Reportiamo un protocollo per la produzione di una membrana lipidica ibrida all'interfaccia acqua/aria doping il bistrato lipidico con molecole di rame (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butil-29H,31H-ftatocianina (CuPc). La membrana lipidica ibrida risultante ha una struttura sandwich lipidica/ CuPc / lipidica. Questo protocollo può anche essere applicato alla formazione di altri nanomateriali funzionali.
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Articolo metodologico
Auto-assemblaggio di membrane lipidiche ibride drogate con molecole organiche idrofobiche presso l'interfaccia acqua/aria
In questo articolo
Sommario
Abstract
Grazie alle loro proprietà uniche, tra cui uno spessore ultratonale (3-4 nm), resistività ultraelevata, fluidità e capacità di auto-assemblaggio, i bistrati lipidici possono essere facilmente funzionalizzati e sono stati utilizzati in varie applicazioni come biosensori e bio-dispositivi. In questo studio, abbiamo introdotto una molecola organica planare: rame (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butil-29H,31H-ftatocianina (CuPc) per drogare le membrane lipidiche. La membrana ibrida CuPc/lipidi si forma all'interfaccia acqua/aria mediante auto-assemblaggio. In questa membrana, le molecole di CuPc idrofobiche si trovano tra le code idrofobiche delle molecole lipidiche, formando una struttura sandwich lipidica/ CuPc / lipidica. È interessante notare che un doppio strato lipidico ibrido stabile all'aria può essere facilmente formato trasferendo la membrana ibrida su un substrato Si. Reportiamo un metodo semplice per incorporare nanomateriali in un sistema di doppio strato lipidico, che rappresenta una nuova metodologia per la fabbricazione di biosensori e biodevice.
Introduzione
Come quadro essenziale delle membrane cellulari, l'interno delle cellule è separato dall'esterno da un sistema di doppio strato lipidico. Questo sistema è costituito da fosfolipidi anfifili, che sono composti da "teste" di estere fosforico idrofilo e acidi grassi idrofobici "code". A causa della notevole fluidità e capacità di auto-assemblaggio dei bistrati lipidici in ambiente acquoso1,2,i bistrati lipidici artificiali possono essere formati utilizzando semplicimetodi 3,4. Vari tipi di proteine di membrana, come canali ionici, recettori di membrana ed enzimi, sono stati incorporati nel bistrato lipidico artificiale per imitare e studiare le funzioni delle membranecellulari 5,6. Più recentemente, i bistrati lipidici sono stati drogati con nanomateriali (ad esempio, nanoparticelle metalliche, grafene e nanotubi di carbonio) per formare membrane ibride funzionali7,8,9,10,11,12,13. Un metodo ampiamente utilizzato per formare tali membrane ibride comporta la formazione di vescicole lipidiche drogate, che contengono materiali idrofobici come le Nanoparticelle7 modificate o i nanotubi di carbonio11, e le vescicole risultanti vengono quindi fuse in bistrati lipidici supportati planari. Tuttavia, questo approccio è complesso e dispendioso in termini di tempo, il che limita i potenziali usi di tali membrane ibride.
In questo lavoro, le membrane lipidiche sono state drogate con molecole organiche per produrre membrane lipidiche ibride che si sono formate all'interfaccia acqua /aria per auto-assemblaggio. Questo protocollo prevede tre fasi: preparazione della soluzione mista, formazione di una membrana ibrida all'interfaccia acqua/aria e trasferimento della membrana su un substrato Si. Rispetto ad altri metodi precedentemente riportati, il metodo descritto qui è più semplice e non richiede una strumentazione sofisticata. Utilizzando questo metodo, le membrane lipidiche ibride stabili per l'aria con un'area più ampia possono essere formate in un tempo più breve. Il nanomateriale utilizzato in questo studio è una molecola organica semiconduttore, rame (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butil-29H,31H-ftatocianina (CuPc), che è ampiamente utilizzata in una serie di applicazioni, tra cui celle solari, fotodetettori, sensori di gas e catalisi14,15. CuPc, una piccola molecola organica con una struttura planare, ha un'alta affinità per le "code" dei fosfolipidi duo alle sue caratteristiche idrofobiche. Altri gruppi hanno riferito che le molecole di CuPc possono auto-assemblarsi su superfici monocristatiche con laformazione di strutture altamente ordinate 16,17. Pertanto, è altamente possibile che le molecole di CuPc possano essere incorporate nei bistrati lipidici attraverso l'auto-assemblaggio.
Forniamo una descrizione dettagliata delle procedure utilizzate per formare membrane e forniamo alcuni suggerimenti per l'attuazione senza intoppi di questa procedura. Inoltre, presentiamo alcuni risultati rappresentativi delle membrane lipidiche ibride e discutiamo le potenziali applicazioni di questo metodo.
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Protocollo
1. Preparazione di una soluzione ibrida
- Lavare quattro flaconcini e tappi a vite monouso da 4 mL (con guarnizioni rivestite in PTFE) in un bagno ad ultrasuoni per 10 minuti in acqua distillata (purificata con un sistema di filtrazione), seguita rispettivamente da etanolo e cloroformio. Asciugare le fiale e i tappi di vetro in un flusso di gas azoto.
- In una scatola di guanti anaerobica, preparare una soluzione di brodo CuPc (10 mg/mL) in una fiala di vetro lavata sciogliendo il CuPc in polvere in cloroformio.
- Filtrare la soluzione CuPc attraverso una membrana in politetrafluoroetilene (PTFE) da 0,2 μm.
- Conservare la soluzione filtrata in una fiala di vetro lavata piena di azoto e sigillare la fiala con parafilm.
- Togliere la soluzione cloroformio 1,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPhPC) acquistata (25 mg/mL) dal frigorifero -80 °C e lasciare riscaldare a temperatura ambiente.
- Mescolare la soluzione DPhPC utilizzando un miscelatore a vortice a 2300 giri/min per 10 s.
- Risciacquare una microsiringa di vetro con cloroformio per 5 volte.
- Trasferire 200 μL della soluzione cloroformio DPhPC in una fiala di vetro prelavati utilizzando la siringa lavata. Evaporare il solvente nel flaconcino con un flusso delicato di azoto.
- Risciacquare una microsiringa di vetro 5 volte con cloroformio.
- Aggiungere 202,6 μL di cloroformio alla fiala di vetro con DPhPC utilizzando la siringa pulita.
- Aggiungere 47,4 μL di soluzione cupc filtrata da 10 mg/mL nella soluzione DPhPC. Il rapporto molare tra DPhPC e CuPc dovrebbe essere 10:1.
- Risciacquare la microsiringa di vetro 5 volte con cloroformio.
- Aggiungere 250 μL di esano alla soluzione utilizzando la siringa. La concentrazione finale della soluzione deve essere di 10 mg/mL.
- Mescolare la soluzione preparata utilizzando un miscelatore a vortice a 2300 giri/min per 10 s.
- Filtrare la soluzione CuPc attraverso una membrana in politetrafluoroetilene (PTFE) da 0,2 μm.
- Sigillare la fiala di vetro con parafilm. Mettilo in una borsa sigillata con presa piena di azoto e posiziona la borsa sigillata in un congelatore a -20 °C.
NOTA: Dopo il passaggio 1.13, il DPhPC e il CuPc sono stati sciolti in un solvente misto, composto da cloroformio ed esano (rapporto volume di 1:1). Inoltre, il rapporto molare tra DPhPC e CuPc non è limitato a 10:1. Con una concentrazione costante di lipidi (10 mg/mL), è possibile utilizzare diversi rapporti molari. Secondo i precedenti risultati sperimentali, un intervallo da 10:1 a 3:1 è preferito per formare una membrana lipidica ibrida di alta qualità.
2. Formazione di una membrana ibrida all'interfaccia acqua/aria
- Tagliare i substrati Si (3 cm x 3 cm) da un wafer Si.
- Pulire i substrati si da 3 cm x 3 cm in un bagno ad ultrasuoni per 10 minuti in acqua purificata, seguiti da etanolo e quindi cloroformio. Trattare il substrato Si con un plasma O2 per 5 minuti per rimuovere i materiali organici adsorbiti dalla superficie e migliorare l'idrofilia.
- Lavare un becher in teflon con un diametro interno di 7,5 cm con acqua purificata che scorre per 3 minuti.
- Mettere il substrato Si pulito nel becher PTFE lavato. Il substrato è inclinato con un angolo di 30° rispetto all'orizzontale.
- Versare una quantità sufficiente di acqua purificata nel becher teflon fino a quando l'intero substrato di Si non viene sommerso.
- Togliere la soluzione ibrida preparata dal congelatore e consentirgli di riscaldarsi a temperatura ambiente.
- Mescolare la soluzione ibrida utilizzando un miscelatore a vortice a 2300 giri/min per 15 s.
- Risciacquare una microsiringa di vetro (50 μL) 5 volte con cloroformio.
- Far cadere 3-5 μL della soluzione ibrida sulla superficie dell'acqua utilizzando la siringa per formare una membrana lipidica ibrida galleggiante.
NOTA: Quando la soluzione viene lasciata cadere, è importante tenere la goccia vicino (meno di 1 cm) alla superficie dell'acqua. Va anche notato che una membrana ibrida monostrato non è visibile ad occhio nudo, ma la membrana ibrida multistrato appare come una sottile pellicola di colore blu. Per trasferire la membrana ibrida multistrato al substrato Si, è importante far cadere la soluzione mista il più vicino possibile al substrato Si.
3. Trasferimento della membrana su un substrato si
- Dopo l'evaporazione del solvente organico (ci saranno meno di 2 secondi), abbassare il livello dell'acqua ad una velocità di 3 mm /min pompando l'acqua attraverso un tubo di gomma che è guidato da una pompa peristaltica, per trasferire la membrana ibrida galleggiante sul substrato Si.
- Al termine del processo di trasferimento (circa 5 minuti), posizionare il substrato Si su un tergicristallo della camera bianca e lasciare evaporare tutta l'acqua residua.
NOTA: Abbassare il livello dell'acqua a una velocità così bassa serve a ridurre al minimo le turbolenze dell'acqua e a proteggere la membrana.
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Risultati
La membrana as-formed ha un colore azzurro uniforme a causa della presenza di molecole cupc. L'area della membrana colorata è normalmente di diversi centimetri quadrati. Nella figura 1A e nella figura 1B, mostriamo un'immagine microscopica e un'immagine al microscopio a forza atomica (AFM) (incluso un profilo di altezza) della membrana lipidica ibrida su un substrato Si. Nell'immagine AFM, la membrana in alto a sinistra è spessa, con uno spessore di 79,4 nm e ch...
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Discussione
Nella soluzione precursore della membrana ibrida, un solvente organico misto (cloroformio ed esano) piuttosto che cloroformio puro viene utilizzato per sciogliere lipidi e CuPc. Se si utilizza il cloroformio puro, la densità della soluzione precursore sarebbe superiore all'acqua. Pertanto, è altamente probabile che la soluzione affondi sul fondo dell'acqua piuttosto che diffondersi sulla superficie dell'acqua. L'aggiunta di esano, un solvente a bassa densità, alla soluzione precursore, assicura che la soluzione galleggi ...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dal programma CREST della Japan Science and Technology Agency (JPMJCR14F3) e grant in-Aids della Japan Society for the Promotion of Science (19H00846 e 18K14120). Questo lavoro è stato in parte svolto presso il Laboratorio di Nanoelettronica e Spintronica, Istituto di Ricerca di Comunicazione Elettrica, Università di Tohoku.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Cloroformio | Wako Prodotti chimici | 033-08631 | |
| CuPc | Sigma-Aldrich | 423165 | |
| DPhPc | Avanti Polar Lipids | 850356C | |
| Fiale di vetro con tappo a vite | Nichiden-Rike Glass Co., Ltd | 6-29801 | |
| Hexane | Wako Prodotti chimici | 084-03421 | |
| Filtri a membrana | Merck Millipore Ltd. | ||
| Micro-siringa | Hamilton | 80530 | |
| Pompa peristaltica | Tokyo Rikakikai Co., Ltd. | ||
| Miscelatore a vortice | Scientific Industries, Inc. | SI-0286 |
Riferimenti
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