L'obiettivo di questo protocollo è quello di analizzare la divisione cellulare nel tessuto intatto mediante microscopia cellulare viva e fissa utilizzando spermatociti meioticiti della Drosophila. Il protocollo dimostra come isolare i testicoli interi e intatti dalle larve di Drosophila e dalle prime pupe, e come elaborarli e montarli per la microscopia.
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Articolo metodologico
Preparazione dei test di Drosophila Larval e Pupal per l'analisi della divisione cellulare in live, tessuto intatto
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'analisi sperimentale delle cellule che si dividono in tessuti e organi vivi e intatti è essenziale per la nostra comprensione di come la divisione cellulare si integra con lo sviluppo, l'omeostasi dei tessuti e i processi della malattia. Gli spermatociti di Drosophila sottoposti a meiosi sono ideali per questa analisi perché (1) testiti di Drosophila interi contenenti spermatociti sono relativamente facili da preparare per la microscopia, (2) le grandi dimensioni degli spermatociti li rendono adatti per l'imaging ad alta risoluzione e (3) potenti strumenti genetici della Drosophila possono essere integrati con l'analisi in vivo. Qui, presentiamo un protocollo facilmente accessibile per la preparazione di interi testicoli da Drosophila terza larve instar e pupe prime. Descriviamo come identificare gli spermatociti meiotici in teste interi preparati e come immaginerli dal vivo per microscopia time-lapse. Vengono inoltre forniti protocolli per la fissazione e l'immunostaining dei teste interi. L'uso di testicoli larvali ha diversi vantaggi rispetto ai protocolli disponibili che utilizzano testicoli adulti per l'analisi dello spermatocite. Ancora più importante, i testicoli larvali sono più piccoli e meno affollati di cellule rispetto ai testicoli adulti, e questo facilita notevolmente l'imaging ad alta risoluzione degli spermatociti. Per dimostrare questi vantaggi e le applicazioni dei protocolli, presentiamo risultati che mostrano la ridistribuzione del reticolo endoplasmico rispetto ai microtubuli del mandrino durante la divisione cellulare in un unico spermatocito immagine di microscopia confocale time-lapse. I protocolli possono essere combinati con l'espressione di qualsiasi numero di proteine fluorescenti o marcatori di orgelli, così come mutazioni genetiche e altri strumenti genetici, rendendo questo approccio particolarmente potente per l'analisi dei meccanismi di divisione cellulare nel contesto fisiologico di interi tessuti e organi.
Introduzione
La divisione cellulare è spesso studiata utilizzando linee cellulari coltivate nella coltura1. Mentre abbiamo acquisito una ricchezza di informazioni e comprensione inestimabili dei meccanismi fondamentali da questi studi2, le cellule coltivate in coltura non possono ricapitolare completamente la fisiologia della divisione cellulare come si verifica in tessuto intatto e vivente. Ad esempio, nei tessuti e negli organi intatti, le cellule devono dividersi nel posto giusto e al momento giusto in modo che le cellule progenie siano correttamente posizionate all'interno del tessuto, in modo che possano sottoporsi a opportune d....
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Protocollo
1. Preparare animali, strumenti e supporti per la dissezione
- Attraversare mosche maschili e femminili per ottenere la progenie del genotipo desiderato. Indicatori transgenici utili per l'identificazione e la messa in scena di spermatociti meiotici includono GFP-tubulina per etichettare il mandrino meiotico e RFP-histone 2A per etichettare i cromosomi8. Utilizzare da cinque a dieci femmine per croce e mantenere le croci sul cibo a mosca standard nelle fiale in un'incubatrice di 25 gradi centigradi fino a quando le larve della terza stella iniziano a strisciare sui lati della fiala (4-5 giorni). Le prime pupe bianche inizieranno a forma....
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Risultati
Quando questo protocollo viene eseguito con successo, i testicoli rimarranno completamente intatti per l'imaging mediante microscopia confocale o altri metodi di microscopia a fluorescenza. Come si è visto nella Figura 3A, l'organizzazione cellulare dei testicoli è preservata e la progressione della differenziazione cellulare da un'estremità del testicolo all'altra, tra cui spermatogonia, spermatociti e spermatidi aploidi è visibile. GFP-tubulina è un marcatore utile per identificare la divi.......
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Discussione
Abbiamo descritto un protocollo per la preparazione di testicoli della Drosophila larvale o pupilla precoce, ottimizzato per l'imaging live a lungo termine della divisione delle cellule di spermatocite. Questo è un metodo potente per l'analisi della divisione cellulare nel contesto fisiologico del tessuto intatto. Il potere di questo metodo è ulteriormente ampliato se combinato con strumenti genetici della Drosophila, come specifiche mutazioni genetiche, soppressione mediata dall'RNAi specifici dei tess.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dai fondi di avviamenti del Dipartimento della Difesa per J.T.S.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Sonda da dissezione da 5" | Fisher | 08-965-A | |
| 5,75" Vetro Pasteur Pipet | Fisher | 13-678-20A | |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Fisher | BP9703-100 | |
| Dumont #5 Pinze | Strumenti per scienze fini | 11252-20 | Forcetti dritti con punte fini |
| Vetrini per microscopio smerigliati | Fisher | 12-544-2 | Vetrini per il montaggio di tessuti fissi, con superficie di scrittura smerigliata |
| Olio di alocarbonio 700 | Sigma | H8898-100 mL | |
| Piatto Lumox 50 | Sarstedt | SAR946077410 | Piatto per coltura tissutale permeabile ai gas |
| Coperchio del microscopio Vetro | Fisher | 12-541-B | 22 mm x 22 mm, vetrino coprioggetti #1,5 |
| Perni per minuzie Strumenti di | scienza | 26002-15 | Perni per insetti utilizzati per realizzare strumento per bisturi |
| Portaspilli nichelato | scienze fini | 26018-17 | |
| Soluzione di paraformaldeide al 32%, | microscopia elettronica | 15714 | |
| Vetrini per microscopio con bordo smussato in piano | Fisher | 12-549-5 | Vetrini utilizzati per le dissezioni |
| Piastre spot in PYREX | Fisher | 13-748B | Piatto |
| da dissezione in vetro a 9 pozzetti Fisher 13-748BSchneider's Drosophila medium | Fisher | 21720-024 | |
| Filtro per siringa, 0,22 &; m | EMD Millipore | SLGS033SB | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | Mezzo di montaggio per microscopia |
Riferimenti
- Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38 (1), San Diego, Calif. 2-16 (2006).
- Ong, J. Y., Torres, J. Z. Dissecting the mechanisms of cell division. The Journal of Biological Chemistry. 294 (30), 11382-11390 (....
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Ristampe e permessi
