Articolo metodologico

Convenzionale BODIPY Coniugato per la microscopia a super-risoluzione a celle vive e il tracciamento a singola molecola

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DOI:

10.3791/60950

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8 giugno 2020

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1School of Physics and Astronomy, University of Minnesota, Twin Cities, Physics and Nanotechnology (PAN), 2Middlebury College

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

I coniugati BODIPY convenzionali possono essere utilizzati per la microscopia per la localizzazione a singola molecola a cellule vive (SMLM) attraverso lo sfruttamento dei loro dimeri di stato del suolo con formazione transitoria e spostata verso il rosso. Vi presentiamo un protocollo SMLM ottimizzato per tracciare e risolvere i lipidi neutri subcellulari e gli acidi grassi nelle cellule viventi di mammiferi e lieviti alla scala nanoscopica della lunghezza.

Abstract

Le tecniche di microscopia per localizzazione a singola molecola (SMLM) superano il limite di diffrazione ottica della microscopia a fluorescenza convenzionale e possono risolvere le strutture intracellulari e la dinamica delle biomolecole con precisione di 20 nm. Un prerequisito per SMLM sono i fluorofori che passano da uno stato scuro a uno stato fluorescente per evitare la sovrapposizione spatio-temporale delle loro funzioni di diffusione dei punti in ciascuna delle migliaia di fotogrammi di acquisizione dei dati. I BODIPY sono coloranti consolidati con numerosi coniugati utilizzati nella microscopia convenzionale. La formazione transitoria di dimeri a stato del suolo BODIPY (DII)con spostamento rosso determina l'emissione luminosa di una singola molecola che consente la microscopia per la localizzazione a singola molecola (SMLM). Qui presentiamo un protocollo semplice ma versatile per SMLM con tradizionali coniugati BODIPY in cellule di lievito vivo e mammiferi. Questa procedura può essere utilizzata per acquisire immagini a super-risoluzione e per tenere traccia di singoli stati BODIPY-DII per estrarre informazioni spatio-temporali di BODIPY. Applichiamo questa procedura per risolvere le goccioline di lipidi (LD), gli acidi grassi e i lisosomi nelle cellule di lievito e mammiferi viventi su scala nanoscopica. Inoltre, dimostriamo la capacità di imaging multicolore con coloranti BODIPY se usato in combinazione con altre sonde fluorescenti. I nostri risultati rappresentativi mostrano la distribuzione spaziale differenziale e la mobilità degli acidi grassi BODIPY e dei lipidi neutri nel lievito in condizioni di alimentazione e digiuno. Questo protocollo ottimizzato per SMLM può essere utilizzato con centinaia di coniugati BODIPY disponibili in commercio ed è una risorsa utile per studiare i processi biologici su scala nanometrica ben oltre le applicazioni di questo lavoro.

Introduzione

Le tecniche di microscopia di microscopia di localizzazione a singola molecola (SMLM) come la microscopia stocastica della ricostruzione ottica (STORM) e la microscopia di localizzazione foto-attivata (PALM) sono emerse come metodi per generare immagini super-risoluzione con informazioni oltre il limite di diffrazione ottica di Abbe1,2 e per monitorare la dinamica delle singole biomolecole3,4. Uno dei requisiti per le sonde compatibili con SMLM è la capacità di controllare il numero di fluorofori attivi in qualsiasi momento per evitare la sovrapposizio....

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Protocollo

NOTA: Per la clonazione di lievito e l'etichettatura endogena si prega di fare riferimento alla nostra recente pubblicazione10.

1. Preparazione di campioni di cellule di lievito per l'imaging

  1. Preparare una coltura liquida durante la notte di un ceppo di lievito w303. Utilizzando un bastone di legno sterile, individuare una piccola quantità di cellule di lievito da una piastra di agar contenente lievito estratto–peptone-dextrose in un tubo di coltura con 2 mL di mezzo di dextrose (SCD) sintetico. Incubare il tubo per una notte in un'incubatrice acquosa a 270 giri/min e a 30 gradi centigradi.
  2. Esegui....

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Risultati

Qui, presentiamo un campione ottimizzato preparazione, acquisizione dei dati e procedura di analisi per SMLM utilizzando coniugato BODIPY in base al protocollo di cui sopra (Figura 1A). Per dimostrare un esempio del flusso di lavoro per l'acquisizione e l'analisi dei dati SMLM, utilizziamo BODIPY (493/503) in lievito per risolvere i LD al di sotto del limite di diffrazione ottica (Figura 1B-F). Esempi delle diverse modalità di imaging multicolor.......

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Discussione

In questo protocollo, abbiamo dimostrato come i coniugati BODIPY convenzionali possono essere utilizzati per ottenere immagini SMLM con un miglioramento dell'ordine di grandezza nella risoluzione spaziale. Questo metodo si basa sullo sfruttamento degli stati DII segnalati in precedenza di colori ROSSI di coloranti BODIPY convenzionali, che si formano transitoriamente attraverso incontri bimolecolari. Questi stati possono essere specificamente eccitati e rilevati con lunghezze d'onda spostate verso il rosso e s.......

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Dichiarazioni

Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

Ringraziamenti

La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta dal National Institute of General Medical Sciences dei National Institutes of Health con il numero di premio R21GM127965.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
BODIPY C12ThermoFisherD3822Analogico degli acidi grassi verdi
BODIPY C12 RossoThermoFisherD3835Analogico degli acidi grassi rossi
BODIPY(493/503)ThermoFisherD3922Marcatore lipidico neutro
Concanavalin ASigma-AldrichC2010Immobilizzazione cellulare sulla superficie del vetro
Drop-out Mix Completo senza base azotataAminoacidi biologici statunitensiD9515per destrosio SCD
Sigma-AldrichG7021per SCD
Otto pozzettiCellvisC8-1.58-NVetri coprioggetto camerati
a otto pozzetti, Lb-Tek IISigma-AldrichVetri coprioggetti camerati
ET525 / 50ChromaFiltro passa-banda
ET595 / 50ChromaFiltro passa-banda
ET610/75ChromaFiltro passa-banda
Fetale Siero bovino fetale (FBS)Gibco26140079Serum
FF652SemrockBeam splitter
FF731/137passa-bandaSemrock
FluoroBrite DMEMThermoFisherA1896701Terreno
di coltura cellulareHal4000Zhuang Lab, UniversitàSoftware di acquisizione dati
Ixon89Ultra DU-897UAndorFotocamera EMCCD per il rilevamento di fotoni
Laser 405, 488, 561, 640 nmCW-OBISLaser per l'eccitazione
Insight3Zhuang Lab, UniversitàSoftware di localizzazione di singole molecole
L-GlutamminaGibco25030-081Amminoacido necessario per la coltura cellulare
imaging di cellule viveThermoFisherA14291DJTampone di imaging
Lysotracker GreenThermoFisherL7526Marcatore di lisosoma a base di bodipia
Cellule ATCC U2OS di mammifero (Manassas, VA)Dr. Jochen Mueller (Università del Minnesota)
Nikon-CFI Apo 100 1.49 N.ANikonImmersione in olio obiettivo
Penicillina streptomicinaGibco15140-122Antibiotici
Piruvato di sodioGibco11360-070Integratore per colture cellulari
T562lpxrChromaBeam splitter
Tripsina-EDTAGibco15400-054Dissociazione della cellula aderente
Ceppo W303 MATaHorizon-DharmaconYSC1058Ceppo di lievito parentale
Lievito Base di azotoSigma-AldrichY1250Base di azoto senza aminoacidi
zt405/488/561/640rdcChromaQuadband specchio dicroico
Fonte di carbonio Filtro di Harvard di Harvard Soluzione di

Riferimenti

  1. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
  2. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.

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Microscopia di Localizzazione di Singole MolecoleImaging delle Gocce LipidicheTracciamento degli Acidi GrassiImaging di Cellule ViveMicroscopia a FluorescenzaOttimizzazione della Potenza del LaserBODIPY C12

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