Ottimizzazione della cultura organoide e organipica renale per la vascolarizzazione, lo sviluppo esteso e l'imaging di microscopia migliorato

Susanna Kaisto; Ulla Saarela; Laura Dönges; Irina Raykhel; Ilya Skovorodkin; Seppo  J. Vainio

doi:10.3791/60995

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Articolo metodologico

Ottimizzazione della cultura organoide e organipica renale per la vascolarizzazione, lo sviluppo esteso e l'imaging di microscopia migliorato

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DOI:

10.3791/60995

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28 marzo 2020

Susanna Kaisto¹ , Ulla Saarela¹ , Laura Dönges¹ , Irina Raykhel¹ , Ilya Skovorodkin^*¹ , Seppo J. Vainio^*¹^,²^,³

¹Biocenter Oulu and Faculty of Biochemistry and Molecular Medicine, University of Oulu, ²InfoTech Oulu, University of Oulu, ³Biobank Borealis of Northern Finland, Oulu University Hospital

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo lavoro descrive due metodi per studiare lo sviluppo degli organi, una migliore impostazione dello xenotrapianto sulla membrana corioallantoica (CAM) dagli embrioni aviari che consente la vascolarizzazione di organi embrionali e organoidi coltivati e una nuova direzione z fissa metodo di coltura dell'organo con condizioni sperimentali modificate che consente l'imaging confocale time-lapse ad alta risoluzione.

Abstract

Le colture organotiche renali embrionali, e in particolare gli organoidi renali derivati da cellule staminali pluripotenti, sono strumenti eccellenti per seguire i processi di sviluppo e modellare la malattia renale. Tuttavia, i modelli sono limitati dalla mancanza di vascolarizzazione e funzionalità. Per risolvere questo problema, è stato sviluppato un protocollo migliorato per il metodo di xenotrapianto di cellule e tessuti alla membrana corioallantoica (CAM) di un embrione aviario per ottenere la vascolarizzazione e il ripristino del flusso sanguigno. Gli innesti sono sovrapposti a minicarri su misura che fissano i campioni al CAM e forniscono loro un mezzo di coltura che protegge gli innesti dall'essiccazione. Il metodo di coltura migliorato consente agli xenograforti di crescere fino a 9 giorni. Il manoscritto descrive anche come fornire condizioni ottimali per l'imaging confocale a lungo termine di organoidi renali e colture organotipiche utilizzando il metodo di direzione fissa (Fi-D) pubblicato in precedenza. Questo metodo comprime delicatamente un organo embrionale o organoide tra un coperchio di vetro e la membrana in una grande quantità di mezzo e fornisce ottime condizioni per l'imaging per un massimo di 12 giorni. Insieme, questi metodi consentono la vascolarizzazione e il flusso sanguigno agli organoidi renali e alle colture renali organotipiche con una migliore imaging confocale. I metodi qui descritti sono molto utili per studiare le funzioni fondamentali e applicate dei reni ex vivo. Entrambi i metodi sono applicabili a vari tipi di tessuti e organoidi.

Introduzione

La coltura organotipica dei reni embrionali è diventata un modello importante per studiare la nefrogenesi decenni fa¹^,²^,³. Gli organoidi renali rappresentano un sistema modello avanzato per studiare lo sviluppo di reni sani e malati⁴. Lo svantaggio principale per entrambi i metodi, tuttavia, è che nessuno dei due metodi riassume la funzione principale del rene: la filtrazione del sangue. Nefrosci e vascolatura renale si sviluppano in organoidi renali e culture organotipiche in modo simile alla fase iniziale nello sviluppo vivo; tuttavia, i glomeruli fo....