In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly nella C. elegans Germline utilizzando Proximity Ligation Assay

Sommario

Questo protocollo dimostra l'uso del saggio di legatura di prossimità per sondare le interazioni proteina-proteina in situ nella germinale C. elegans.

Abstract

Comprendere quando e dove si verificano interazioni proteina-proteina (IPP) è fondamentale per comprendere la funzione delle proteine nella cellula e in che modo processi più ampi come lo sviluppo sono influenzati. La germina Caenorhabditis elegans è un ottimo sistema modello per studiare gli IPP che sono legati alla regolazione delle cellule staminali, della meiosi e dello sviluppo. Ci sono una varietà di tecniche ben sviluppate che consentono alle proteine di interesse di essere etichettate per il riconoscimento da parte di anticorpi standard, rendendo questo sistema vantaggioso per le reazioni di analisi di legatura di prossimità (PLA). Di conseguenza, il PLA è in grado di mostrare dove gli IPP si verificano in modo spaziale e temporale nelle linee germinali in modo più efficace rispetto agli approcci alternativi. Descritto qui è un protocollo per l'applicazione e la quantificazione di questa tecnologia per sondare gli IPP nella linea germinale di C. elegans.

Introduzione

Si stima che oltre l'80% delle proteine abbia interazioni con altre molecole¹, il che sottolinea quanto siano importanti gli IPP per l'esecuzione di specifiche funzioni biologiche nella cellula². Alcune proteine funzionano come hub che facilitano l'assemblaggio di complessi più grandi che sono necessari per la sopravvivenza delle cellule¹. Questi hub mediano più IPP e aiutano a organizzare le proteine in una rete che facilita funzioni specifiche in una cella^{3 .} La formazione di complessi proteici è influenzata anche dal contesto biologico, come la presenza o l'assenza di specifici partner interagenti⁴, eventi di segnalazione cellulare e fase di sviluppo di una cellula.

C. elegans è comunemente usato come organismo modello per una varietà di studi, compreso lo sviluppo. La semplice anatomia di questo animale è composta da diversi organi, tra cui la gonad, l'intestino e la cuticola trasparente, che facilita l'analisi dello sviluppo del verme. La germinale che si trova nella gonade è un ottimo strumento per studiare come le cellule staminali germinali maturano in gameti⁵ che si sviluppano in embrioni e, infine, la prossima generazione di progenie. La regione di punta distale della linea germinale contiene un pool di cellule staminali auto-rinnovanti (Figura 1). Quando le cellule staminali lasciano la nicchia, progrediscono nel pachitene meiotico e alla fine si sviluppano in ovociti nella fase dei giovani adulti(Figura 1). Questo programma di sviluppo nella linea germinale è strettamente regolato attraverso diversi meccanismi, tra cui una rete normativa post-trascrizione facilitata dalle proteine che legano l'RNA (RBP)⁶. Gli IPP sono importanti per questa attività normativa, in quanto gli RRB si associano ad altri cofattori per esercitare le loro funzioni.

Esistono diversi approcci che possono essere utilizzati per eseguire la ricerca di IPP nel worm, ma ognuno ha limitazioni univoche. L'immunoprecipitazioni in vivo (IP) può essere utilizzata per isolare i complessi proteina-proteina da estratti di vermi interi; tuttavia, questo approccio non indica dove si verifica il PPI nel worm. Inoltre, i complessi proteici che sono transitori e si formano solo durante una fase specifica di sviluppo o in un numero limitato di cellule possono essere difficili da recuperare mediante co-immunoprecipitazioni. Infine, gli esperimenti sulla PI devono affrontare le preoccupazioni del riassortimento complesso proteico dopo la lisi e la ritenzione non specifica delle proteine sulla matrice di affinità.

Gli approcci alternativi per il rilevamento in situ degli IPP sono la co-immunostainizzazione, il trasferimento di energia di risonanza di Fàrster (FRET) e il complemento a fluorescenza bimolecolare (BiFC). La co-immunostaining si basa sul rilevamento simultaneo di due proteine di interesse per il tessuto del verme fisso e sulla misurazione dell'entità della colocalizzazione del segnale. L'uso della microscopia a super-risoluzione, che offre maggiori dettagli rispetto alla microscopia standard⁷, aiuta a testare più rigorosamente la colocalizzazione delle proteine oltre la barriera limitata alla diffrazione di 200-300 nm⁸. Tuttavia, la co-immunostaining utilizzando microscopia convenzionale e super-risoluzione funziona meglio per le proteine con modelli di localizzazione ben definiti. Al contrario, diventa molto meno informativo per i partner interagenti diffusamente distribuiti. La misurazione per la co-localizzazione dei segnali basata sulla sovrapposizione non fornisce informazioni accurate sul fatto che le proteine siano in complesso tra loro^9,10.

Inoltre, la co-immunoprecipitazioni e la co-immunostaining dei complessi proteina-proteina non sono quantitative, il che rende difficile determinare se tali interazioni sono significative. FRET e BiFC sono entrambe tecniche fluorescenti. FRET si basa sull'etichettatura delle proteine di interesse con proteine fluorescenti (FP) che hanno sovrapposizioni spettrali in cui l'energia di un FP (donatore) viene trasferita a un altro FP (accettatore)¹¹. Questo trasferimento non radiativo di energia provoca fluorescenza dell'arbitro FP che può essere rilevato alla rispettiva lunghezza d'onda dell'emissione. BiFC si basa sulla ricostituzione di una proteina fluorescente in vivo. Si tratta di dividere la GFP in due frammenti complementari, come le eliche 1-10 e l'elica 11¹², che vengono poi fuse in due proteine di interesse. Se queste due proteine interagiscono, i frammenti complementari di GFP diventano abbastanza vicini in prossimità di piegare e assemblare, ricostituendo il fluoroforo GFP. La GFP ricostituita viene quindi osservata direttamente come fluorescenza e indica dove si è verificato un PPI.

Come tale, sia FRET che BiFC dipendono da grandi tag fluorescenti che possono interrompere la funzione della proteina marcata. Inoltre, FRET e BiFC richiedono un'espressione abbondante e comparabile delle proteine marcate per ottenere dati accurati. FRET potrebbe non essere adatto per esperimenti in cui un partner è superiore all'altro, il che può portare a un alto background¹³. Anche la sovraespressione negli esperimenti BiFC dovrebbe essere evitata, in quanto ciò può indurre l'assemblaggio non specifico¹⁴ che si traduce in un aumento dello sfondo. Entrambe le tecniche richiedono l'ottimizzazione delle condizioni di espressione e imaging delle proteine marcate, che può prolungare il tempo necessario per completare gli esperimenti.

Il saggio di legatura di prossimità (PLA) è un approccio alternativo che può affrontare i limiti delle tecniche di cui sopra. Il PLA sfrutta gli anticorpi primari che riconoscono le proteine di interesse (o i loro tag). Questi anticorpi primari sono poi legati da anticorpi secondari contenenti sonde oligonucleotidi che possono ibridarsi tra loro quando entro una distanza di 40 nm (o più breve)¹⁵. Il DNA ibridato risultante viene amplificato attraverso una reazione PCR, che viene rilevata da sonde che completano il DNA. Questo si traduce in foci che vengono visualizzati da un microscopio. Questa tecnologia è in grado di rilevare i PPI in situ in tessuti complessi (cioè la gonaddel a verme), che è organizzata come una catena di assemblaggio contenente cellule in varie fasi di sviluppo e differenziazione. Con il PLA, gli IPP possono essere visualizzati direttamente in una gonad di verme fissa, che è vantaggiosa per indagare se gli IPP si verificano durante una fase specifica dello sviluppo. PLA offre una maggiore risoluzione degli IPP rispetto ai saggi basati sulla co-localizzazione, ideale per effettuare misurazioni precise. Se utilizzata, la microscopia a super-risoluzione ha il potenziale per fornire dettagli più dettagliati sulla posizione dei focolai PLA all'interno di una cellula. Un altro vantaggio è che i foci derivanti dalle reazioni PLA possono essere conteggiati da un flusso di lavoro di analisi basato su ImageJ, rendendo questa tecnica quantitativa.

La famiglia LC8 di catene di luce dynein è stata descritta per la prima volta come una sottounità del complesso motorio di dineina¹⁶ e ipotizzata come un adattatore da carico. Fin dalla sua scoperta iniziale, LC8 è stato trovato in più complessi proteici oltre al complesso motorio della dineina^17,18,19,20. La scansione delle sequenze proteiche che contengono il motivo di interazione LC8¹⁹ suggerisce che LC8 può avere molte interazioni con una vasta gamma di proteine diverse^{17,18,19,20,21,22}. Di conseguenza, le proteine della famiglia LC8 sono ora considerate hub che aiutano a promuovere l'assemblaggio di complessi proteici più grandi^19,22, come gli assiemi di proteine intrinsecamente disordinate²¹.

Una proteina di famiglia C. elegans LC8, dynein light chain-1 (DLC-1), è ampiamente espressa su molti tessuti e non arricchita in specifiche strutture subcellulari^23,24. Di conseguenza, l'identificazione dei partner in vivo biologicamente rilevanti del DLC-1 in C. elegans è difficile per una serie di motivi: 1) la co-immunoprecipitazioni non indica la fonte di tessuto in cui si verifica l'interazione; 2) l'espressione limitata di particolari partner o interazioni transitorie può ostacolare la capacità di rilevare un'interazione mediante co-immunoprecipitazioni; e 3) la distribuzione diffusa del DLC-1 porta a sovrapposizioni non specifiche con potenziali proteine partner mediante co-immunostaining. Sulla base di queste sfide, PLA è un approccio ideale per testare le interazioni in vivo con DLC-1.

È stato precedentemente riportato che il DLC-1 interagisce direttamente con e funge da cofattore per le proteine che legano l'RNA (RBP) FBF-2²² e GLD-1²⁵. Il nostro lavoro supporta il modello di DLC-1 che funge da proteina hub e suggerisce che DLC-1 facilita una rete di interazione che si estende oltre la dineina^19,22. Utilizzando un'analizzatore GST, è stato identificato un nuovo RBP interagenti DLC-1 denominato OMA-1²⁶. OMA-1 è importante per la crescita degli ovociti e la maturazione meiotica²⁷ e funziona in combinazione con un certo numero di repressori e attivatori traslazionali²⁸. Mentre FBF-2 e GLD-1 sono espressi rispettivamente nelle cellule staminali e nelle regioni di pachitene meiotico, OMA-1 è diffusamente nella germinale del guardatene meiotico attraverso gli ovociti²⁷ (Figura 1). Ciò suggerisce che il DLC-1 forma complessi con RBP in diverse regioni della gonade. È stato anche scoperto che l'interazione diretta tra DLC-1 e OMA-1 osservata in vitro non viene recuperata da un IP in vivo. Il PLA è stato utilizzato con successo come approccio alternativo per studiare ulteriormente questa interazione nella linea germinale di C. elegans, e i risultati suggeriscono che il PLA può essere utilizzato per sondare molti altri IPP nel worm.

Protocollo

NOTA: questo protocollo utilizza ceppi C. elegans in cui i potenziali partner interagenti sono entrambi contrassegnati. Si raccomanda vivamente di utilizzare una deformazione di controllo negativo, in cui una proteina con tag non dovrebbe interagire con un altro partner di interazione candidato con tag. Qui, GFP da solo è stato utilizzato come un controllo negativo per valutare lo sfondo, come DLC-1 non dovrebbe interagire con GFP nel worm. OMA-1 con tag GFP è stato usato come ceppo sperimentale, poiché i dati preliminari suggeriscono un'interazione con DLC-1. I ceppi di nematode co-esprimono il controllo e le proteine di prova con il DLC-1 con etichetta 3xFLAG sono indicati in questo testo come 3xFLAG::DLC-1; GFP e 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP (ceppi disponibili su richiesta; ulteriori informazioni nella Tabella dei materiali), rispettivamente. Qui vengono utilizzati i tag 3xFLAG e GFP; tuttavia, altri tag possono essere sostituiti a condizione che i loro anticorpi siano compatibili con i reagenti del kit PLA.

1. Cura degli animali

1. Mantenere i vermi su piastre di nematodi (NGM) che vengono seminati con il ceppo OP50 di E. coli e mantenere a 24 gradi centigradi per l'espressione ottimale di GFP.
2. Passaggio di vermi adulti ogni 2-3 giorni per propagare i vermi e tenerli ben nutriti.

2. Preparazione delle impostazioni cultura sincrone

1. Sincronizzare i vermi sbiancando un piatto di ermafroditi gravidi ben nutriti. Un protocollo di sbiancamento è descritto in Porta-de-la-Riva et al.²⁹. Lasciare che gli embrioni si schiudono durante la notte in un tubo di centrifuga a 24 gradi centigradi, mentre ruotano fine oltre fine in 10 mL di buffer media minimo M9 (M9). Questo produrrà una cultura delle larve L1 arrestate.
2. Incubare il tubo di larve di stadio L1 arrestate sul ghiaccio per 10 min, quindi coronare il tubo con ghiaccio freddo 1x M9.
3. Utilizzare una centrifuga per pellet le larve a 600 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Aspirare con attenzione il supernatante in modo che rimanga solo 1-2 mL di supernatali.
4. Sospendere nuovamente il pellet delle larve e utilizzare una micropipetta per trasferire 2 - L di coltura delle larve sospese in uno scivolo di vetro. Conta quante larve sono presenti per determinare la densità della coltura delle larve, che aiuterà a guidare la semina dei vermi nel passaggio 2.5.
   NOTA: Una densità di 10-15 larve L1/1 - L funziona bene per la seeding.
5. Utilizzare una micropipetta per trasferire il volume di coltura delle larve necessarie per il seme di circa 100-120 larve di stadio L1 su una piastra OP50 da 60 mm. Ad esempio, il seme 10 - L di una coltura larvale che ha una densità di 10 larve L1/L -L di coltura.
   NOTA: Non superare un volume di 40 ,L per seme le larve, o liquido in eccesso interromperà il prato OP50. Se il volume di coltura supera i 40 gradi, ripetere i passaggi da 2,3 a 2,4 per ridurre ulteriormente il volume e aumentare la densità della coltura delle larve.
6. Coltiva vermi a 24 gradi centigradi. Registrare il tempo in cui i L1 vengono seminato sulla piastra e controllare periodicamente la fase di sviluppo per identificare il momento ideale per la dissezione.
   NOTA: A 52 h dopo la semina di L1s, i vermi coltivati a 24 gradi centigradi sono in genere nella fase dei giovani adulti, che è lo stadio ideale per la dissezione per il PLA mirato alla gonad. Tuttavia, il tempo effettivo in cui i vermi sincronizzati raggiungono la fase dei giovani adulti può variare tra i ceppi e la temperatura di incubazione.

3. Dissezione/estrusione gonadia

NOTA: La dissezione per estrudere la gonade è necessaria per il successo del PLA mirato alla gonad. Questo approccio può anche rilasciare embrioni, che funzionano anche utilizzando questo protocollo per PLA (vedere Discussione per ulteriori informazioni). Dopo la dissezione, sia il controllo negativo che i campioni sperimentali vengono fissati e trattati per il PLA insieme in parallelo. Si suggerisce inoltre di preparare un ulteriore set di campioni allo scopo di una co-immunostaining fluorescente²³ per dimostrare i modelli di espressione dei partner proteici di interesse.

1. Scegliete 30-40 vermi giovani adulti in una pianta di vetro per orologio contenente 500 l un'altezza di 1x M9 ( levamisole (2,5 mM di concentrazione finale). Dopo aver raccolto i vermi, rimuovere attentamente e scartare la maggior parte dei supporti per rimuovere i batteri che vengono trasferiti insieme ai vermi.
2. Aggiungete 500 L di 1x M9 e usate la pipetta per disegnare delicatamente e dispensare il supporto per sciacquare i vermi. Rimuovere e scartare con attenzione la maggior parte dei media per eliminare i batteri che vengono trasferiti insieme ai vermi.
   1. Ripetere questo passaggio 2x-3x fino a rimuovere tutti i batteri. Dopo che i lavamenti sono stati completati, lasciare i vermi in circa 100 litri di supporti per mantenersi idratati.
      NOTA: Non lasciare che i vermi restino in media per più di 7 min, in quanto ciò comprometterà l'estrusione delle gonadi durante la dissezione. Eseguire lavamenti sotto l'aiuto di sezionare microscopio per monitorare la rimozione dei supporti in modo che i vermi non vengano persi.
3. Utilizzando una pipetta in vetro o polietilene, trasferire i vermi a un microscopio da 25 mm x 75 mm rivestito con 0,001% poli-lisina (i vetrini utilizzati in questa procedura hanno un perimetro rivestito epossidica, lasciando tre spazi di lavoro, 14 mm x 14 mm ciascuno). Rimuovere i supporti in eccesso in modo che rimangano circa 10-15 ore di supporto.
4. Sotto l'aiuto di un microscopio sezionato e utilizzando due aghi calibro 261/2, posizionare un ago sopra l'altro in modo che le estremità formano un paio di forbici. Utilizzando aghi orientati in questo modo, tagliare vermi dietro il pharynx per rilasciare le germinali. Dissezionare tutti i vermi entro 5 minuti.
   NOTA: Ulteriori dettagli su come eseguire le dissezioni sono disponibili in una pubblicazione precedente di Gervaise e Arur³⁰.
5. Dopo aver sezionato tutti i vermi, posizionare delicatamente una coverslip da 22 mm x 40 mm sul vetrino in modo che sia perpendicolare al vetrino. Le estremità del coperchio dovrebbero appendere fuori dalla diapositiva.
6. Congelare i vetrini su un blocco di alluminio pre-freddo mantenuto su ghiaccio secco per almeno 20 min.

4. Fissaggio/blocco

1. Quando sei pronto per la fissazione, sfregifuorii con una matita o un altro strumento smussato e immergi immediatamente lo scivolo in un barattolo contenente metanolo fresco e freddo ghiaccio (freddo a -20 gradi centigradi) per 1 min.
2. Pulire delicatamente i bordi del vetrino che circonda il campione in modo che il successivo reagente sia tenuto dalla tensione superficiale intorno al campione. Applicare 150 l di fissativo (2% formaldeide in 100 mM KH₂PO_4, pH - 7,2) per 5 min a RT.
   NOTA: Abbiamo anche testato una procedura di fissaggio del metanolo/acetone^31,32 e abbiamo scoperto che è compatibile con la reazione PLA.
3. Toccare il vetrino su un tovagliolo di carta con un angolo perpendicolare di 90 gradi per far scorrere il vetrino e assorbire nel tovagliolo di carta. Bloccare le diapositive 2x per 15 min a RT in un barattolo Coplin con 50 mL di 1x PBS/1% Triton X-100/1% di albumina di siero bovino (PBT/BSA).
   NOTA: per questa fase di blocco e le fasi di lavaggio riportate di seguito nelle sezioni 6-9 si raccomandano vasetti Coplin o altri tipi di vasetti di colorazione. Questi forniscono volumi sufficienti per uno scambio efficiente di buffer di blocco o lavaggio con il campione.
4. Bloccare i vetrini con una soluzione PBT/BSA contenente il siero di capra normale al 10%. Pulire delicatamente i bordi che circondano il vetrino e applicare 100 l della soluzione al vetrino. Incubare per 1 h a RT in una camera umida.
   NOTA: Questo passaggio è altamente raccomandato per la colorazione con l'anticorpo primario di FLAG. La camera umida è costruita fissando pipette di vetro con nastro adesivo nel vassoio per i vetrini su cui posare mentre si incubano. Le salviettine delle attività inumidite (Tabella dei materiali) vengono collocate nel vassoio per aumentare l'umidità interna del vassoio per evitare l'evaporazione. Il coperchio e il vassoio sono rivestiti in lamina per proteggere i campioni dalla luce durante i passaggi sensibili alla luce.
5. Posizionare il vetrino su un tovagliolo di carta per lasciare che la soluzione PBT/BSA/10%NGS esca dal vetrino e pulisca delicatamente i bordi del vetrino. Utilizzare il reagente di blocco (Tabella dei materiali) per bloccare le diapositive. Applicare una goccia allo spazio di 14 mm x 14 mm. Incubare i vetrini per 1 h a 37 gradi centigradi in una camera umida.

5. Incubazione anticorpale primaria

NOTA: Per ottenere i migliori risultati PLA e uno sfondo minimo, il fattore di diluizione degli anticorpi primari può richiedere l'ottimizzazione (vedere Discussione per maggiori dettagli). Inoltre, gli anticorpi primari devono essere allevati in host diversi che corrispondono alla specificità degli anticorpi secondari utilizzati per il PLA.

1. Posizionare il vetrino su un tovagliolo di carta per consentire il blocco di corsa reagente fuori dal vetrino e pulire delicatamente i bordi. Utilizzare il diluente anticorpo (Tabella dei materiali) per diluire gli anticorpi primari. Applicare 40 l di soluzione anticorpale primaria per uno spazio di 14 mm x 14 mm.
2. Incubare i vetrini in una camera umida durante la notte a 4 gradi centigradi.

6. Incubazione della sonda PLA (anticorpo secondario)

NOTA: per i passaggi da 6 a 9, utilizzare i tamponi di lavaggio A e B in RT. Se i buffer sono memorizzati a 4 gradi centigradi, lasciarli scaldi a RT prima dell'uso.

1. Lavare le vetrine 2x per 5 min con 50 mL di 1x tamponi di lavaggio A (Tabella dei materiali) a RT in un barattolo Coplin. Impostare il barattolo Coplin su uno shaker orbitale impostato su 60 giri/min.
2. Posizionare il vetrino su un tovagliolo di carta per lasciare lavare tampone correre fuori dal vetrino e pulire delicatamente i bordi. Preparare una soluzione da 40 l contenenti sonde PLUS e MINUS (diluite 1:5 con diluente anticorpo). Applicare la soluzione a ogni spazio di 14 mm x 14 mm.
3. Incubare i vetrini in una camera umida per 1 h a 37 gradi centigradi.

7. Ligazione

1. Lavare i vetrini 2x per 5 min con 50 mL di 1x tampone di lavaggio A a RT in un barattolo Coplin. Impostare il barattolo Coplin su uno shaker orbitale impostato su 60 giri/min.
2. Diluire il buffer di legatura (Tabella dei materiali) 1:5 con acqua ultrapura. Utilizzare questo buffer per diluire la liga (Tabella dei materiali) 1:40 per preparare uno stock di lavoro di soluzione di ligazione.
   1. Posizionare il vetrino su un tovagliolo di carta per far scorrere il tampone di lavaggio dal vetrino e pulire delicatamente i bordi. Applicare 40 l della soluzione di legatura a ogni spazio di 14 mm x 14 mm.
3. Incubare i vetrini in una camera umida per 30 min a 37 gradi centigradi.

8. Amplificazione

NOTA: l'utilizzo di reagenti di rilevamento con fluorofori rossi (Tabella dei materiali) determina la minor quantità di fondo nel tessuto C. elegans.

1. Lavare i vetrini 2x per 5 min con 50 mL di 1x tampone di lavaggio A a RT in un barattolo Coplin. Impostare il barattolo Coplin su uno shaker orbitale impostato su 60 giri/min.
2. Diluire il buffer rosso amplificazione (Tabella dei materiali) 1:5 con acqua ultrapura. Utilizzare questo buffer per diluire la polimerasi (Tabella dei materiali) 1:80 per preparare un supporto funzionante di soluzione di amplificazione e proteggere dalla luce.
   1. Posizionare il vetrino su un tovagliolo di carta per far scorrere il tampone di lavaggio dal vetrino e pulire delicatamente i bordi. Applicare 40 l della soluzione di amplificazione a ogni spazio di 14 mm x 14 mm.
3. Incubare i vetrini in una camera umida per 1 h e 40 min a 37 gradi centigradi. Assicurarsi che la camera umida sia coperta con lamina per proteggere i campioni dalla luce.

9. Fusti finali

1. Lavare i vetrini 2x per 10 min con 50 mL di 1x tamponi di lavaggio B (Tabella dei materiali) a RT in un barattolo Coplin. Impostare il barattolo Coplin su uno shaker orbitale impostato su 60 giri/min.
2. Lavare i vetrini 1x per 1 min con 50 mL di 0,01x tamponi di lavaggio B a RT in un barattolo Coplin. Impostare il barattolo Coplin su uno shaker orbitale impostato su 60 giri/min. Questo buffer viene preparato diluindo il tampone di lavaggio B con acqua ultrapura.

10. Montaggio coverslip

1. Lasciare che il buffer lavaggio in eccesso scada il vetrino su un tovagliolo di carta e pulisca qualsiasi tampone residuo rimanente sul perimetro rivestito di epossidica del vetrino.
2. Aggiungete 10 l di supporto di montaggio (Table of Materials) per campionare e appoggiare delicatamente un coperchio sulla parte superiore, consentendo al supporto di montaggio di stenderlo.
3. Dipingere intorno al bordo della coverslip con smalto per sigillare la coverslip e lo scivolo. Essere delicato con l'applicazione di smalto per evitare di spostare il coperchio, che danneggerà le germinali. Lasciare indurire lo smalto per almeno 20 min a RT, mentre i vetrini sono protetti dalla luce, prima di vederlo al microscopio.
4. Conservare le diapositive in un contenitore scuro o in un supporto di diapositive, poiché i campioni con etichetta PLA sono sensibili alla luce. Il produttore suggerisce che i vetrini possono essere immagazzinati a -20 gradi centigradi per lo stoccaggio a lungo termine o a 4 gradi centigradi per lo stoccaggio a breve termine. Le diapositive preparate con questo protocollo dureranno almeno 2 mesi se conservate a 20 gradi centigradi.

11. Acquisizione di immagini

1. Ai fini della quantificazione, utilizzare un microscopio confocale per catturare immagini di germi estrusi che sono in chiara vista, intatti e senza ostacoli. Cattura uno z-stack della germinale che si estende su tutta la germinale nel piano z e genera un'immagine di proiezione massima da utilizzare per la quantificazione.
   NOTA: la microscopia confocale è ideale per ottenere e quantificare le immagini PLA con meno sottofondo rispetto a quelle ottenute utilizzando un microscopio epifluorescente.
   1. Se la linea germinale non rientra in un campo visivo, acquisire i campi di vista sovrapposti come necessario per l'immagine dell'intera linea germinale. Il massimo delle proiezioni di queste immagini può essere cucito insieme in FIJI.
2. Assicurarsi di mantenere le condizioni di imaging lo stesso tra il controllo e campioni sperimentali per impostare una soglia equa e adeguata per l'identificazione dei foci durante l'analisi delle immagini.
   NOTA: Registrare almeno 8-10 germinali da ogni campione per replica per facilitare l'analisi statistica della quantificazione del PLA. Per il PLA si raccomandano almeno tre repliche biologiche per ottenere risultati quantitativi affidabili e coerenti.

12. Analisi e quantificazione delle immagini mediante FIJI/ImageJ

NOTA: il flusso di lavoro seguente si basa su immagini acquisite utilizzando l'obiettivo 40x al microscopio confocale, in cui le immagini vengono salvate nel formato .czi. Queste immagini .czi e i relativi metadati, incluse le dimensioni, sono accessibili e aperti in FIJI/ImageJ per ulteriori analisi. Va verificato se FIJI accetta il formato dei file confocali dal confocaldisponibile per l'utente specifico. In caso contrario, le immagini in formato .tiff possono essere utilizzate in alternativa per l'analisi, ma l'utente dovrà impostare manualmente la scala dell'immagine in FIJI/ImageJ (Analyze Impostare la scala). Si consiglia di analizzare prima tutte le immagini di controllo negativo per stabilire il livello di sfondo.

1. Avviare il flusso di lavoro di analisi analizzando prima tutte le immagini di controllo negativo, quindi passare ai campioni sperimentali. Aprire un'immagine di proiezione massima in FIJI/ImmagineJ da analizzare (Figura 2A). Se si utilizza un file .czi, verrà visualizzata una casella Opzioni di importazione Bioformati.
   1. Includere le seguenti opzioni per aprire l'immagine: stack di viste con Browser dati; modalità colore - Colorata. Una finestra con l'immagine dovrebbe ora aprirsi con una barra di scorrimento per passare da un canale all'altro catturato da confocal (ad esempio, DAPI o PLA).
   2. Se è necessario unire le immagini, creare duplicati di ogni canale da ogni immagine selezionando l'immagine con il pulsante destro del mouse e selezionando Duplica per aprire la finestra Duplica. Specificare solo il numero di canale (c) corrispondente al canale PLA o DAPI (ad esempio, 2) e deselezionare la casella Duplicate Hyperstack.
   3. Con entrambe le immagini da cucire aperte, selezionare Plugins Cucitura Proprietà Deprecato . Cuciture 2D. Si aprirà la finestra Stitching of 2D Images. Selezionare le immagini da utilizzare per la cucitura e utilizzare i parametri predefiniti preimpostati nella finestra, quindi selezionare Ok. L'immagine risultante sarà un'immagine in scala di grigi assemblata.
      NOTA: Se le immagini secondarie non si allineano perfettamente, regolando i parametri (ad esempio, aumentando il numero di picchi da controllare da 5 a 500 o modificando il metodo di fusione da Fusione lineare a Max. Intensità) può aiutare a ottenere l'immagine desiderata. Mentre sono disponibili altri strumenti di cucitura, questo approccio mantiene la dimensionalità dell'immagine, che è importante per la quantificazione.
2. Aprire il gestore del ROI (Regione di interesse) premendo T sulla tastiera. Si aprirà una nuova finestra denominata Gestione ROI.
3. Selezionare lo strumento poligono dalla casella del set di strumenti FIJI. Rilasciare punti intorno alla linea germinale per delinearla e generare un ROI (Figura 2B). Collegare l'ultimo punto al primo per generare un ROI completo.
   NOTA: per le immagini più scure, è utile regolare il contrasto per migliorare la visibilità della linea germinale (reversibile) in modo che possa essere delineata in modo più accurato.
   1. Subito dopo aver completato il ROI, vai al gestore del ROI e seleziona Aggiungi [t] per memorizzare il ROI. È imperativo che qualsiasi modifica al ROI, inclusa l'aggiunta/rimozione di punti o il movimento del ROI e dei punti, venga aggiornata (selezionare Aggiorna dal gestore del ROI) prima di procedere al passaggio successivo, altrimenti andranno persi. Ulteriori dettagli sulla manipolazione dei ROI e dei loro punti sono disponibili nella Guida per l'utente DI FIJI/ImageJ.
4. Una volta impostato l'orientamento del ROI, è possibile salvarlo per riferimento futuro selezionando il nome del ROI nel gestore del ROI seguito da Altro . Proprietà Save . (nome file e specificare la destinazione da salvare). I ROI salvati possono essere aperti nel gestore del ROI selezionando Altro Proprietà Open . (selezionare il file).
5. Misurare l'area all'interno del ROI selezionando il nome del ROI dal gestore del ROI, quindi selezionando il pulsante Misura nel gestore del ROI. Verrà visualizzata una finestra Risultati con informazioni sul ROI, inclusa²l'area che copre nell'immagine (inset di Figura 2B). Registrare queste informazioni in un foglio di calcolo per i calcoli successivi.
   NOTA: Assicurarsi che la scala dell'immagine sia stata impostata correttamente in modo da raccogliere le dimensioni corrette del ROI. I tipi di misurazioni riportati nella casella Risultati possono essere modificati accedendo a Analisi Imposta misure....
6. Aprire un'immagine duplicata solo del canale PLA selezionando a destra l'immagine PLA e selezionando Duplica (Figura 2C). Si aprirà una finestra Duplica. Specificare solo il numero di canale (c) corrispondente al canale PLA (ad esempio, 2) e deselezionare la casella Duplica Hyperstack. La duplicazione di questa immagine è consigliata in modo che l'immagine originale non venga modificata.
   NOTA: queste opzioni vengono visualizzate solo quando si visualizzano le immagini contenenti più canali su FIJI/ImageJ. Un approccio alternativo è quello di dividere i canali Immagine Proprietà Color (Colore) Dividi canali, ma questo modificherà il file di immagine originale.
7. Con l'opzione Solo l'immagine del canale PLA selezionata, vai a Immagine Proprietà Adjust (Regolare) Soglia. Si aprirà una finestra Soglia per l'immagine. Selezionare Predefinito come metodo di soglia, Rosso come colore e selezionare la casella Sfondo scuro. Utilizzando la traccia superiore della finestra, far scorrere la barra verso destra fino a quando tutti i foci PLA non sono evidenziati distintamente nell'immagine.
   1. Registrare il valore nella casella a destra della traccia superiore e prendere nota del valore utilizzato per impostare la soglia. Selezionare Applica nella finestra Soglia per finalizzare la soglia e l'immagine verrà convertita in uno sfondo bianco con solo la soglia foci visibile come punti neri (Figura 2D). Testare la soglia su diverse immagini di controllo negativo per assicurarsi che sia appropriata per acquisire tutti i foci PLA da un'immagine all'altro prima della quantificazione.
      NOTA: per visualizzare i foci di soglia come punti neri su sfondo bianco, passare a Processo Proprietà Binary . Opzioni... e deselezionare la casella Sfondo nero. Un valore soglia compreso tra 30-40 è un buon punto di partenza per identificare il PLA nella linea germinale; tuttavia, il valore ideale può variare a seconda dello sfondo.
8. Per quantificare i foci PLA, applicare il ROI generato dai passaggi 12.3-12.3.1 all'immagine di soglia selezionando il nome del ROI dalla finestra di gestione del ROI. Il contorno del ROI dovrebbe essere visualizzato sull'immagine nella stessa posizione dell'immagine di origine (Figura 2E).
   1. Vai a Analizzare Analizzare le particelle. Si aprirà la finestra Analizza particelle e si selezionano i seguenti parametri: size (micron- 2) - 0-Infinity, circolarità - 0,00-1,00, mostrano : Nothing. Selezionare la casella Riepiloga.
   2. Selezionare Oke verrà visualizzata una tabella di riepilogo con informazioni sul ROI (ad esempio, il conteggio totale dei foci PLA, l'area totale occupata dai foci PLA all'interno del ROI, la dimensione media dei foci PLA e la percentuale di area occupata dai foci PLA rispetto alle dimensioni del ROI) (insetto della Figura 2E). Registrare queste misurazioni in un foglio di calcolo.
9. Ripetere i passaggi da 12.1-12.8 per diverse immagini di controllo negativo utilizzando la stessa soglia.
   1. Una volta analizzate tutte le immagini di controllo negativo, ripetere i passaggi da 12.1-12.8 per tutti i campioni sperimentali utilizzando la stessa soglia determinata dal controllo negativo per identificare e quantificare i focolai di PLA.

Risultati

Co-immunostaining di entrambi 3xFLAG::DLC-1; GFP e 3xFLAG::DLC-1; Le germinali OMA-1::GFP con anticorpi FLAG e GFP hanno rivelato i loro modelli di espressione nella linea germinale (Figura 3Aii-iii,3Bii-iii). Mentre GFP è stato espresso in tutta la linea germinale (Figura 3Aiii), l'espressione OMA-1::GFP è stata limitata al tardo pachytene e agli ovociti (Figura 3

Discussione

Quando si studiano gli IPP nella germinacina C. elegans, la risoluzione più alta offerta dalla PLA rispetto alla co-immunostaining consente la visualizzazione e la quantificazione dei luoghi in cui si verificano interazioni nella linea germinale. È stato precedentemente riportato che DLC-1 interagisce direttamente con OMA-1 utilizzando un asdetto pulldown GST in vitro ²⁶; tuttavia, questa interazione non è stata recuperata da un pulldown in vivo. La co-immunostaining fluorescente...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
16% soluzione di paraformaldeide	Servizi di microscopia elettronica	15710	utilizzato per fare il 4% soluzione di lavoro
1M KH2PO4	Sigma	P0662	Preparare un magazzino di lavoro 1M
1x M9	vari	vari	preparati come 10x stock utilizzato a 1x; vedere wormbook.org per il protocollo
1x PBS	vari	vari	vedere wormbook.org per il protocollo
26.5 Gauge Needle	Exel International	26402	Aghi utilizzati per la dissezione
BSA	Lampire	7500802
Centrifuge Tubes	Thermo Scientific	05-529C	Provetta da centrifuga Oak Ridge da 50 ml utilizzata per la sincronizzazione
Microscopio confocale	Zeiss	880
Coplin Jar	PolyLab	62101
Vetrino coprioggetti per congelare il campione	Globe Scientific	1411-10	22x40mm, n. 1
vetrino coprioggetti per sigillare il vetrino	Globe Scientific	1404-15	22x22mm, n. 1,5
DAPI Terreno di montaggio per vettore di immunofluorescenza		H-1200
Ligasi	Sigma-Aldrich	DUO82029	Duolink 1x ligasi, viene fornito come parte del kit di reagenti per la rilevazione in situ Duolink Rosso DUO92008
Tampone rosso di amplificazione	Sigma-Aldrich	DUO82011	Duolink 5x Tampone rosso di amplificazione, viene fornito come parte del kit di reagenti per la rilevazione in situ Duolink Red DUO92008
tampone di legatura	Sigma-Aldrich	DUO82009	Duolink 5x, viene fornito come parte del kit di reagenti per la rilevazione in situ Duolink Red DUO92008
Diluente anticorpale	Sigma-Aldrich	DUO82008	Diluente per anticorpi Duolink, viene fornito con DUO92004 e DUO92002, Nota: una soluzione 1x PBS/1% BSA può essere utilizzata anche come sostituto per diluire l'anticorpo.
Soluzione di blocco	Sigma-Aldrich	DUO82007	Soluzione di blocco Duolink, viene fornito con DUO92004 e DUO92002
mezzo di montaggio per PLA	Mezzo di montaggio in situ Sigma-Aldrich	DUO82040	Duolink con sonda DAPI
MINUS Sonda	Sigma-Aldrich	DUO92004	Duolink Sonda in situ Anti-Mouse Sonda MINUS
PLUS Sonda	in situ Sigma-Aldrich	DUO92002	Duolink Tampone di lavaggio Anti-Rabbit PLUS
A	Sigma-Aldrich	DUO82046	Duolink Tampone di lavaggio in situ A
Tampone di lavaggio B	Sigma-Aldrich	DUO82048	Duolink Tampone di lavaggio in situ B
Polimerasi	Sigma-Aldrich	DUO82030	Duolink polimerasi, viene fornito come parte del kit rosso di reagenti per la rilevazione in situ Duolink DUO92008
microscopio a epifluorescenza	Leica		DFC300G fotocamera, microscopio DM5500B
Capra anti-topo Alexa 594	JacksonImmuno	115-585-146	Utilizzo a 1:500
Capra anti-coniglio Alexa 488	JacksonImmuno	111-545-144	Utilizzo a 1:200
Software di elaborazione delle immagini	Adobe		Adobe Photoshop + Illsutrator CS3
Pipetta in vetro	Corning	7095B-5X
Levamisole	ACROS Organici	187870100	Preparare un brodo di lavoro da 250 mM
Metanolo	Fisher Scientific	A454
Topo anti-FLAG	Sigma	F1804	Utilizzare a 1:1000 per immunofluorescenza e PLA, pre-blocco con siero di capra normale consigliato
Smalto per unghie	colori L.A.	CNP195
Nematode Growth Medium (NGM)	vari		Vedere wormbook.org per protocollo
Siero di capra normale	JacksonImmuno	005-000-121
Polietilene Pasteur Pipetta	Globe Scientific	135030
Poli-L-Lisina	Sigma-Aldrich	P1524	Preparato come soluzione madre allo 0,1% in acqua, conservato a -20C e diluito 1:100 in acqua per rivestire i vetrini
Piastre di Petri	Tritech	PD7060	Coniglio da 60 mm di diametro
anti-GFP	Thermo Fisher	G10362	Utilizzare in 1:200 per l'immunofluorescenza, 1:4000 per
i vetrini	Thermo Fisher	30-2066A-Brown	I vetrini autoclavabili a tre quadrati 14x14 mm con barre sono ordinati su misura tramite Fisher Scientific. Poli-L-lisina aggiunta ai vetrini in laboratorio
Soluzione di ipoclorito di sodio	Fisher Scientific	SS290-1
salviette per attività	Kimtech	34120	4,4x8,4 pollici salviette per attività
Vassoi (242x241x20 mm)	Thermo Fisher	240845	Utilizzato per realizzare la camera umida
Triton X-100	ACROS Organics	327372500
Acqua ultrapura	Milli-Q		Acqua ultrapura ottenuta dal sistema di purificazione dell'acqua integrale Milli-Q
Watchglass	Carolina Biological	742300-20
C congelatore-80
° C congelatore
Foglio
OP50 ceppo E. coli
Orbital Shaker
Tape
Nematodi ceppi utilizzati in questo studio (entrambi disponibili su richiesta)
mntSi13[pME4.1] II; unc-119(ed3) III; teIs1 [pRL475]		UMT 376	dlc-1 prom::3xFLAG::d lc-1::d lc-1 3'UTR; oma-1 prom::oma-1::GFP; Riferimento 24
mntSi13[pME4.1] II; mntSi21[pXW6.22] unc-119(ed3) III	UMT 422		dlc-1 prom::3xFLAG::d lc-1::d lc-1 3'UTR; gld-1 prom::ceGFP::fbf-1 3'UTR + unc-119(+); Riferimento: questo studio