Acquisizione del DNA ambientale (eDNA) da campioni d'acqua mediante flocculazione

Sommario

Il DNA ambientale (eDNA) viene tipicamente catturato da campioni d'acqua utilizzando la precipitazione, la filtrazione o la flocculazione dell'alcol. Qui viene presentato un protocollo alternativo che utilizza il cloruro di lantanio per consentire la raccolta di acidi nucleici disciolti e legati al particolato da campioni d'acqua contenenti cellule eucariotiche, cellule procariotiche e virus.

Abstract

L'analisi del DNA ambientale (eDNA) è diventata un approccio ampiamente utilizzato per la risoluzione dei problemi nella gestione delle specie. L'obiettivo è il rilevamento di specie criptiche, comprese le specie invasive e (o) a rischio, tipicamente raggiunto testando l'acqua e i sedimenti per la presenza di firme caratteristiche del DNA. Sono necessarie procedure affidabili ed efficienti per la cattura dell'eDNA, in particolare quelle che possono essere eseguite facilmente sul campo da personale con formazione limitata e da cittadini scienziati. La cattura dell'eDNA mediante filtrazione a membrana è attualmente ampiamente utilizzata. Questo approccio presenta problemi intrinseci che includono la scelta del materiale e della porosità del filtro, l'incrostazione del filtro e il tempo necessario in loco per l'esecuzione del processo. La flocculazione offre un'alternativa che può essere facilmente implementata e applicata a regimi di campionamento che si sforzano di coprire ampi territori in un tempo limitato.

Introduzione

Prima della metà degli anni 2000, il termine "DNA ambientale" era generalmente usato per riferirsi al DNA ottenuto da microbi dell'acqua e del suolo, anche se un certo uso per il rilevamento di DNA umano e animale ai fini del monitoraggio della fonte fecale o del rilevamento di specie non autoctone era iniziato ^1,2,3. Attualmente, il DNA ambientale è generalmente utilizzato per descrivere il DNA proveniente da cellule staccate da organismi eucarioti e l'analisi di questo DNA è diventata uno strumento di gestione ampiamente utilizzato. L'obiettivo è il rilevamento di specie criptiche, comprese quelle invasive o a rischio, tipicamente raggiunto testando l'acqua o i sedimenti per la presenza delle firme del DNA caratteristiche delle specie bersaglio. Gli studi possono concentrarsi su una singola specie di interesse utilizzando uno specifico test PCR (campionamento attivo), oppure molte specie possono essere rilevate contemporaneamente utilizzando il metabarcoding e il sequenziamento massivamente parallelo.

Negli ultimi due decenni sono stati apportati molti miglioramenti nella raccolta dei campioni, nell'elaborazione dei campioni e nell'analisi dei dati associati alla ricerca sull'eDNA. I primi studi hanno impiegato la precipitazione dell'alcol per catturare il DNA da campioni d'acqua³. Sebbene collaudato, la necessità di analizzare grandi volumi d'acqua per aumentare la sensibilità del saggio rende questo metodo poco attraente a causa del tipico requisito di due volumi di etanolo per ogni volume di campione d'acqua.

Studi successivi hanno generalmente utilizzato la filtrazione di membrana, razionalizzando che l'eDNA è presente in un continuum di stati da quelli legati a quelli liberamente disciolti, ma che il DNA disciolto è soggetto a una rapida degradazione e quindi che il DNA legato alle cellule rappresenta la frazione più significativa. L'ottimizzazione del materiale filtrante e della dimensione dei pori è ampiamente discussa e dibattuta, così come il metodo o i metodi ottimali per l'estrazione dell'eDNA catturato dal filtro ^4,5,6.

Un terzo approccio alla cattura dell'eDNA è la flocculazione, un processo che è stato utilizzato per secoli per chiarificare liquidi tra cui acqua, birra e vino. Diversi studi hanno utilizzato la flocculazione per catturare il virus da fonti di acqua naturale o potabile 7,8,9,10,11. Questi studi hanno tipicamente utilizzato latte scremato pre-flocculato o cloruro di ferro come agenti di cattura. I metodi con cloruro di ferro in genere comportano problemi molecolari di analisi a valle a causa dell'inibizione della reazione PCR^12,13. I metodi che utilizzano il latte scremato pre-flocculato richiedono la preparazione anticipata del flocculante, il controllo del pH e finora sono stati applicati solo alla cattura del virus ^7,8,9.

Recentemente, è stata studiata la cattura flocculatoria di batteri e virus basata sull'uso di cloruro di lantanio (III) 12,13,14,15. Gli autori hanno dimostrato che i patogeni vitali possono essere raccolti con questo metodo poiché il legame del cloruro di lantanio è efficace a basse concentrazioni (0,2 mM). Inoltre, la flocculazione del lantanio è reversibile attraverso la chelazione in condizioni blande a differenza di quella del cloruro di ferro.

Pertanto, la flocculazione con cloruro di lantanio per catturare il particolato biologico è interessante dato che è necessaria solo una piccola quantità di agente flocculante concentrato aggiunto, non è necessario un rigoroso controllo del pH e i volumi del campione sono scalabili da millilitri a galloni. Per quanto riguarda la cattura dell'eDNA, il DNA cellulare, subcellulare (mitocondri e cloroplasti) e disciolto viene facilmente recuperato. Batteri e virus vengono raccolti simultaneamente, consentendo l'analisi dei patogeni e (o) ulteriori studi ecologici da un singolo campione d'acqua. Viene presentato un protocollo di flocculazione che utilizza cloruro di lantanio che consente la raccolta di acidi nucleici disciolti e legati al particolato da campioni d'acqua.

Protocollo

1. Decontaminazione delle apparecchiature e preparazione dei reagenti di flocculazione

1. Lavare accuratamente tutte le bottiglie, i tubi e le altre attrezzature utilizzate in precedenza con detersivo per piatti e acqua calda.
2. Spruzzare tutte le bottiglie, i tubi e le altre attrezzature usate in precedenza con una soluzione di acido citrico al 6% per rimuovere i depositi minerali, lasciare riposare 20 minuti e risciacquare con acqua di rubinetto.
3. Aggiungere una soluzione di candeggina domestica diluita 10 volte (concentrazione finale 0,5-0,6% di ipoclorito di sodio) a tutte le bottiglie (circa il 10% del volume del contenitore), agitare, lasciare riposare almeno 1 ora, quindi scolare e risciacquare con acqua di rubinetto fino a quando non rimane traccia di candeggina. Quindi risciacquare una volta con acqua deionizzata.
4. Asciugare tutte le bottiglie.
5. Collocare tutti i flaconi e i tappi di raccolta in una cabina di sicurezza biologica e irradiare con lampade germicide a raggi ultravioletti per 2 ore, ruotando ogni bottiglia e tappando di un quarto di giro ogni mezz'ora.
6. Posizionare i tappi sulle bottiglie e avvitare senza stringere. Pesare ogni bottiglia e registrare il suo peso a vuoto sulla bottiglia.
7. Preparare una soluzione da 100 mM di cloruro di lantanio (III) eptaidrato sciogliendo 3,71 g in 100 mL di acqua deionizzata. Per ridurre al minimo l'esposizione della sostanza chimica all'aria, poiché il cloruro di lantanio è igroscopico, sigillare la bottiglia con del nastro adesivo tra un utilizzo e l'altro.
   ATTENZIONE: Il cloruro di lantanio riporta l'avvertenza di avvertenza sulle avvertenze di pericolo. L'H315 provoca irritazione cutanea. L'H319 provoca grave irritazione oculare. H335 può causare irritazione respiratoria. Utilizzare dispositivi di protezione individuale. Per ulteriori informazioni, vedere la SDS del materiale.
8. Preparare una soluzione 1 M di bicarbonato di sodio sciogliendo 84,01 g di bicarbonato di sodio in 1 L di acqua deionizzata. Filtrare, sterilizzare e conservare a temperatura ambiente.

2. Raccolta e flocculazione dei campioni

1. Raccogli campioni da ogni sito più un campo bianco (un campione contenente acqua potabile riempito in loco per controllare la contaminazione) riempiendo bottiglie di dimensioni adeguate. Regolare il numero di campioni prelevati in base al disegno sperimentale e allo scopo previsto. Non riempire eccessivamente le bottiglie oltre la spalla della bottiglia per consentire l'espansione se i campioni devono essere congelati.
2. Registra i metadati pertinenti, tra cui data, ora e posizione GPS. Etichettare i contenitori dei campioni.
3. Aggiungere 1 M di soluzione di bicarbonato di sodio a ciascun campione e campo bianco. Aggiungere 10 mL per 500 mL di campione.
4. Tappare le bottiglie e mescolare.
5. Aggiungere 100 mM di cloruro di lantanio a ciascun campione e campo bianco. Aggiungere 1 mL per 500 mL di campione.
6. Tappare e mescolare accuratamente. Utilizzare del nastro isolante per fissare il tappo.
7. Conservare in ghiaccio fino al ritorno al laboratorio sul campo, quindi i campioni possono essere conservati durante la notte in frigorifero e in posizione verticale per consentire ai fiocchi di depositarsi sul fondo del contenitore o congelati a -20 °C per essere spediti a un secondo laboratorio per un'ulteriore lavorazione. I campioni devono essere congelati in posizione verticale per consentire l'espansione del liquido e prevenire la rottura del contenitore.

3. Lavorazione dei fiocchi

1. Scongelare i campioni congelati a temperatura ambiente in un refrigeratore o spostare i campioni che non sono stati congelati in un'area di lavoro adatta che includa una pompa peristatica e una configurazione di tubi per l'aspirazione dei surnatanti dei campioni. Assicurarsi che il tubo che attraversa la pompa peristaltica scarichi in un grande secchio sul pavimento. L'aspirazione deve essere dotata di una cannuccia di plastica pulita per il controllo dell'aspirazione.
2. Utilizzare la pompa peristaltica per rimuovere il surnatante utilizzando la cannuccia per dirigere l'aspirazione prima appena sotto la superficie del liquido e spostando l'aspirazione della cannuccia verso il basso con il livello del liquido. Rimuovere l'ultimo surnatante spostando con cautela l'assunzione in modo che si appoggi sul pontile (fossetta rialzata sul fondo del flacone). Ciò consente la massima rimozione del liquido mentre i fiocchi si raccolgono intorno alla periferia (vedere la Figura 1).

Figura 1: Raccolta di fiocchi sedimentati a gravità unitaria. I floc contenenti materiale cellulare ed eDNA si depositano sul fondo del flacone del campione e sono pronti per essere recuperati dopo la rimozione del surnatante. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Applicare una cannuccia pulita e ripetere la rimozione del surnatante per ogni campione.
4. Utilizzare una pipetta pulita da 20 ml e un controller per pipette per trasferire completamente la sospensione di fiocchi in una provetta da centrifuga da 50 ml. Utilizzare risciacqui con acqua deionizzata a basso volume (circa 5 ml) per assicurarsi che eventuali fiocchi residui vengano recuperati dal flacone del campione.
5. Regolare tutte le provette da 50 mL a volumi uguali con acqua deionizzata e raccogliere i fiocchi mediante centrifugazione a 2.500 x g per 20 minuti.
6. Versare il surnatante e far riposare i tubi capovolti su un tovagliolo di carta pulito per scolarli.
7. Risospendere i fiocchi in 1 mL di EDTA 0,5 M, pH 8,0 mediante miscelazione a vortice, quindi aggiungere 4 mL di soluzione 1x TE, pH 8,0 e mescolare di nuovo. Trasferire i fiocchi risospesi in una provetta da centrifuga conica da 15 mL, aggiungere 50 μL di poliacrilammide lineare al 10% e vortex. Aggiungere 5 ml di isopropanolo al 100%, mescolare e lasciare riposare in ghiaccio per 20 minuti.
8. Centrifugare a 6.000 x g per 20 minuti per raccogliere il DNA e il particolato cellulare. Versare i surnatanti e lasciarli riposare capovolti su carta assorbente pulita per scolarli. Lasciare asciugare leggermente, ma non asciugare eccessivamente.
9. Inizia il processo di estrazione del DNA del fiocco utilizzando un kit commerciale che utilizza il battito delle perle e il legame della colonna di rotazione con una capacità di 25 μg.
   1. Innanzitutto, risospendere i fiocchi in 800 μl del tampone di lisi fornito con il kit e trasferire completamente la sospensione in un tubo di battitura delle microsfere. Il tallone batte la sospensione floc in brevi periodi con raffreddamento in mezzo. A questo punto, gli omogeneizzati possono essere conservati congelati o continuare con il protocollo del kit.
   2. Eluire prima il DNA dalla colonna di centrifuga con 100 μl, quindi riciclare l'eluato attraverso la provetta.
   3. Infine, eluire il DNA residuo dalla colonna con un'aliquota aggiuntiva di 100 μl di tampone di eluizione per ottenere un volume totale di 200 μl. Questo massimizza il recupero.
10. Raccogli, prepara e analizza l'eDNA per dimostrare le prestazioni di questo protocollo e le sue prestazioni rispetto al metodo di filtrazione ampiamente utilizzato.
    1. Preparare reazioni che contengano 1x qPCR master mix, 25 μg/mL di trombina^{bovina 14,16}, 0,4 μM di primer diretti e inversi e 2 μL di stampo (1% del DNA del campione recuperato). Costruire curve standard utilizzando diluizioni seriali di ampliconi PCR purificati e quantificati generati utilizzando DNA voucher. In alternativa, i bersagli possono essere sintetizzati commercialmente.
    2. Utilizzare un metodo di quantificazione comparativa se non è disponibile alcuno standard. Per questo esempio, eseguire il ciclo termico utilizzando condizioni di reazione di 95 °C per 10 minuti seguite da 40 cicli di 95 °C per 10 s, 57 °C per 30 s e 72 °C per 30 s, anche se queste condizioni devono essere regolate per altri saggi. Analizza i dati utilizzando il software del produttore.

Risultati

Otto campioni d'acqua da 500 mL (450 mL ciascuno) prelevati da un acquario che ospita due tartarughe dipinte orientali (Chrysemys picta picta) sono stati utilizzati per preparare l'eDNA utilizzando il protocollo descritto. Altri otto campioni d'acqua da 500 mL sono stati filtrati su filtri in fibra di vetro da 47 mm con porosità di 1,5 μm senza legante e l'eDNA è stato estratto utilizzando lo stesso metodo di estrazione utilizzato per il protocollo di flocculazione. Il DNA preparato con entrambi i metodi è stato...

Discussione

Sebbene questa tecnica sia semplice, alcuni passaggi sono fondamentali per il successo. La raccolta e il trasferimento dei fiocchi devono essere effettuati completamente per non perdere il DNA. Il materiale residuo deve essere raccolto mediante risciacqui strategici. Il protocollo descritto utilizza un kit di estrazione del DNA commerciale per la lavorazione finale del materiale flocculato. Altri metodi di estrazione possono avere prestazioni simili o superiori, ma le modifiche di questa...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0,5 M EDTA, pH 8,0	Disponibile da diverse fonti
1 x tampone TE, pH 8,0	Disponibile da diverse fonti
Provette da centrifuga coniche da 15 ml Bottiglie quadrate	in PET monouso
da 16 once	Riutilizzabili con pulizia e decontaminazione
Tappo in polipropilene 38/400 con sensibile alla pressione Fodera:	lasciare i cappucci attaccati liberamente fino al momento dell'uso. Chiudere bene per sigillare il rivestimento sensibile alla pressione.
Provette da centrifuga coniche da 50 mL Soluzione	monouso
acido citrico al 6%	Da utilizzare per rimuovere i depositi minerali dai flaconi dei campioni riutilizzabili.
Kit per microbi fecali/del suolo	Utilizzare la resina o la colonna
Cloruro di lantanio (III) eptaidrato	100 mM Soluzione
Pompa peristaltica CC	Qualsiasi pompa peristaltica andrà bene, o può essere sifonata
Trasportatore di poliacrile	10% poliacrilammide
Bicarbonato	di sodio1 M, filtro sterilizzato e conservato a temperatura

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