Vi presentiamo un flusso di lavoro liberamente disponibile costruito per una rapida esplorazione e analisi accurata dei corpi cellulari in specifici compartimenti cellulari in immagini di microscopia a fluorescenza. Questo flusso di lavoro user-friendly è progettato sul software open-source E utilizza anche funzionalità ImageJ. La pipeline è conveniente senza conoscere l'analisi delle immagini.
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Articolo metodologico
Substructure Analyzer: un flusso di lavoro facile da usare per l'esplorazione rapida e l'analisi accurata dei corpi cellulari nelle immagini di microscopia a fluorescenza
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'ultimo decennio è stato caratterizzato da scoperte nelle tecniche di microscopia a fluorescenza illustrate dal miglioramento della risoluzione spaziale, ma anche nell'imaging a cellule vive e nelle tecniche di microscopia ad alto consumo. Ciò ha portato ad un costante aumento della quantità e della complessità dei dati di microscopia per un singolo esperimento. Poiché l'analisi manuale dei dati di microscopia richiede molto tempo, soggettiva e proibisce l'analisi quantitativa, l'automazione dell'analisi delle immagini biologiche sta diventando quasi inevitabile. Abbiamo costruito un flusso di lavoro informatico chiamato Substructure Analyzer per automatizzare completamente l'analisi del segnale in bioimmagini dalla microscopia fluorescente. Questo flusso di lavoro è sviluppato sulla piattaforma open source user-friendly Icy ed è completato da funzionalità da ImageJ. Esso comprende la pre-elaborazione delle immagini per migliorare il rapporto segnale-rumore, la segmentazione individuale delle cellule (rilevamento dei confini cellulari) e la rilevazione/quantificazione dei corpi cellulari arricchiti in specifici compartimenti cellulari. Il vantaggio principale di questo flusso di lavoro è quello di proporre complesse funzionalità di bio-imaging agli utenti senza esperienza di analisi delle immagini attraverso un'interfaccia user-friendly. Inoltre, è altamente modulare e adattato a diverse questioni, dalla caratterizzazione della traslocazione nucleare/citoplasmatica all'analisi comparativa di diversi corpi cellulari in diverse sottostrutture cellulari. La funzionalità di questo flusso di lavoro è illustrata attraverso lo studio dei corpi Cajal (coiled) in condizioni di sollecitazione ossidativa (OS). I dati della microscopia a fluorescenza mostrano che la loro integrità nelle cellule umane è influenzata poche ore dopo l'induzione del sistema operativo. Questo effetto è caratterizzato da una diminuzione della nucleazione della bobina nei corpi cajal caratteristici, associata a una ridistribuzione nucleoplasmica della bobina in un numero maggiore di focolai più piccoli. Il ruolo centrale della bobina nello scambio tra i componenti CB e il nucleoplasmo circostante suggerisce che la ridistribuzione della bobina indotta dall'OS potrebbe influenzare la composizione e la funzionalità dei corpi cajal.
Introduzione
La microscopia leggera e, più in particolare, la microscopia a fluorescenza sono tecniche robuste e versatili comunemente utilizzate nelle scienze biologiche. Danno accesso alla localizzazione precisa di varie biomolecole come proteine o RNA attraverso la loro specifica etichettatura fluorescente. L'ultimo decennio è stato caratterizzato da rapidi progressi nelle tecnologie di microscopia e imaging, come dimostra il Premio Nobel 2014 per la chimica che ha assegnato Eric Betzig, Stefan W. Hell e William E. Moerner per lo sviluppo della microscopia a fluorescenza super risolta (SRFM)1. SFRM bypassa il limite di diffrazione della microscopia ottic....
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Protocollo
NOTA: tutorial user-friendly sono disponibili sul sito web di Icy http://icy.bioimageanalysis.org.
1. Scaricare Icy e il protocollo Substructure Analyzer
- Scaricare Icy dal sito Web Icy (http://icy.bioimageanalysis.org/download) e scaricare il protocollo Substructure Analyzer: http://icy.bioimageanalysis.org/protocols?sort=latest.
NOTA: se si utilizza un sistema operativo a 64 bit, assicurarsi di utilizzare la versione a 64 bit di Java. Questa versione consente di aumentare la memoria allocata a Icy....
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Risultati
Tutte le analisi descritte sono state eseguite su un computer portatile standard (processore quad-core a 64 bit a 2,80 GHz con 16 GB di memoria ad accesso casuale (RAM)) che funziona con la versione a 64 bit di Java. La memoria ad accesso casuale è un parametro importante da considerare, a seconda della quantità e della risoluzione delle immagini da analizzare. L'utilizzo della versione a 32 bit di Java limita la memoria a circa 1300 MB, il che potrebbe non essere adatto per l'analisi dei Big Data, mentre la versione a 6.......
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Discussione
Un numero crescente di strumenti software liberi è disponibile per l'analisi delle immagini delle cellule a fluorescenza. Gli utenti devono scegliere correttamente il software adeguato in base alla complessità del loro problema, alle loro conoscenze nell'elaborazione delle immagini e al tempo che vogliono trascorrere nella loro analisi. Icy, CellProfiler o ImageJ/Fiji sono potenti strumenti che combinano sia l'usabilità che la funzionalità3. Icy è uno strumento autonomo che presenta una chiara int.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
G.H. è stato sostenuto da una borsa di studio della Ministère Délégué à la Recherche et aux Technologies. L.H. è stata sostenuta da una borsa di studio universitaria dell'Institut de Cancérologie de Lorraine (ICL), mentre Q.T. è stata sostenuta da una sovvenzione pubblica supervisionata dall'Agenzia nazionale francese di ricerca (ANR) come parte del secondo programma "Investissements d'Avenir" FIGHT-HF (riferimento: ANR-15-RHU4570004). Questo lavoro è stato finanziato dal CNRS e dall'Università di Lorraine (UMR 7365).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Soluzione di formaldeide al 16% (p/v) senza metanolo | Thermo Fisher Scientific | 28908 | per fissare le cellule |
| Alexa Fluor 488 di capra anti-coniglio | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | anticorpo secondario fluorescente |
| Alexa Fluor 555 di capra anti-topo | Thermo Fisher Scientific | A-21425 | anticorpo secondario fluorescente |
| Alexa Fluor 555 Falloidina | Thermo Fisher Scientific | A34055 | anticorpo secondario fluorescente |
| Albumina sierica bovina standard (BSA) | euromedex | 04-100-812-E | |
| DMEM | Terreno di coltura cellulare | Sigma-Aldrich | D5796-500ml |
| Terreno di montaggio in situ Duolink con terreno | di montaggio | Sigma-Aldrich | DUO82040-5ML |
| Umano: cellule HeLa S3 | IGBMC, Strasburgo, Francia | linea cellulare utilizzata per eseguire gli esperimenti | |
| Soluzione di perossido di idrogeno 30% (H2O2) | Sigma-Aldrich | H1009-100ml | utilizzato come agente stressante |
| Reagente Lipofectamine 2000 Reagente | trasfezione | Thermo Fisher Scientific | 11668-019 |
| Anticorpo monoclonale anti-coilin | abcam abcam | ab11822 | Anticorpo specifico per coilin |
| Microscopio a fluorescenza Nikon Optiphot-2 | Microscopio per epifluoresecenza | Nikon | |
| Opti-MEM I Terreno a siero ridotto | Thermo Fisher Scientific | Terreno di trasfezione | |
| 31985062 PBS pH 7.4 (10x) | gibco | 70011-036 | per lavare le cellule |
| Coniglio policlonale anti-53BP1 | Thermo Fisher Scientific | PA1-16565 | 53BP1-specifico anticorpo |
| Anticorpo policlonale di coniglio anti-EDC4 | Sigma-Aldrich | SAB4200114 | EDC4-specifico |
| Triton X-100 | Roth | 6683 | per permeabilizzare le cellule |
Riferimenti
- Möckl, L., Lamb, D. C., Bräuchle, C. Super-resolved fluorescence microscopy: Nobel Prize in Chemistry 2014 for Eric Betzig, Stefan Hell, and William E. Moerner. Angewandte Chemie. 53 (51), 13972-13977 (2014).
- Meijering, E., Carpenter, A. E., Peng, H., Hamprecht, F. A., Olivo-Marin, J. -C.
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Ristampe e permessi
