare e coltura facilmente le cellule mononucleari tonsille (TMC) da tonsille umane sane per studiare le risposte immunitarie innate al momento dell'attivazione, imitando l'infezione virale nei tessuti mucosali. L'isolamento dei TMC dalle tonsille è rapido, perché le tonsille hanno a malapena alcun epitelio e producono fino a miliardi di tutti i principali tipi di cellule immunitarie. Questo metodo consente di rilevare la produzione di citochine utilizzando diverse tecniche, tra cui immunoassays, qPCR, microscopia, citometria di flusso, ecc., simili all'uso di cellule mononucleari periferiche (PBMC) dal sangue. Inoltre, i TMC mostrano una maggiore sensibilità ai test antidroga rispetto ai PMC, che devono essere considerati per i test di tossicità futuri. Pertanto, le colture ex vivo TMC sono un modello mucosale facile e accessibile.
Introduzione
Gli studi sugli organi umani sono limitati a causa dell'accessibilità e di ovvie ragioni etiche. Tuttavia, sono essenziali per comprendere appieno la complessità della biologia umana. Le colture di cellule isolate (colture primarie o linee cellulari) sono un sistema standard negli studi di biologia cellulare a causa della loro disponibilità. Mentre le colture di cellule isolate hanno permesso scoperte eccezionali, l'uso di linee cellulari è venuto su un esame più attento perché non imitano completamente la biologia degli organi in vivo. Tuttavia, la coltura di cellule tridimensionali o espianti tissutali è altamente complessa4,5,6. Infatti, un pezzo di tessuto o organo è altamente eterogeneo perché la sua composizione cellulare differisce a seconda della localizzazione nel tessuto. Pertanto, l'utilizzo di blocchi di tessuto richiede l'analisi di molti repliche tecniche e biologiche, portando alla necessità di un gran numero di donatori o pazienti.
I tessuti linfoidi associati alla mucosa (MALT) sono strutturalmente simili ai linfonodi ma hanno funzioni uniche, perché il loro ruolo principale è quello di regolare l'immunitàmucosale 7. A differenza dei linfonodi, che di solito si trovano ad una certa distanza dai tessuti, i MALT si trovano generalmente immediatamente sotto l'epitelio del tessuto mucosale. Istologicamente, sono composti principalmente da alte concentrazioni di cellule B e T, ma anche cellule che presentano antigene come macrofagi e cellule dendritiche. MALT costituiscono circa il 50% del tessuto linfoide nel corpo umano. I MALT sono suddivisi in nove gruppi a seconda della loro posizione: GALT (gut-), BALT (bronchus-), NALT (nasal-), CALT (conjunctival), LALT (larynx-), SALT (skin-), VALT (vulvo-), O-MALT (organizzato) e D-MALT (diffuso). L'O-MALT è composto principalmente dalle tonsille dell'anello tonsillare di Waldeyer ed è il MALT8,,9più accessibile. Infatti, le tonsille situate nell'oropharynx costituiscono la principale barriera che protegge le vie digerenti e respiratorie dai microrganismi invasivi10. Inoltre, le tonsille sono coperte da un sottile epitelio squamoso non-cheratinizzante, supportato da una capsula di tessuto connettivo contenente vasi sanguigni, nervi e linfatici, fornendo un facile accesso alle cellule immunitarie11,12. Inoltre, la tonsillectomia, l'atto chirurgico di rimozione delle tonsille, è una procedura comune eseguita sui bambini che hanno la respirazione disordinata di sonno, rendendo le tonsille un tessuto facilmente disponibile13 in contesti fisiologici.
Tonsils permettono lo studio della risposta delle cellule immunitarie in patologie che coinvolgono l'immunità mucosale. Infatti, nell'infezione da HIV, perché le tonsille sono composte da un'alta concentrazione di cellule immunitarie, sono il bersaglio principale della replicazione virale ma producono anche una grande quantità di citochine che non vengono rilevate nella circolazione14,15. A stati costanti, popolazioni rare di cellule simili innate sono presenti in vari tessuti mucosali, comprese le tonsille, ma sono essenzialmente assenti dal sangue.
Pertanto, le cellule mononucleari provenienti da tonsille (TMC) sono un modello più rilevante e complesso dei PBMC e possono rispondere a domande più profonde. D'altra parte, l'uso di espianti tissutali può essere complesso e non sempre rilevante per studi immunitari innati. Così, abbiamo stabilito un modello per studiare l'attivazione immunitaria mucosale utilizzando TMC16. Qui, descriviamo un metodo per un isolamento efficiente dei TMC dalle tonsille umane fresche. Questo metodo consente il recupero di un gran numero di cellule immunitarie pur mantenendo la loro integrità per gli studi ex vivo.
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Protocollo
Gli esemplari non vengono raccolti specificamente per scopi di ricerca e lo studio non è considerato invasivo. Tuttavia, la raccolta delle tonsille umane richiede l'approvazione etica da parte delle autorità locali competenti. Nel nostro caso, è stato approvato dalla Comité de Protection des Personnes (IDRCB/EUDRACT: 2018A0135847). Inoltre, viene richiesto il consenso di ogni paziente o rappresentante legale per ottenere i dati personali dei donatori (ad esempio, sesso, età, storia di infezioni ent) che possono aiutare a interpretare i risultati sperimentali.
1. Manipolazione del tessuto delle Tonsillari Umane
- Mettere al laboratorio tonsille di ogni donatore in una fiala sterile da 50 mL contenente 25 mL PBS 1x e trasportare al laboratorio (RT) secondo le raccomandazioni dell'autorità (utilizzare tre livelli di protezione: fiale, una cassetta di sicurezza e un sacchetto).
NOT: L'intera procedura deve essere eseguita in un laboratorio di livello di sicurezza biologica 2. Tutti i campioni umani devono essere trattati con cura in quanto non sono stati precedentemente qualificati e possono contenere agenti infettivi. -
Pulire tutti gli strumenti tra ogni utilizzo.
- Dopo l'uso, smontare il colino cellulare e tenere con tutti gli altri strumenti (ad esempio pestello, pinze) in un bagno contenente una soluzione di detersivo (1/10 di detersivo volume in H2O) durante la notte.
- Spennellare ogni utensile per rimuovere il tessuto e lavare con acqua limpida.
- Asciugare bene tutte le parti, quindi preparare il colino cellulare (85 mL, 37 mm di diametro) posizionando una griglia in acciaio a 60 maglie sopra una griglia in acciaio a 10 maglie e chiudere strettamente l'anello.
- Mettere tutti gli strumenti in sacchetti sterili e autoclave.
2. Dissezione del tessuto tonsillare umano e isolamento delle celle mononucleari tonsillare (TMC)
- Posizionare il colino cellulare su un piatto di coltura cellulare 150 x 25 mm2 (SPL150) e tutti gli strumenti in un altro SPL150 per mantenerli sterili.
- Trasferire le tonsille dalla fiala nel colino a cellule utilizzando pinze sterili. Versare anche in tutto il PBS, che contiene alcune cellule che hanno eseguito le tonsille. Se necessario, aggiungere altro PBS per immergere la griglia.
NOT: Il tessuto deve essere immerso in ogni momento per evitare l'esidratazione. - Rimuovere il tessuto cauterizzato, sanguinante e fibroma usando la pinza e un bisturi.
NOT: Tonsils rimosso dai bambini non hanno bisogno di questo passaggio. - Tagliare i tessuti in piccoli pezzi di meno di 0,5 cm di diametro utilizzando il bisturi e le pinzette curve. Tagliare tutto il tessuto in modo che i piccoli pezzi possano essere immersi in ogni momento.
- Mettere alcuni pezzi di tessuto nel colino cellulare e raschiarli sulla griglia con un pestello di vetro fino a quando rimane solo uno strato davvero sottile di stroma bianco. Rimuovere e scartare lo stroma per evitare di intasare la griglia.
- Una volta che tutti i tessuti sono stati spremuti attraverso la griglia, utilizzare una pipetta da 10 mL per trasferire tutte le sospensioni cellulari sulla griglia e raschiarla un'ultima volta.
- Trasferire la sospensione cellulare con una pipetta da 10 mL in una fiala sterile. Lavare la griglia e il colino cellulare con PBS 1x. Lasciare riposare la sospensione cellulare per 5 min a RT sul banco. Questo passaggio permette la precipitazione e l'agglomerazione dello stroma, delle cellule morte e di qualsiasi DNA rilasciato, e faciliterà il passo successivo.
- Posizionare uno sterile setaccio di 70 m sopra una nuova fiala da 50 mL (rimuovere con attenzione dall'involucro) e trasferire delicatamente la sospensione cellulare su di esso con una pipetta da 10 mL. Non mescolare le sospensioni, perché un pellet è spesso presente. Se il setaccio è intasato, utilizzare la parte posteriore di una punta sterile da 1 mL pipetta per graffiare le cellule attraverso il setaccio. Cambiare il setaccio tutte le volte che è necessario.
- Centrifugare le cellule a 250 x g per 10 min a 4 gradi centigradi.
- Scartare il supernatante e risospendere il pellet mescolando delicatamente la fiala, quindi risospendere le cellule in 35 mL di PBS.
- In una nuova fiala, posizionare un nuovo setaccio di 70 m sulla parte superiore e trasferire la sospensione cellulare su di esso con una pipetta da 10 mL. Se il setaccio è intasato, utilizzare la tecnica descritta nel passaggio 2.7.
3. Isolamento dei TMC in base al gradiente di densità delle celle
NOT: I TMC possono essere utilizzati dopo il passaggio 2.10. Tuttavia, per ottenere una soluzione cellulare più chiara e per rimuovere altri detriti cellulari e le cellule rosse, si consiglia di eseguire un isolamento del gradiente di densità cellulare delle cellule mononucleari.
- Aggiungete 15 mL del gradiente medio di densità (d - 1,076 g/mL) in una nuova flaconla da 50 mL. Versare la soluzione TMC sopra il mezzo di sfumatura di densità, facendo attenzione a ridurre al minimo la miscelazione delle sospensioni con il mezzo di sfumatura di densità.
- Centrifugare la soluzione a 1.000 x g per 30 min a RT con accelerazione e rottura.
- Rimuovere con una pipetta da 10 mL ed eliminare lo strato superiore (contenente principalmente PBS 1x) senza disturbare l'interfaccia tra i TMC e il mezzo di sfumatura di densità.
NOT: I TMC contengono un basso numero di eritrociti, quindi la soluzione è chiara. Pertanto, l'interfaccia tra la soluzione dei TMC in PBS e il mezzo di sfumatura di densità può essere difficile da visualizzare. Di conseguenza, le celle possono essere risospese in RPMI 1640 integrate con 20 m HEPES (senza FBS) prima che venga eseguito il gradiente di densità. - Rimuovere i TMC con una punta sterile da 1 mL e metterli in una nuova fiala da 50 mL.
- Lavare le cellule aggiungendo 50 mL di PBS contenente il 2% del siero bovino fetale (FBS) e 2 mM EDTA e centrificare il tubo a 250 x g per 10 min a 4 gradi centigradi per rimuovere le piastrine rimanenti.
- Ripetere il passaggio 3.5, ma centricarlo a 400 x g per 10 min a 4 gradi centigradi.
- Preparare il mezzo di coltura (R10) integrando RPMI 1640 con FBS inattivato al calore al 10%, 2 mM L-glutamine e la soluzione antibiotica (100 U/mL penicillium e 100g/mL streptomicina).
- Risospendere i TMC in 10 mL di R10 e contare le celle. In media, questa tecnica produce 5 x 108-2 x 109 TBC per coppia di tonsille. Le cellule possono ora essere utilizzate per indagini come pMC da sangue intero (ad esempio, purificazione di un tipo di cellula specifico, coltura cellulare, citometria di flusso, RT-qPCR, congelamento, ecc.).
-
Se necessario, congelare le celle per un ulteriore utilizzo utilizzando tecniche standard per il congelamento delle cellule primarie.
- Contare il numero di celle.
- Centrifugare le cellule e rimuovere il super-natante. Sciogliere il pellet in abbastanza 100% FBS per una concentrazione finale di 1 x 108 celle / mL, quindi aggiungere lo stesso volume di una soluzione 80% FBS - 20% DMSO. Le celle saranno quindi a 5 x 107 celle / mL. Questo passaggio deve essere effettuato a 4 gradi centigradi e la soluzione FBS e DMSO deve essere mantenuta a 4 gradi centigradi prima dell'uso.
- Distribuire 1 mL della soluzione cellulare in criotubi e metterli in un contenitore di congelamento lento che è stato a 4 gradi durante la notte per controllare il tasso di congelamento cellulare. Collocarlo a -80 gradi centigradi.
- Per scongelare le cellule, mettere i crioviali in un bagno caldo a 37 gradi centigradi per alcuni secondi con agitazione costante. Non appena le cellule iniziano a scongelarsi, trasferirle a 49 mL di R10 e centrifugare per rimuovere il DMSO. Contare le celle e utilizzarle come PBMC.
NOT: Anche se il congelamento e lo scongelamento dei TMC rimuoveranno i detriti, danneggerà anche alcuni tipi di cellule rare. Se sono presenti grumi o detriti dopo lo scongelamento, è meglio passare la sospensione cellulare attraverso uno sterile setaccio di 70 m prima di usarlo.
4. Fenotipizzazione dei TMC per Citometria di flusso
- Recuperare 5 x 106 cellule dalla soluzione precedente per ogni pannello di miscela anticorpale che deve essere testato e posto in un tubo di citometria 5 mL. Recuperare 1 x 106 celle per il controllo non colorato.
- Lavare le cellule in PBS e centrifugare a 400 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Risospenderli in 500 gradi l di PBS (1 x 106 celle/mL) e incubarli con una macchia di vitalità per 30 min a 4 gradi centigradi al buio.
- Aggiungere il calore di 5 gradi di calore inattivato dal siero ab umano per 100 gradi di sospensione cellulare e incubare per 15 minuti a 4 gradi centigradi al buio.
- Lavare le cellule in PBS : 2% FBS - 2 mM EDTA (Wash Buffer) e centrifugare a 400 x g per 5 min a 4 gradi centigradi.
- Risospendere i TMC in 500 -L di Wash Buffer contenenti gli anticorpi, come descritto nella tabella 1. Incubare le cellule per 30 min a 4 gradi centigradi al buio.
- Lavare le cellule in Wash Buffer e centrifugare a 400 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Risospendere i TMC in 500 - L di PBS contenenti lo 0,5% di paraformaldeide (PFA). Mantenere al buio a 4 gradi centigradi fino all'acquisizione da citometria di flusso.
NOT: La PFA è pericolosa. Utilizzare una soluzione commerciale pronta all'uso per preparare la soluzione PFA 0.5%.
| Anticorpo | Clone | Fluorocromo | Azienda |
| Vivi morti | BV405 (in modo | ThermoFisher Scientifico | |
| CD3 (in questo caso) | SP34-2 | V500 | BD Pharmingen |
| CD8 (in questo caso) | SK1 | Amcyano | BD Pharmingen |
| CD8 (in questo caso) | BW135/80 | VioBlue | Miltenyi Biotec |
| CD4 (in questo caso) | NUMERO di giochi di posta elettronica | PE-Cy7 | BD Pharmingen |
| CD45 (informazioni in stato indue) | HI30 (in questo MODO 30) | PerCP-cy5.5 | Bd |
| CD19 (informazioni in stato INstato CD1 | HD237 | Ecd | Beckman Coulter |
| CD20 (informazioni in due) | 2H7 (in via di inadem | Alexa Fluor 700 | BD Pharmingen |
| CD14 (informazioni in due) | M5E2 (in questo stato del sistema) | PE-cy7 | BD Pharmingen |
| CD14 (informazioni in due) | M5E2 (in questo stato del sistema) | Apc | BD Pharmingen |
| CD16 (informazioni in inglese) | 3G8 | APC-H7 | BD Pharmingen |
| CD56 (in inglese) | MEM188 (in detto) | Pe | BD Pharmingen |
| CD123 (informazioni in confronto a 3: CD12 | 7G3 | Pe | BD Pharmingen |
| BDCA-1 | L161 (in inglese) | Blu Pacifico | BD Pharmingen |
| BDCA-3 | AD5-14H12 | Fitc | Miltenyi Biotec |
| BDCA-4 | AD5-17F6 | Apc | Miltenyi Biotec |
| HLA-DR | G646-6 | PerCP-cy5.5 | BD Pharmingen |
| CD11c (informazioni in base al nome) | 3.9 | Alexa Fluor 700 | ebioscienze |
Tabella 1: Elenco degli anticorpi per la caratterizzazione delle cellule per citometria di flusso.
5. Esempio di attivazione di TMC e misurazione della produzione di Cytokine
- Diluire i TMC in R10 medio per ottenere una concentrazione di 2 x 106 cellule / mL.
- Distribuire 400.000 TMC in 200-L di R10 in una piastra inferiore ben rotonda 96.
- Per attivare le cellule, aggiungere 5 g/mL della resiquimod orista TLR7/8 (R848) durante la notte.
- Centrificare le piastre e recuperare il supernatale dei TMC e congelarlo per ulteriori analisi. La produzione di citochine sarà valutata utilizzando immunoasisti a base di perline per quantificare simultaneamente citochine solubili multiple utilizzando un citometro a flusso seguendo il protocollo del produttore.
- Valutare la vitalità delle cellule utilizzando un saggio di vitalità cellulare luminescente seguendo il protocollo del produttore. In breve, aggiungere 60 l di soluzione di vitalità cellulare ai pozzi e misurare la luminescenza entro 10 min (acquisizione per 1 s/well).
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Risultati
Per prima cosa abbiamo caratterizzato il profilo immunitario delle cellule presenti nella coltura e analizzato la quantità di TMC. Abbiamo fenotipato i TMC da tonsille con citometria di flusso. Come mostrato nella Figura 1, tutti i principali tipi di cellule immunitarie presenti nei PBMC dal sangue erano rappresentati nei TMC da tonsille. Tuttavia, nei TMC la frequenza di tutti i tipi di cellule, ad eccezione delle cellule B, era inferiore a quella dei PBMC.<...
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Discussione
Le tonsille umane rappresentano un modello ex vivo integrativo e fisiologico per studiare le risposte immunitarie innate nell'interfaccia mucosale, perché imitano il ruolo di un organo linfoide secondario. È interessante notare che la composizione cellulare dei TMC è simile ai PMC e include tutte le principali popolazioni di cellule, anche se la loro percentuale può essere diversa dai PMC dal sangue (Figura 1). Ulteriori popolazioni possono anche essere trovate, come tutte le risposte immuni...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Agence National de la Recherche sur le SIDA et les Hépatites ANRS (J-P. H) per gli esperimenti e la borsa di studio N.B. (AAP 2017 166). N.S. riconosce il sostegno dell'ANRS per la borsa di studio (AAP 2016 1), l'Organizzazione europea di biologia molecolare EMBO for Fellowship (LT 834 2017), il programma di finanziamento per le startup "Baustein" della Facoltà di Medicina dell'Università di Ulm (LSBN.0147) e la Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (SM 544/1).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Griglia in acciaio 10 maglie - 1910 &MICRO; m | Dutscher | 198586 | Per inserire il filtro a celle Cellector |
| 60 maglie griglia in acciaio - 230 µ m | Dutscher | 198591 | Mettere nel filtro cellulare Cellector |
| 70 µ m bianco Filtri cellulari ClearLine | Dutscher | 141379C | |
| Detergente Anios Excell D | Dutscher | 59852 | Detergente |
| Soluzione antibiotica, 100x | Thermo Fisher | 15140122 | 100 U/mL Penicilium e 100 μ g/mL Streptomicina - da aggiungere ai terreni di coltura |
| BD FalconTM Provette a fondo tondo, 5 mL | BD Biosciences | 352063 | FACS Provette |
| Filtro cellulare Cellector, diametro 85 mL e 37 mm | Dutscher | 198585 | |
| CellTiter-Glo (CTG) Saggio di vitalità cellulare luminescente | Promega | G7572 | |
| Centrifuga 5810 R | Eppendorf | ||
| Provette coniche Falcon 50 mL | Dutscher | 352070 | |
| Pinzette curve | Dutscher | 711200 | |
| Dimetil solfossido (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | Senza calcio e magnesio |
| EnVision | PerkinElmer | Misura la luminescenza | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Da aggiungere ai terreni di coltura | ||
| Etichette di fluorescenza anticorpi | Vedere la Tabella 1 | ||
| Pestello in vetro | Dutscher | 198599 | |
| Hepes (1 M) | Thermo Fisher | 15630056 | Utilizzabile in incubatore da 20 mM |
| LEGENDplex Human Anti-Virus Response Panel | BioLegend | 740390 | Immunodosaggio a base di perle |
| Lymphoprep | StemCell | 7801 | Mezzo gradiente di densità |
| Mr. Frosty contenitore | Thermo Fisher | 5100-0001 | Contenitore per congelamento lento |
| Pierce 16% Formaldeide (p/v), senza metanolo | Thermo Fisher | 28908 | |
| Resiquimod (R848) | InvivoGen | tlrl-r848 | TLR7/8 agonista |
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| SPL Piastra per colture cellulari, 150 mm x 25 mm (SPL150) | Dutscher | 330009 | |
| Lama chirurgica sterile N° 23 | Dutscher | 132523 | |
| UltraComp eBeads Perline di compensazione | Thermo Fisher | 01-2222-41 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | Per fare il tampone di lavaggio in PBS |
Riferimenti
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