Analisi dei difetti cardiaci congeniti negli embrioni dei topi utilizzando metodi istologici qualitativi e quantitativi

Summary

In questo protocollo, descriviamo le procedure per analizzare qualitativamente e quantitativamente i fenotipi dello sviluppo nei topi associati a difetti cardiaci congeniti.

Abstract

I difetti cardiaci congeniti (CHD) sono il tipo più comune di difetto alla nascita nell'uomo, che colpisce fino all'1% di tutte le nascite vive. Tuttavia, le cause alla base della CHD sono ancora poco conosciute. Il topo in via di sviluppo costituisce un modello prezioso per lo studio della CHD, perché i programmi di sviluppo cardiaco tra topi e esseri umani sono altamente conservati. Il protocollo descrive in dettaglio come produrre embrioni di topo dello stadio gestazionale desiderato, metodi per isolare e preservare il cuore per l'elaborazione a valle, metodi quantitativi per identificare i tipi comuni di CHD mediante istologia (ad esempio, setto ventricolare difetti, difetti del setto atriale, dotto brevettato arteriosus) e metodi di storitomorfometria quantitativa per misurare i fenotipi comuni della compattazione muscolare. Questi metodi articolano tutti i passaggi coinvolti nella preparazione, raccolta e analisi dei campioni, consentendo agli scienziati di misurare correttamente e riproducibilmente la CHD.

Introduction

Le CHD sono il tipo più comune di difetto alla nascita nell'uomo e sono la principale causa di decessi correlati ai difetti alla nascita^1,2,3,4,5,6. Anche se circa il 90% dei neonati sopravvive alla CHD, è spesso associata a una significativa morbilità e interventi medici nel corso degli anni, imponendo un pesante onere alla vita dei pazienti e al sistema sanitario^7,8,9,

Protocol

Tutti gli animali utilizzati negli esperimenti citati in questo documento sono stati trattati utilizzando le linee guida per la cura degli animali del Michigan State University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Accoppiamento a tempo di topi C57BL6/J per la produzione di embrioni

1. Una volta che i topi hanno raggiunto l'età riproduttiva (6-8 settimane), li mettono insieme in formato di allevamento degli harem (cioè due femmine per un maschio). Prepararli per l'allevamento a volte nel pomeriggio o la sera.
   NOTA: I topi spesso si riproducono entro 1 h dopo che le luci sono state spente all'interno della loro st....

Results

L'indice di compattazione muscolare è stato confrontato tra cuori che si sviluppano in due ambienti diversi, un controllo e un gruppo sperimentale. Questi protocolli sono stati utilizzati per analizzare quantitativamente la compattazione del tessuto muscolare, che ha permesso l'analisi statistica. La compattazione muscolare ha dimostrato di essere significativamente ridotta nei cuori sperimentali rispetto agli embrioni che si sono sviluppati in condizioni non sperimentali.

Discussion

Questo protocollo esplora le tecniche coinvolte nell'analisi dello sviluppo cardiaco nei cuori embrionali. Alcune limitazioni di questo metodo sono la destrezza fisica richiesta per le tecniche preparatorie, che possono richiedere pratica, e abilità con l'imaging al microscopio. Se le fette ottenute al criostato sono disordinate, la colorazione ematossialina ed eosina non sarà chiara, o se le immagini scattate al microscopio hanno scarsa illuminazione, il metodo utilizzato con ImageJ non funzionerà. Una limitazione della.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Provette coniche da 15 mLFisher	Scientific	# 1495970C
C57BL/6J Topi	Jackson Labs	C57BL/6J - stock 000664
Barattoli per colorazione Coplin (x6)	VWR Scientific	# 25457-006
Vetrini coprioggetti 24X50MM #1.5	VWR Scientific	# 48393-241
Criostato - Leica CM3050S	Leica	N/A
Fisher	Scientific	# 50930381
Dumont #5 - Pinze fini (x2)	Strumenti per la scienza fine	# 11254-20
Eosina Y Solution	Millipore Sigma	# HT110116-500ML
Alcool etilico (puro, 200 proof)	Fisher Scientific	# BP2818-500
Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)	Millipore Sigma	# E9884-100G
Eukitt	Millipore Sigma	# 03989-100ML
Forbici fini	Strumenti di scienza	fine # 14060-10
Stereomicroscopio fluorescente Leica M165 FC	Leica	N / A
Glycine	Millipore Sigma	# 410225-250G
Graefe Forcipe	Strumenti di scienza fine	# 11052-10
Graphpad Prism 8 Software	Graphpad
ImageJ Software	ImageJ
Kimwipes	Fisher Scientific	# 06666A
Soluzione di ematossilina di Mayer	Millipore Sigma	# MHS16-500ML
Puntale/i per micropipette - p200	Fisher Scientific	# 02707448
Microsoft Excel Software	Microsoft
OCT Compound	VWR Scientific	# 102094-106
Olympus CkX53 Microscopio	Olympus
Pennelli (almeno 2)
Paraformaldeide	VWR Scientific	# 0215014601	Trasformare in soluzione al 4% (disciolto in PBS)
Pipetta/e PasteurFisher	Scientific	# 13-711-7M
Penicillina-Streptomicina	ThermoFisher Scientific	# 15140122
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	ThermoFisher Scientific	# 70011044	Diluire da 10x a 1x prima di utilizzare
Scale	Mettler Toledo	# MS1602TS
Scale	Mettler Toledo	# MS105
Bisturi Handle #3	VWR Scientific	# 10161-918
Lame per bisturi	VWR Scientific	# 21909-612
Stampo quadrato	VWR Scientific	# 100500-224	Per stampi OCT
Saccarosio	Millipore Sigma	# S9378-500G
Superfrost Plus Slides	Fisher Scientific	# 1255015
Forbici chirurgiche	Fine Science Tools	# 14002-14
Lame per microtomo monouso Tissue-Tek Accu-Edge	VWR Scientific	# 25608-964
Bilancia da viaggio	Acculab	VIC 5101
Xilene	Millipore Sigma	214736-1L