Articolo metodologico

In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly nella C. elegans Germline utilizzando Proximity Ligation Assay

DOI:

10.3791/60982

5 maggio 2020

In questo articolo

Sommario

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$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo dimostra l'uso del saggio di legatura di prossimità per sondare le interazioni proteina-proteina in situ nella germinale C. elegans.

Abstract

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Comprendere quando e dove si verificano interazioni proteina-proteina (IPP) è fondamentale per comprendere la funzione delle proteine nella cellula e in che modo processi più ampi come lo sviluppo sono influenzati. La germina Caenorhabditis elegans è un ottimo sistema modello per studiare gli IPP che sono legati alla regolazione delle cellule staminali, della meiosi e dello sviluppo. Ci sono una varietà di tecniche ben sviluppate che consentono alle proteine di interesse di essere etichettate per il riconoscimento da parte di anticorpi standard, rendendo questo sistema vantaggioso per le reazioni di analisi di legatura di prossimità (PLA). Di conseguenza, il PLA è in grado di mostrare dove gli IPP si verificano in modo spaziale e temporale nelle linee germinali in modo più efficace rispetto agli approcci alternativi. Descritto qui è un protocollo per l'applicazione e la quantificazione di questa tecnologia per sondare gli IPP nella linea germinale di C. elegans.

Introduzione

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Si stima che oltre l'80% delle proteine abbia interazioni con altre molecole1, il che sottolinea quanto siano importanti gli IPP per l'esecuzione di specifiche funzioni biologiche nella cellula2. Alcune proteine funzionano come hub che facilitano l'assemblaggio di complessi più grandi che sono necessari per la sopravvivenza delle cellule1. Questi hub mediano più IPP e aiutano a organizzare le proteine in una rete che facilita funzioni specifiche in una cella3 . La formazione di complessi proteici è influenzata anche dal contesto biologico, come la presenza o l'assenza di sp....

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Protocollo

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NOTA: questo protocollo utilizza ceppi C. elegans in cui i potenziali partner interagenti sono entrambi contrassegnati. Si raccomanda vivamente di utilizzare una deformazione di controllo negativo, in cui una proteina con tag non dovrebbe interagire con un altro partner di interazione candidato con tag. Qui, GFP da solo è stato utilizzato come un controllo negativo per valutare lo sfondo, come DLC-1 non dovrebbe interagire con GFP nel worm. OMA-1 con tag GFP è stato usato come ceppo sperimentale, poiché i dati preliminari suggeriscono un'interazione con DLC-1. I ceppi di nematode co-esprimono il controllo e le proteine di prova con il DLC-1 con etichetta 3xFL....

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Risultati

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Co-immunostaining di entrambi 3xFLAG::DLC-1; GFP e 3xFLAG::DLC-1; Le germinali OMA-1::GFP con anticorpi FLAG e GFP hanno rivelato i loro modelli di espressione nella linea germinale (Figura 3Aii-iii,3Bii-iii). Mentre GFP è stato espresso in tutta la linea germinale (Figura 3Aiii), l'espressione OMA-1::GFP è stata limitata al tardo pachytene e agli ovociti (Figura 3

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Discussione

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Quando si studiano gli IPP nella germinacina C. elegans, la risoluzione più alta offerta dalla PLA rispetto alla co-immunostaining consente la visualizzazione e la quantificazione dei luoghi in cui si verificano interazioni nella linea germinale. È stato precedentemente riportato che DLC-1 interagisce direttamente con OMA-1 utilizzando un asdetto pulldown GST in vitro 26; tuttavia, questa interazione non è stata recuperata da un pulldown in vivo. La co-immunostaining fluorescente.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti di interesse.

Ringraziamenti

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Alcuni ceppi di nematodi utilizzati in questo studio sono stati forniti dal Caenorhabditis Genetics Center finanziato dal NIH (P40OD010440). La microscopia confocale è stata eseguita nel Laboratorio di ricerca del nucleo dell'Università del Montana BioSpectroscopia operato con il supporto di NIH Awards P20GM103546 e S10OD021806. Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalla sovvenzione NIH GM109053 a E.V., dalla American Heart Association Fellowship 18PRE34070028 a X.W., e dal premio Montana Academy of Sciences a X.W. I finanziatori non sono stati coinvolti nella progettazione dello studio o nella redazione della relazione. Ringraziamo M. Ellenbecker per la ....

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
16% soluzione di paraformaldeideServizi di microscopia elettronica15710utilizzato per fare il 4% soluzione di lavoro
1M KH2PO4SigmaP0662Preparare un magazzino di lavoro 1M
1x M9varivaripreparati come 10x stock utilizzato a 1x; vedere wormbook.org per il protocollo
1x PBSvarivarivedere wormbook.org per il protocollo
26.5 Gauge NeedleExel International26402Aghi utilizzati per la dissezione
BSALampire7500802
Centrifuge TubesThermo Scientific05-529CProvetta da centrifuga Oak Ridge da 50 ml utilizzata per la sincronizzazione
Microscopio confocaleZeiss880
Coplin JarPolyLab62101
Vetrino coprioggetti per congelare il campioneGlobe Scientific1411-1022x40mm, n. 1
vetrino coprioggetti per sigillare il vetrinoGlobe Scientific1404-1522x22mm, n. 1,5
DAPI Terreno di montaggio per vettore di immunofluorescenzaH-1200
LigasiSigma-AldrichDUO82029Duolink 1x ligasi, viene fornito come parte del kit di reagenti per la rilevazione in situ Duolink Rosso DUO92008
Tampone rosso di amplificazioneSigma-AldrichDUO82011Duolink 5x Tampone rosso di amplificazione, viene fornito come parte del kit di reagenti per la rilevazione in situ Duolink Red DUO92008
tampone di legaturaSigma-AldrichDUO82009Duolink 5x, viene fornito come parte del kit di reagenti per la rilevazione in situ Duolink Red DUO92008
Diluente anticorpaleSigma-AldrichDUO82008Diluente per anticorpi Duolink, viene fornito con DUO92004 e DUO92002, Nota: una soluzione 1x PBS/1% BSA può essere utilizzata anche come sostituto per diluire l'anticorpo.
Soluzione di bloccoSigma-AldrichDUO82007Soluzione di blocco Duolink, viene fornito con DUO92004 e DUO92002
mezzo di montaggio per PLAMezzo di montaggio in situ Sigma-AldrichDUO82040Duolink con sonda DAPI
MINUS SondaSigma-AldrichDUO92004Duolink Sonda in situ Anti-Mouse Sonda MINUS
PLUS Sondain situ Sigma-AldrichDUO92002Duolink Tampone di lavaggio Anti-Rabbit PLUS
ASigma-AldrichDUO82046Duolink Tampone di lavaggio in situ A
Tampone di lavaggio BSigma-AldrichDUO82048Duolink Tampone di lavaggio in situ B
PolimerasiSigma-AldrichDUO82030Duolink polimerasi, viene fornito come parte del kit rosso di reagenti per la rilevazione in situ Duolink DUO92008
microscopio a epifluorescenzaLeicaDFC300G fotocamera, microscopio DM5500B
Capra anti-topo Alexa 594JacksonImmuno115-585-146Utilizzo a 1:500
Capra anti-coniglio Alexa 488JacksonImmuno111-545-144Utilizzo a 1:200
Software di elaborazione delle immaginiAdobeAdobe Photoshop + Illsutrator CS3
Pipetta in vetroCorning7095B-5X
LevamisoleACROS Organici187870100Preparare un brodo di lavoro da 250 mM
MetanoloFisher ScientificA454
Topo anti-FLAGSigmaF1804Utilizzare a 1:1000 per immunofluorescenza e PLA, pre-blocco con siero di capra normale consigliato
Smalto per unghiecolori L.A.CNP195
Nematode Growth Medium (NGM)variVedere wormbook.org per protocollo
Siero di capra normaleJacksonImmuno005-000-121
Polietilene Pasteur PipettaGlobe Scientific135030
Poli-L-LisinaSigma-AldrichP1524Preparato come soluzione madre allo 0,1% in acqua, conservato a -20C e diluito 1:100 in acqua per rivestire i vetrini
Piastre di PetriTritechPD7060Coniglio da 60 mm di diametro
anti-GFPThermo FisherG10362Utilizzare in 1:200 per l'immunofluorescenza, 1:4000 per
i vetriniThermo Fisher30-2066A-BrownI vetrini autoclavabili a tre quadrati 14x14 mm con barre sono ordinati su misura tramite Fisher Scientific. Poli-L-lisina aggiunta ai vetrini in laboratorio
Soluzione di ipoclorito di sodioFisher ScientificSS290-1
salviette per attivitàKimtech341204,4x8,4 pollici salviette per attività
Vassoi (242x241x20 mm)Thermo Fisher240845Utilizzato per realizzare la camera umida
Triton X-100ACROS Organics327372500
Acqua ultrapuraMilli-QAcqua ultrapura ottenuta dal sistema di purificazione dell'acqua integrale Milli-Q
WatchglassCarolina Biological742300-20
C congelatore-80
° C congelatore
Foglio
OP50 ceppo E. coli
Orbital Shaker
Tape
Nematodi ceppi utilizzati in questo studio (entrambi disponibili su richiesta)
mntSi13[pME4.1] II; unc-119(ed3) III; teIs1 [pRL475]UMT 376dlc-1 prom::3xFLAG::d lc-1::d lc-1 3'UTR; oma-1 prom::oma-1::GFP; Riferimento 24
mntSi13[pME4.1] II; mntSi21[pXW6.22] unc-119(ed3) IIIUMT 422dlc-1 prom::3xFLAG::d lc-1::d lc-1 3'UTR; gld-1 prom::ceGFP::fbf-1 3'UTR + unc-119(+); Riferimento: questo studio
in PLA di alluminio

Riferimenti

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$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Berggård, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
  2. Nooren, I. M., Thornton, J. M. Diversity of protein-protein interactions. EMBO Journal. 22 (14), 3486-3492 (2003).
  3. Patil, A.....

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