In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly nella C. elegans Germline utilizzando Proximity Ligation Assay

Sommario

Questo protocollo dimostra l'uso del saggio di legatura di prossimità per sondare le interazioni proteina-proteina in situ nella germinale C. elegans.

Abstract

Comprendere quando e dove si verificano interazioni proteina-proteina (IPP) è fondamentale per comprendere la funzione delle proteine nella cellula e in che modo processi più ampi come lo sviluppo sono influenzati. La germina Caenorhabditis elegans è un ottimo sistema modello per studiare gli IPP che sono legati alla regolazione delle cellule staminali, della meiosi e dello sviluppo. Ci sono una varietà di tecniche ben sviluppate che consentono alle proteine di interesse di essere etichettate per il riconoscimento da parte di anticorpi standard, rendendo questo sistema vantaggioso per le reazioni di analisi di legatura di prossimità (PLA). Di conseguenza, il PLA è in grado di mostrare dove gli IPP si verificano in modo spaziale e temporale nelle linee germinali in modo più efficace rispetto agli approcci alternativi. Descritto qui è un protocollo per l'applicazione e la quantificazione di questa tecnologia per sondare gli IPP nella linea germinale di C. elegans.

Introduzione

Si stima che oltre l'80% delle proteine abbia interazioni con altre molecole¹, il che sottolinea quanto siano importanti gli IPP per l'esecuzione di specifiche funzioni biologiche nella cellula². Alcune proteine funzionano come hub che facilitano l'assemblaggio di complessi più grandi che sono necessari per la sopravvivenza delle cellule¹. Questi hub mediano più IPP e aiutano a organizzare le proteine in una rete che facilita funzioni specifiche in una cella^{3 .} La formazione di complessi proteici è influenzata anche dal contesto biologico, come la presenza o l'assenza di sp....

Protocollo

NOTA: questo protocollo utilizza ceppi C. elegans in cui i potenziali partner interagenti sono entrambi contrassegnati. Si raccomanda vivamente di utilizzare una deformazione di controllo negativo, in cui una proteina con tag non dovrebbe interagire con un altro partner di interazione candidato con tag. Qui, GFP da solo è stato utilizzato come un controllo negativo per valutare lo sfondo, come DLC-1 non dovrebbe interagire con GFP nel worm. OMA-1 con tag GFP è stato usato come ceppo sperimentale, poiché i dati preliminari suggeriscono un'interazione con DLC-1. I ceppi di nematode co-esprimono il controllo e le proteine di prova con il DLC-1 con etichetta 3xFL....

Risultati

Co-immunostaining di entrambi 3xFLAG::DLC-1; GFP e 3xFLAG::DLC-1; Le germinali OMA-1::GFP con anticorpi FLAG e GFP hanno rivelato i loro modelli di espressione nella linea germinale (Figura 3Aii-iii,3Bii-iii). Mentre GFP è stato espresso in tutta la linea germinale (Figura 3Aiii), l'espressione OMA-1::GFP è stata limitata al tardo pachytene e agli ovociti (Figura 3

Discussione

Quando si studiano gli IPP nella germinacina C. elegans, la risoluzione più alta offerta dalla PLA rispetto alla co-immunostaining consente la visualizzazione e la quantificazione dei luoghi in cui si verificano interazioni nella linea germinale. È stato precedentemente riportato che DLC-1 interagisce direttamente con OMA-1 utilizzando un asdetto pulldown GST in vitro ²⁶; tuttavia, questa interazione non è stata recuperata da un pulldown in vivo. La co-immunostaining fluorescente.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
16% soluzione di paraformaldeide	Servizi di microscopia elettronica	15710	utilizzato per fare il 4% soluzione di lavoro
1M KH2PO4	Sigma	P0662	Preparare un magazzino di lavoro 1M
1x M9	vari	vari	preparati come 10x stock utilizzato a 1x; vedere wormbook.org per il protocollo
1x PBS	vari	vari	vedere wormbook.org per il protocollo
26.5 Gauge Needle	Exel International	26402	Aghi utilizzati per la dissezione
BSA	Lampire	7500802
Centrifuge Tubes	Thermo Scientific	05-529C	Provetta da centrifuga Oak Ridge da 50 ml utilizzata per la sincronizzazione
Microscopio confocale	Zeiss	880
Coplin Jar	PolyLab	62101
Vetrino coprioggetti per congelare il campione	Globe Scientific	1411-10	22x40mm, n. 1
vetrino coprioggetti per sigillare il vetrino	Globe Scientific	1404-15	22x22mm, n. 1,5
DAPI Terreno di montaggio per vettore di immunofluorescenza		H-1200
Ligasi	Sigma-Aldrich	DUO82029	Duolink 1x ligasi, viene fornito come parte del kit di reagenti per la rilevazione in situ Duolink Rosso DUO92008
Tampone rosso di amplificazione	Sigma-Aldrich	DUO82011	Duolink 5x Tampone rosso di amplificazione, viene fornito come parte del kit di reagenti per la rilevazione in situ Duolink Red DUO92008
tampone di legatura	Sigma-Aldrich	DUO82009	Duolink 5x, viene fornito come parte del kit di reagenti per la rilevazione in situ Duolink Red DUO92008
Diluente anticorpale	Sigma-Aldrich	DUO82008	Diluente per anticorpi Duolink, viene fornito con DUO92004 e DUO92002, Nota: una soluzione 1x PBS/1% BSA può essere utilizzata anche come sostituto per diluire l'anticorpo.
Soluzione di blocco	Sigma-Aldrich	DUO82007	Soluzione di blocco Duolink, viene fornito con DUO92004 e DUO92002
mezzo di montaggio per PLA	Mezzo di montaggio in situ Sigma-Aldrich	DUO82040	Duolink con sonda DAPI
MINUS Sonda	Sigma-Aldrich	DUO92004	Duolink Sonda in situ Anti-Mouse Sonda MINUS
PLUS Sonda	in situ Sigma-Aldrich	DUO92002	Duolink Tampone di lavaggio Anti-Rabbit PLUS
A	Sigma-Aldrich	DUO82046	Duolink Tampone di lavaggio in situ A
Tampone di lavaggio B	Sigma-Aldrich	DUO82048	Duolink Tampone di lavaggio in situ B
Polimerasi	Sigma-Aldrich	DUO82030	Duolink polimerasi, viene fornito come parte del kit rosso di reagenti per la rilevazione in situ Duolink DUO92008
microscopio a epifluorescenza	Leica		DFC300G fotocamera, microscopio DM5500B
Capra anti-topo Alexa 594	JacksonImmuno	115-585-146	Utilizzo a 1:500
Capra anti-coniglio Alexa 488	JacksonImmuno	111-545-144	Utilizzo a 1:200
Software di elaborazione delle immagini	Adobe		Adobe Photoshop + Illsutrator CS3
Pipetta in vetro	Corning	7095B-5X
Levamisole	ACROS Organici	187870100	Preparare un brodo di lavoro da 250 mM
Metanolo	Fisher Scientific	A454
Topo anti-FLAG	Sigma	F1804	Utilizzare a 1:1000 per immunofluorescenza e PLA, pre-blocco con siero di capra normale consigliato
Smalto per unghie	colori L.A.	CNP195
Nematode Growth Medium (NGM)	vari		Vedere wormbook.org per protocollo
Siero di capra normale	JacksonImmuno	005-000-121
Polietilene Pasteur Pipetta	Globe Scientific	135030
Poli-L-Lisina	Sigma-Aldrich	P1524	Preparato come soluzione madre allo 0,1% in acqua, conservato a -20C e diluito 1:100 in acqua per rivestire i vetrini
Piastre di Petri	Tritech	PD7060	Coniglio da 60 mm di diametro
anti-GFP	Thermo Fisher	G10362	Utilizzare in 1:200 per l'immunofluorescenza, 1:4000 per
i vetrini	Thermo Fisher	30-2066A-Brown	I vetrini autoclavabili a tre quadrati 14x14 mm con barre sono ordinati su misura tramite Fisher Scientific. Poli-L-lisina aggiunta ai vetrini in laboratorio
Soluzione di ipoclorito di sodio	Fisher Scientific	SS290-1
salviette per attività	Kimtech	34120	4,4x8,4 pollici salviette per attività
Vassoi (242x241x20 mm)	Thermo Fisher	240845	Utilizzato per realizzare la camera umida
Triton X-100	ACROS Organics	327372500
Acqua ultrapura	Milli-Q		Acqua ultrapura ottenuta dal sistema di purificazione dell'acqua integrale Milli-Q
Watchglass	Carolina Biological	742300-20
C congelatore-80
° C congelatore
Foglio
OP50 ceppo E. coli
Orbital Shaker
Tape
Nematodi ceppi utilizzati in questo studio (entrambi disponibili su richiesta)
mntSi13[pME4.1] II; unc-119(ed3) III; teIs1 [pRL475]		UMT 376	dlc-1 prom::3xFLAG::d lc-1::d lc-1 3'UTR; oma-1 prom::oma-1::GFP; Riferimento 24
mntSi13[pME4.1] II; mntSi21[pXW6.22] unc-119(ed3) III	UMT 422		dlc-1 prom::3xFLAG::d lc-1::d lc-1 3'UTR; gld-1 prom::ceGFP::fbf-1 3'UTR + unc-119(+); Riferimento: questo studio

in PLA di alluminio