Articolo metodologico

Convenzionale BODIPY Coniugato per la microscopia a super-risoluzione a celle vive e il tracciamento a singola molecola

DOI:

10.3791/60950

⸱

8 giugno 2020

 ,  ,  , 
1School of Physics and Astronomy, University of Minnesota, Twin Cities, Physics and Nanotechnology (PAN), 2Middlebury College

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I coniugati BODIPY convenzionali possono essere utilizzati per la microscopia per la localizzazione a singola molecola a cellule vive (SMLM) attraverso lo sfruttamento dei loro dimeri di stato del suolo con formazione transitoria e spostata verso il rosso. Vi presentiamo un protocollo SMLM ottimizzato per tracciare e risolvere i lipidi neutri subcellulari e gli acidi grassi nelle cellule viventi di mammiferi e lieviti alla scala nanoscopica della lunghezza.

Abstract

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Le tecniche di microscopia per localizzazione a singola molecola (SMLM) superano il limite di diffrazione ottica della microscopia a fluorescenza convenzionale e possono risolvere le strutture intracellulari e la dinamica delle biomolecole con precisione di 20 nm. Un prerequisito per SMLM sono i fluorofori che passano da uno stato scuro a uno stato fluorescente per evitare la sovrapposizione spatio-temporale delle loro funzioni di diffusione dei punti in ciascuna delle migliaia di fotogrammi di acquisizione dei dati. I BODIPY sono coloranti consolidati con numerosi coniugati utilizzati nella microscopia convenzionale. La formazione transitoria di dimeri a stato del suolo BODIPY (DII)con spostamento rosso determina l'emissione luminosa di una singola molecola che consente la microscopia per la localizzazione a singola molecola (SMLM). Qui presentiamo un protocollo semplice ma versatile per SMLM con tradizionali coniugati BODIPY in cellule di lievito vivo e mammiferi. Questa procedura può essere utilizzata per acquisire immagini a super-risoluzione e per tenere traccia di singoli stati BODIPY-DII per estrarre informazioni spatio-temporali di BODIPY. Applichiamo questa procedura per risolvere le goccioline di lipidi (LD), gli acidi grassi e i lisosomi nelle cellule di lievito e mammiferi viventi su scala nanoscopica. Inoltre, dimostriamo la capacità di imaging multicolore con coloranti BODIPY se usato in combinazione con altre sonde fluorescenti. I nostri risultati rappresentativi mostrano la distribuzione spaziale differenziale e la mobilità degli acidi grassi BODIPY e dei lipidi neutri nel lievito in condizioni di alimentazione e digiuno. Questo protocollo ottimizzato per SMLM può essere utilizzato con centinaia di coniugati BODIPY disponibili in commercio ed è una risorsa utile per studiare i processi biologici su scala nanometrica ben oltre le applicazioni di questo lavoro.

Introduzione

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Le tecniche di microscopia di microscopia di localizzazione a singola molecola (SMLM) come la microscopia stocastica della ricostruzione ottica (STORM) e la microscopia di localizzazione foto-attivata (PALM) sono emerse come metodi per generare immagini super-risoluzione con informazioni oltre il limite di diffrazione ottica di Abbe1,2 e per monitorare la dinamica delle singole biomolecole3,4. Uno dei requisiti per le sonde compatibili con SMLM è la capacità di controllare il numero di fluorofori attivi in qualsiasi momento per evitare la sovrapposizione spaziale delle loro funzioni di diffusione punti (PSF). In ognuna delle migliaia di frame di acquisizione dati, la posizione di ogni fluoroforo fluorescente fluorescente viene quindi determinata con una precisione di 20 nm adattando la funzione di diffusione dei punti corrispondente. Tradizionalmente, l'oscillazione dei fluorofori è stata controllata attraverso il fotoscambio stocastico1,2,5 o intrinseco indotto chimicamente6. Altri approcci includono l'attivazione indotta di fluorogeni al momento del legame transitorio con una proteina attivante fluorogena7,8 e l'annullamento programmabile di oligomeri di DNA etichettati nella fluorescenza totale della riflessione interna (TIRF) o nell'espirazione del foglio chiaro9. Recentemente, abbiamo segnalato una nuova e versatile strategia di etichettatura per SMLM10 in cui in precedenza segnalato stati dimeric dimeerici spostati in rosso (DII)di di-pyromethane di boro convenzionale (BODIPY) coniugati11,12,13 sono transitoriamente formando e diventare specificamente eccitato e rilevato con lunghezze d'onda rosso-spostato.

I BODIPY sono coloranti ampiamente utilizzati con centinaia di varianti che etichettano specificamente compartimenti subcellulari e biomolecole14,15,16. Grazie alla loro facilità d'uso e all'applicabilità nelle cellule viventi, le varianti BODIPY sono disponibili in commercio per la microscopia a fluorescenza convenzionale. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato e ottimizzato su come le centinaia di coniugati BODIPY disponibili in commercio possono essere utilizzati per SMLM a cellule vive. Ottimizzando la concentrazione dei monomeri BODIPY e ottimizzando i poteri laser di eccitazione, i parametri di imaging e analisi dei dati, le immagini di alta qualità della super-risoluzione e i dati di tracciamento delle singole molecole si ottengono nelle cellule viventi. Se utilizzato a bassa concentrazione (25-100 nM), i coniugati BODIPY possono essere utilizzati simultaneamente per SMLM nel canale rosso e per la microscopia a fluorescenza convenzionale correlata nel canale di emissione convenzionale. I dati ottenuti a singola molecola possono essere analizzati per quantificare l'organizzazione spaziale delle strutture immobili e per estrarre gli stati diffusivi delle molecole nelle cellule viventi17. La disponibilità di sonde BODIPY sia in forma verde che rossa consente l'imaging multicolore se utilizzato nella giusta combinazione con altri fluorofori compatibili.

In questo rapporto, forniamo un protocollo ottimizzato per l'acquisizione e l'analisi dei dati SMLM delle cellule vive utilizzando BODIPY-C12, BODIPY (493/503), BODIPY-C12 rosso e lysotracker-verde in più colori. Risolviamo gli acidi grassi e i lipidi neutri in lieviti vivi e cellule di mammiferi con risoluzione di 30 nm. Dimostriamo inoltre che le cellule di lievito regolano la distribuzione spaziale degli acidi grassi aggiunti esternamente a seconda del loro stato metabolico. Troviamo che gli acidi grassi BODIPY aggiunti (FA) si localizzano al reticolo endoplasmico (ER) e alle goccioline di lipidi (LD) in condizioni di alimentazione, mentre i cluster BODIPY-FAs formano cluster non-LD nella membrana plasmatica al digiuno. Estendiamo ulteriormente l'applicazione di questa tecnica per immaginare lisosomi e LD nelle cellule di mammiferi viventi. Il nostro protocollo ottimizzato per SMLM che utilizza coniugati BODIPY convenzionali può essere una risorsa utile per studiare i processi biologici su scala nanometrica con la miriade di coniugati BODIPY disponibili.

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Protocollo

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NOTA: Per la clonazione di lievito e l'etichettatura endogena si prega di fare riferimento alla nostra recente pubblicazione10.

1. Preparazione di campioni di cellule di lievito per l'imaging

  1. Preparare una coltura liquida durante la notte di un ceppo di lievito w303. Utilizzando un bastone di legno sterile, individuare una piccola quantità di cellule di lievito da una piastra di agar contenente lievito estratto–peptone-dextrose in un tubo di coltura con 2 mL di mezzo di dextrose (SCD) sintetico. Incubare il tubo per una notte in un'incubatrice acquosa a 270 giri/min e a 30 gradi centigradi.
  2. Eseguire una diluizione 1:50 mattina delle cellule in SCD. Continuare a coltivare le cellule diluite per 4 h a 30 gradi centigradi in un incubatore di 270 rpm, permettendo alle cellule di crescere in fase esponenziale e di raggiungere una densità ottica (OD) di 0,6 dollari.
    NOTA: La procedura può variare qui a seconda di quale stato metabolico viene studiato. BODIPY jujugates non richiede cellule nella fase di crescita esponenziale. Tuttavia, essere consapevoli dell'autofluorescenza dalle cellule morte durante la fase stazionaria, in quanto può causare un segnale di fondo troppo forte per analizzare singoli emettitori BODIPY-DII.
  3. Per studiare le cellule di digiuno, far crescere la coltura del lievito per 2 giorni senza scambio di media.
  4. A 30 minuti prima di placcare le cellule, incubare una vetrate camerata con 80 -L di 0,8 mg/mL sterile Concanavalin A (ConA) in deionizzato H2O a temperatura ambiente. Dopo 30 min, lavare la copertina tre volte con idionizzato H2O.
  5. A 30 minuti prima dell'imaging, pipette le cellule sulla copertina camerata, con il volume corretto di SCD fresco per raggiungere una densità ottica di 0,12 dollari (tipicamente 60 ll di coltura di lievito a OD 0,6 in 240L SCD). Lasciate che le cellule si stabiliscano e aderiscano alla superficie ConA per 30 min.
  6. Aggiungere il coniugato BODIPY desiderato direttamente alla copertina camerata ad una concentrazione finale di 100 nM.
    NOTA: può essere necessario un esperimento di ottimizzazione della concentrazione BODIPY a seconda della densità locale BODIPYs in un particolare compartimento cellulare.

2. Preparazione di cellule mammaliane per l'imaging SMLM

  1. Mantenere le cellule U2OS dei mammiferi in DMEM non fluorescente con siero bovino fetale 10%, 4 mM di glutammina, 1 mM di piratova di sodio e 1% di penicillina-streptomicina antibiotici in una fiaschetta T25.
    NOTA: Le cellule possono anche essere mantenute in DMEM con siero bovino fetale 10% e 1% di antibiotici penicillina-streptomicina, tuttavia, il mezzo deve essere scambiato prima di imaging con una soluzione non autofluorescente.
  2. Dividere le cellule al 70-80% di confluenza 1:5 in un unico pozzo di una piastra di 8 pozze. Coltura le cellule nella piastra di 8 pozze per 12 a 24 h prima dell'imaging.
  3. Aggiungere BODIPY-C12, LysoTracker Green o qualsiasi altro ricomporre BODIPY ad una concentrazione finale di 100 nM (soluzioni di stoccaggio in solfuro dimetilo [DMSO]) 10 min prima dell'imaging. Questo tempo può variare in base all'esperimento desiderato.
    NOTA: L'imaging può essere eseguito a temperatura ambiente (23 gradi centigradi) utilizzando una soluzione di imaging a celle vive. Tuttavia, l'imaging a 37 e 5% di CO2 con antibiotici non fluorescenti DMEM mescolati con siero bovino fetale al 10%, 4 mM glutammina, 1 mM di pyruvate di sodio e 1% di penicillina-streptomicina antibiotici è preferibile per mantenere le cellule più vicine a condizioni fisiologiche e per fare conclusioni biologiche.

3. Preparazione dell'attrezzatura

  1. Montare i set di filtri appropriati nel percorso di emissione in base al colore di emissione di BODIPY utilizzato.
    NOTA: uno specchio dicroico quad-band (zt/405/488/561/640rdc) separa prima l'eccitazione dalla luce di emissione. Le emissioni verdi (525 nm) e le emissioni rosse (595 nm) vengono quindi suddivise da uno splitter a passaggio lungo dichroic (T562lpxr) seguito da filtri a banda-pass ET525/50 nel canale verde e da ET 595/50 nel canale rosso. I due canali vengono quindi proiettati in aree diverse dello stesso chip della fotocamera. Analogamente, le emissioni rosse (595 nm) e l'emissione di colore troppo rosso vengono prima divise da uno splitter a passaggio lungo dichroic (FF652-Di01) seguito dai filtri a banda-pass ET 610/75 nel rosso e ff731/137 nel canale di colore troppo rosso.
  2. Accendere il microscopio, fase microscopio, laser (488 nm, 561 nm) e fotocamera. Qui vengono utilizzati un microscopio invertito con un sistema di messa a fuoco perfetto e una telecamera EMCCD raffreddata a -68 gradi centigradi.
  3. Aggiungere una goccia di olio di immersione sull'obiettivo del microscopio.
  4. Aprire il software Hal4000 (vedere la Tabella dei materiali) che controlla la luce LED per l'imaging del campo luminoso, le potenze laser, le persiane laser e le impostazioni della fotocamera per l'imaging. Impostare il guadagno EMCCD su 30 e la temperatura della fotocamera a -68 gradi centigradi. Preparare la fotocamera e il software corrispondente per registrare i filmati a 20 Hz.
    NOTA: Questa tecnica si applica a qualsiasi microscopio a campo largo in grado di microscopia di localizzazione foto-attivata (PALM) e imaging stocastico della microscopia ottica (STORM). Il software corrispondente può variare.
  5. Accendere il riscaldatore a fase del microscopio e impostarlo ad una temperatura di 37 gradi centigradi e a un livello di CO2 del 5%. Regolare il collare di correzione obiettivo di conseguenza.
  6. Montare il campione sullo stadio del microscopio e mettere a fuoco fino a quando il sistema di messa a fuoco si impegna. Spostare lo stage utilizzando il controller dello stage finché le celle integre non vengono visualizzate nel campo visivo.
    NOTA: Per l'imaging con celle di lievito a temperatura ambiente, non è necessario accendere il riscaldatore o il controllo CO2.
  7. Accendere i laser appropriati per l'eccitazione di monomeri e dimeri. Per BODIPY verde o LysoTracker verde, usiamo un laser da 561 nm per eccitare gli stati DII per SMLM e un laser da 488 nm per eccitare i monomeri per la fluorescenza convenzionale.
    NOTA: Per IL rosso BODIPY, utilizzare un laser da 640 nm per eccitare gli stati DII per SMLM e un laser a 561 nm per eccitare i monomeri per la fluorescenza convenzionale. Per il rosso BODIPY, regola i poteri laser da 561 nm e 640 nm per visualizzare la fluorescenza di massa nel canale rosso e le esplosioni di una singola molecola nel canale rosso. La potenza tipica per 561 nm è di 0,06 W/cm2 e 5 kW/cm2 per 640 nm. Per il verde BODIPY, si aspettano di vedere anche la fluorescenza convenzionale nel canale di emissione verde sotto l'eccitazione di 561 nm. Per il rosso BODIPY, aspettatevi di vedere la fluorescenza convenzionale nel canale rosso sotto l'eccitazione di 640 nm. Questo segnale deriva dall'emissione anti-Stokes, che diventa utile per le immagini di co-localizzazione monome/dimer con eccitazione laser continua.

4. Acquisizione dei dati

  1. Caricare le sequenze dell'otturatore laser per l'eccitazione di monomeri e dimeri.
    NOTA: In genere utilizziamo nove frame di eccitazione a singola molecola a 561 nm seguiti da un telaio di eccitazione convenzionale a 488 nm. Ciò offre un segnale di fluorescenza convenzionale più luminoso ed evita la fuoriuscita di un altro fluoroforo eccitabile da 488 nm come la proteina fluorescente verde (GFP) nel canale rosso di rilevamento di singole molecole nelle applicazioni di imaging multicolore. In alternativa, accendere continuamente il laser da 561 nm e fare affidamento sull'emissione anti-Stokes per le immagini convenzionali nel canale a lunghezza d'onda più breve.
  2. Sintonizzare i poteri laser in modo che i raffiche di fluorescenza a singola molecola vengano rilevati nel canale di emissione con emissioni in rosso sotto l'eccitazione di 561 nm, e la fluorescenza convenzionale appare nel canale di emissione verde con eccitazione di 488 nm. Le potenze laser tipiche del laser da 561 nm saranno di circa 0,8-1 kW/cm2 per SMLM e 0,035-0,07 W/cm2 per il laser da 488 nm nella modalità di imaging a fluorescenza convenzionale.
  3. Scegli una cartella di destinazione per i filmati e registra 5.000-20.000 fotogrammi di acquisizione per raccogliere abbastanza localizzazioni per ricostruire immagini con super risoluzione.
  4. Passare a diversi campi di visualizzazione e ripetere i passaggi precedenti per raccogliere dati da più celle.

5. Analisi dei dati e tracciamento di una sola molecola

  1. Caricare il filmato in un software di analisi SMLM.
    NOTA: è possibile utilizzare qualsiasi software18. Usiamo INSIGHT (vedi la Tabella dei Materiali)e convalidiamo in modo incrociato i risultati utilizzando il plugin ThunderSTORM19 per imageJ (Fiji).
  2. Visualizzate visivamente il filmato e regolate le impostazioni di contrasto in modo che sia visibile la fluorescenza a singola molecola. Se necessario, limitare la regione o l'intervallo di fotogrammi per l'analisi dei dati SMLM se parti del campione sono in continua einterità.
  3. Impostare i parametri di identificazione a singola molecola per il montaggio con FPF gaussiani 2D (ROI: 7 x 7 pixel con dimensione pixel 160 nm, larghezza 260-650 nm, altezza > 50 fotoni). Esaminare visivamente alcuni fotogrammi di esempio per controllare i parametri di identificazione e per rilevare in modo affidabile le esplosioni di fluorescenza a singola molecola (vedere la figura 1C).
    NOTA: alcuni parametri di identificazione come altezza e larghezza possono essere leggermente regolati per ottimizzare il riconoscimento dei segnali di fluorescenza a singola molecola percepiti visivamente.
  4. Eseguire l'analisi delle immagini SMLM con i parametri di identificazione ottimizzati e quindi eseguire il rendering di ogni singola molecola come un gaussiano 2D la cui larghezza è ponderata dalla radice quadrata inversa del numero rilevato di fotoni.
  5. Valutare la qualità dei dati. Usa intervalli di fotogrammi limitati per osservare distribuzioni di singole molecole in istanze più specifiche nel tempo. Ciò può spiegare lo spostamento di organelle durante l'acquisizione dei dati.
  6. Per analizzare ulteriormente la distribuzione spaziale e la dinamica delle distribuzioni di molecole, esportare l'elenco delle molecole ottenute contenente le coordinate, i fotogrammi dell'aspetto, i fotoni, le larghezze e le altezze delle localizzazioni. Importare l'elenco delle molecole in procedure di analisi scritta personalizzate.
  7. Per ottenere informazioni spaziali sulla distribuzione della singola molecola, calcolare la funzione di distribuzione radiale (r), che rappresenta la densità delle localizzazioni in funzione della distanza radiale20. Per ottenere il valore di z(r), calcolare le distanze univoche per coppie di tutte le localizzazioni, costruire l'istogramma con i contenitori centrati a ri con altezza H(ri) e con una larghezza dr e dividere per 2 orisdr; (z (z(ri) : H(ri)/(ri-dr)2-ri2). La funzione di distribuzione radiale può quindi essere utilizzata per quantificare e confrontare il grado di clustering e la dimensione caratteristica dei cluster.
  8. Per ottenere informazioni dinamiche sulla diffusione delle molecole, collegare le localizzazioni che appaiono ad esempio entro 3 pixel (0,48 m) in fotogrammi consecutivi di acquisizione dati per creare tracce di singole molecole.
    NOTA: La distanza di collegamento dipenderà dalla diffusione delle molecole e dalla densità delle localizzazioni. La distanza massima di collegamento può essere stimata analizzando la densità delle localizzazioni in ogni fotogramma21,22. È stata determinata la densità media di 0,043 localizzazioni per2 quindi un raggio di 0,48 m era all'interno di una densità sufficientemente bassa da garantire che molecole diverse non fossero collegate tra loro.
  9. Calcolare la media degli spostamenti per tempi di ritardo diversi, ovvero l'intervallo da più tracce della durata di almeno tre volte per creare uno spostamento al quadrato medio (MSD) rispetto al tracciato. Montare la curva MSD contro quella zz con l'equazione MSD , 4D, 2 per calcolare il coefficiente medio di diffusione D3.

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Risultati

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Qui, presentiamo un campione ottimizzato preparazione, acquisizione dei dati e procedura di analisi per SMLM utilizzando coniugato BODIPY in base al protocollo di cui sopra (Figura 1A). Per dimostrare un esempio del flusso di lavoro per l'acquisizione e l'analisi dei dati SMLM, utilizziamo BODIPY (493/503) in lievito per risolvere i LD al di sotto del limite di diffrazione ottica (Figura 1B-F). Esempi delle diverse modalità di imaging multicolor...

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Discussione

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In questo protocollo, abbiamo dimostrato come i coniugati BODIPY convenzionali possono essere utilizzati per ottenere immagini SMLM con un miglioramento dell'ordine di grandezza nella risoluzione spaziale. Questo metodo si basa sullo sfruttamento degli stati DII segnalati in precedenza di colori ROSSI di coloranti BODIPY convenzionali, che si formano transitoriamente attraverso incontri bimolecolari. Questi stati possono essere specificamente eccitati e rilevati con lunghezze d'onda spostate verso il rosso e s...

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Dichiarazioni

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Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

Ringraziamenti

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La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta dal National Institute of General Medical Sciences dei National Institutes of Health con il numero di premio R21GM127965.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
BODIPY C12ThermoFisherD3822Analogico degli acidi grassi verdi
BODIPY C12 RossoThermoFisherD3835Analogico degli acidi grassi rossi
BODIPY(493/503)ThermoFisherD3922Marcatore lipidico neutro
Concanavalin ASigma-AldrichC2010Immobilizzazione cellulare sulla superficie del vetro
Drop-out Mix Completo senza base azotataAminoacidi biologici statunitensiD9515per destrosio SCD
Sigma-AldrichG7021per SCD
Otto pozzettiCellvisC8-1.58-NVetri coprioggetto camerati
a otto pozzetti, Lb-Tek IISigma-AldrichVetri coprioggetti camerati
ET525 / 50ChromaFiltro passa-banda
ET595 / 50ChromaFiltro passa-banda
ET610/75ChromaFiltro passa-banda
Fetale Siero bovino fetale (FBS)Gibco26140079Serum
FF652SemrockBeam splitter
FF731/137passa-bandaSemrock
FluoroBrite DMEMThermoFisherA1896701Terreno
di coltura cellulareHal4000Zhuang Lab, UniversitàSoftware di acquisizione dati
Ixon89Ultra DU-897UAndorFotocamera EMCCD per il rilevamento di fotoni
Laser 405, 488, 561, 640 nmCW-OBISLaser per l'eccitazione
Insight3Zhuang Lab, UniversitàSoftware di localizzazione di singole molecole
L-GlutamminaGibco25030-081Amminoacido necessario per la coltura cellulare
imaging di cellule viveThermoFisherA14291DJTampone di imaging
Lysotracker GreenThermoFisherL7526Marcatore di lisosoma a base di bodipia
Cellule ATCC U2OS di mammifero (Manassas, VA)Dr. Jochen Mueller (Università del Minnesota)
Nikon-CFI Apo 100 1.49 N.ANikonImmersione in olio obiettivo
Penicillina streptomicinaGibco15140-122Antibiotici
Piruvato di sodioGibco11360-070Integratore per colture cellulari
T562lpxrChromaBeam splitter
Tripsina-EDTAGibco15400-054Dissociazione della cellula aderente
Ceppo W303 MATaHorizon-DharmaconYSC1058Ceppo di lievito parentale
Lievito Base di azotoSigma-AldrichY1250Base di azoto senza aminoacidi
zt405/488/561/640rdcChromaQuadband specchio dicroico
Fonte di carbonio Filtro di Harvard di Harvard Soluzione di

Riferimenti

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