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Articolo metodologico

Misurazioni delle risposte allo stress fisiologico in C. Elegans

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DOI:

10.3791/61001

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21 maggio 2020

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1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Berkeley

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Qui, caratterizziamo le risposte di stress proteotossico cellulare nel nematode C. elegans misurando l'attivazione di reporter trascrizionali fluorescenti e analizzando la sensibilità allo stress fisiologico.

Abstract

Gli organismi sono spesso esposti ad ambienti fluttuanti e cambiamenti nell'omeostasi intracellulare, che possono avere effetti negativi sul loro proteoma e sulla fisiologia. Così, gli organismi hanno evoluto risposte mirate e specifiche allo stress dedicate a riparare i danni e mantenere l'omeostasi. Questi meccanismi includono la risposta proteica dispiegata del reticolo endolamico (UPRER),la risposta proteica dispiegata dei mitocondri (UPRMT), la risposta allo shock termico (HSR) e la risposta allo stress ossidativo (OxSR). I protocolli qui presentati descrivono i metodi per rilevare e caratterizzare l'attivazione di questi percorsi e le loro conseguenze fisiologiche nel nematode, C. elegans. In primo luogo, l'uso di reporter trascrizionali fluorescenti specifici del percorso è descritto per la caratterizzazione cellulare rapida, lo screening farmacologico o lo screening genetico su larga scala (ad esempio, RNAi o librerie mutanti). Inoltre, vengono descritti saggi fisiologici complementari e robusti, che possono essere utilizzati per valutare direttamente la sensibilità degli animali a fattori di stress specifici, servendo come convalida funzionale dei reporter trascrizionali. Insieme, questi metodi consentono una rapida caratterizzazione degli effetti cellulari e fisiologici delle perturbazioni proteotossiche interne ed esterne.

Introduzione

La capacità di un organismo di rispondere ai cambiamenti nell'ambiente intra ed extracellulare è cruciale per la sua sopravvivenza e adattamento. Questo si ottiene a livello cellulare attraverso numerose vie protettive che garantiscono l'integrità della cellula. Mentre numerosi componenti cellulari sono soggetti a danni associati allo stress, uno dei principali coinvolgimenti delle risposte allo stress cellulare è quello di riparare e proteggere l'omeostasi del proteoma cellulare. Tuttavia, la compartimentazione delle proteine in strutture speciali, chiamate organelli, rappresenta una sfida per la cellula, in quanto non può basarsi su una forma centralizzata di controllo della qualità delle proteine per garantire che tutte le proteine all'interno della cellula siano correttamente piegate e funzionali. Pertanto, per affrontare le perturbazioni alle loro proteine, gli organelli hanno sviluppato meccanismi di controllo della qualità dedicati, che possono percepire le proteine piegate male e attivare una risposta allo stress nel tentativo di alleviare lo stress all'interno di quel compartimento. Ad esempio, il citosol si basa sulla risposta all'urto termico (HSR), mentre il reticolo endoplasmico (ER) e i mitocondri si basano sulle loro risposte proteiche spiegate specifiche per il compartimento (UPR). L'OxSR serve ad alleviare gli effetti tossici delle specie reattive dell'ossigeno (ROS). Ogni risposta allo stress viene attivata in presenza di sfide cellulari e insulti ambientali e induce una risposta trascrizionale su misura. I segni distintivi di queste risposte includono molecole sintetizzanti che ripiegano le proteine piegate male (come gli chaperoni) mirate all'organida corretta, o in alternativa, rimuovono le proteine danneggiate dalla degradazione delle proteine. La mancata attivazione di queste risposte allo stress comporta l'accumulo di proteine danneggiate, la disfunzione cellulare propagata al fallimento sistemico dei tessuti e infine la morte dell'organismo. La funzione e la regolazione delle diverse risposte allo stress sono esaminate altrove1.

Molte intuizioni riguardanti la regolazione e l'attività delle risposte allo stress cellulare sono state attribuite al nematode, Caenorhabditis elegans, un organismo modello multicellulare nella ricerca genetica. I nematodi non solo consentono di studiare l'attivazione delle risposte allo stress a livello cellulare, ma anche a livello di organismo; nematodi sono stati utilizzati per studiare gli effetti delle perturbazioni genetiche o l'esposizione a farmaci e inquinanti sulla loro crescita e sopravvivenza. Il loro tempo di generazione rapido, l'isogenesi, la trasparenza, la trattatività genetica e la facilità d'uso durante la sperimentazione li rendono ideali per tali studi. Inoltre, la risposta fisiologica relativamente veloce allo stress (tra ore e pochi giorni) e la conservazione evolutiva dei percorsi cellulari rendono i nematodi uno strumento prominente nello studio della resistenza allo stress.

Ci sono due ceppi di E. coli comunemente usati utilizzati come fonte di cibo per far crescere C. elegans: OP50 standard, un ceppo B in cui la maggior parte della sperimentazione è stata storicamente eseguita2 e HT115, un ceppo K-12 che viene utilizzato per quasi tutti gli esperimenti RNAi3,4. È importante notare che ci sono differenze significative tra le diete batteriche OP50 e HT115. La crescita su queste diverse fonti batteriche ha dimostrato di causare grandi differenze nel profilo metabolico, numero di copia del DNA mitocondriale, e diversi fenotipi principali, tra cui la durata della vita5. Alcune di queste differenze sono attribuite alla carenza di vitamina B12 associata alla crescita sui batteri OP50, che può provocare difetti nell'omeostasi mitocondriale e una maggiore sensibilità agli agenti patogeni e agli stress. Tutti questi fenotipi hanno dimostrato di essere alleviato dalla crescita sui batteri HT115, che hanno livelli più elevati di vitamina B126. Pertanto, si raccomanda di eseguire tutti gli esperimenti sulle risposte allo stress fisiologico sui batteri HT115, indipendentemente dalla necessità di condizioni di RNAi. Tuttavia, a causa della facilità di mantenimento degli animali su OP50, tutta la crescita standard (cioè la manutenzione e l'amplificazione degli animali) può essere eseguita su OP50, poiché differenze significative nei paradigmi sperimentali qui descritti non sono state rilevate nei worm mantenuti su OP50, purché siano stati spostati nell'HT115 dopo la sincronizzazione (cioè, dal post-bleaching del portello con o senza l'arresto L1) fino alla sperimentazione dell'arresto L1.

Qui, viene descritta la caratterizzazione dell'attività delle risposte allo stress cellulare utilizzando due metodi funzionali. Va notato che i protocolli presentati si concentrano principalmente sulle risposte allo stress cellulare e sul loro impatto sull'omeostasi delle proteine. In primo luogo, vengono utilizzati i reporter trascrizionali fluorescenti, che sono regolati da promotori genici endogeni che sono specificamente attivati in risposta a diversi stress cellulari. Questi reporter trascrizionali fluorescenti si basano sull'induzione trascrizionale di geni specifici che fanno nativamente parte della risposta allo stress. Ad esempio, l'HSP-4, una proteina da shock termico ortologo al accompagnatore umano HSPA5/BiP, viene attivata su stress ER e localizza al ER per alleviare lo stress. In condizioni di stress DA E. (ad esempio, l'esposizione alla tunicacina), una proteina fluorescente verde (GFP), posta sotto la regolazione del promotore hsp-4, è sintetizzata in alti livelli come può essere valutato mediante microscopia fluorescente o misurata quantitativamente utilizzando citometria di flusso di grandi particelle di nematodi7. Allo stesso modo, il promotore di un chaperone mitocondriale, hsp-6 (ortologo del mammifero HSPA9), viene utilizzato per monitorare l'attivazione dell'UPRMT8e il promotore del chaperone citosolico hsp-16.2 (ortologo al gene alfa cristallino umano) viene utilizzato per valutare l'attività dell'HSR9. Questi giornalisti permettono una rapida caratterizzazione dei percorsi attivati in risposta a varie perturbazioni.

Spesso, i giornalisti qui presentati sono immagini con microscopia, che fornisce un output qualitativo dell'attivazione delle risposte allo stress. Tuttavia, mentre le tecniche di imaging forniscono sia informazioni sull'intensità che sulla posizione dei tessuti dei reporter sopra descritti, la sua quantificazione non è sempre accurata o robusta. Sebbene sia possibile quantificare l'attivazione fluorescente utilizzando strumenti di analisi dell'imaging, questi metodi hanno una produttività relativamente bassa e le dimensioni del campione sono ridotte, a causa del numero relativamente basso di animali immaginati. La facilità e la capacità di ottenere grandi quantità di animali rendono rapidamente C. elegans un sistema modello ideale per testare l'attivazione dei reporter di stress fluorescente attraverso l'uso di un grande citometro a flusso di particelle. Un citometro a flusso di grandi particelle è in grado di registrare, analizzare e ordinare in base alle dimensioni e alla fluorescenza di molti animali vivi. Utilizzando questo metodo, è possibile ottenere l'intensità fluorescente, le dimensioni, e anche le informazioni spaziali (2D) per migliaia di vermi. Il sistema è controllato utilizzando FlowPilot, che consente l'acquisizione e l'analisi in tempo reale dei dati misurati. Qui, i metodi per l'imaging microscopico e l'analisi quantitativa utilizzando un citometro di flusso di particelle di grandi dimensioni sono offerti come metodi per misurare l'attivazione delle risposte allo stress.

Oltre all'analisi dei reporter, la sensibilità o la resistenza degli animali allo stress possono essere misurate utilizzando analisi dello stress fisiologico. Ciò si ottiene esponendo gli animali ad ambienti stressanti che attivano percorsi specifici di stress cellulare. Qui, vengono forniti diversi metodi per misurare la sensibilità di animali interi a specifici tipi di fattori di stress.

La sollecitazione ER viene applicata a C. elegans utilizzando l'agente chimico, la tunicamycina, che blocca la glicosilazione legata a N, causando l'accumulo di proteine piegate in modo misto nel ER10. In C. elegans, la crescita dopo l'esposizione alla tunicacina provoca grandi perturbazioni nella funzione ER, e una durata significativamente ridotta11. Misurando la sopravvivenza degli animali su placche contenenti tunicacina, è possibile quantificare la sensibilità allo stress ER degli animali. Ad esempio, gli animali con induzione ectopica di UPRER e quindi una maggiore resistenza allo stress da misfolding delle proteine nel ER hanno una maggiore sopravvivenza in base all'esposizione alla tunicamicina rispetto agli animali di tipo selvatico12.

Lo stress ossidativo e mitocondriale viene applicato a C. elegans esponendo gli animali all'agente chimico, il paraquat. Paraquat è un erbicida comunemente usato, che provoca la formazione di superossido specificamente nei mitocondri13. A causa della localizzazione specifica delle specie reattive dell'ossigeno derivate dai mitocondri (ROS), i saggi paraquati sono spesso usati come un saggio di stress "mitocondriale". Tuttavia, il superossido viene rapidamente convertito in perossido di idrogeno dalle dismutasi mitocondriali del superossido (SOD)14. Il perossido di idrogeno può successivamente diffondersi dai mitocondri e causare stress ossidativo in altri compartimenti della cellula. Pertanto, descriviamo i saggi di sopravvivenza dei paraquati come misurala della sensibilità allo stress mitocondriale e ossidativo (altri test di stress ossidativo possono essere trovati15).

I saggi di termotolleranza vengono eseguiti in C. elegans mettendo gli animali a temperature elevate. Le temperature ambientali per i nematodi sono di 15-20 gradi centigradi e lo stress termico è indotto a temperature superiori a2:C16,17. I saggi di termotolleranza sono generalmente eseguiti a temperature che vanno da 30-37 gradi centigradi, poiché gli animali presentano gravi difetti cellulari a questa temperatura, e i test di sopravvivenza vengono completati entro 24 ore16,18. In questo caso, sono previsti due metodi alternativi per l'esecuzione di saggi di termotolleranza: crescita a 34 gradi centigradi e crescita a 37 gradi centigradi. Insieme, i protocolli qui presentati possono essere utilizzati per eseguire schermi su larga scala quando combinati con il gene knock-down standard utilizzando l'interferenza dell'RNA o le librerie di farmaci chimici.

Il protocollo può essere suddiviso in 4 procedure generali: crescita di C. elegans e preparazione per l'imaging (sezioni 1 e 2), imaging di reporter trascrizionali utilizzando microscopia fluorescente (sezioni 3-5), misurazioni quantitative dei reporter che utilizzano un citometro di flusso di grandi particelle (sezione 6) e analisi fisiologiche per misurare la sensibilità allo stress in C. elegans (sezione 7).

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Protocollo

1. Condizioni di crescita standard delle temperature e OP50 rispetto all'HT115

  1. Crescita ed espansione standard
    1. Coltivare una cultura di OP50 in LB (Tabella 1) o supporti equivalenti di scelta per 24-48 h a temperatura ambiente (22-25 gradi centigradi). Crescere batteri a temperatura ambiente come OP50 è un uracicolo auxotroph e c'è una maggiore incidenza di rerevertant (ad esempio, mutanti soppressori) quando coltivato a 37 gradi centigradi. L'archiviazione a lungo termine delle colture OP50 non è consigliata (massimo 1 settimana a 4 gradi centigradi).
    2. Semina un volume di 100-200 dollari di coltura OP50 satura su una piastra NGM da 60 mm (Tabella 1) per la manutenzione dei vermi e 1 mL di coltura OP50 satura su una piastra da 100 mm per l'espansione degli animali per la sperimentazione.
    3. Lasciare asciugare i piatti durante la notte su un piano di panca.
      NOTA: le piastre da 100 mm potrebbero aver bisogno di più tempo per asciugarsi, soprattutto se si utilizzano piastre non ventilate. Conservare tutte le piastre C. elegans in contenitori a tenuta d'aria conservati a 4 gradi centigradi. Non utilizzare piastre oltre 6 mesi di età come disidratazione di piastre si verificherà, che cambierà la fisiologia animale su piastre a causa di diversa pressione osmotica e rigidità delle piastre.
    4. Per la manutenzione standard, spostare 10-15 giovani animali (uova, L1 o stadi L2) su una piastra di 60 mm, anche se più possono essere spostati se si tratta di mutanti o animali transgenici con fecondità inferiore. Per gli animali con difetti di sviluppo o fecundità, suddividere una piscina più variabile di animali per prevenire la perdita dello stock. Se tenuti a 15 gradi centigradi, spostare gli animali ogni settimana; per 20 gradi centigradi, spostare gli animali ogni 3-4 giorni.
    5. Eseguire un fresco disgelo di animali ogni 25-30 passaggi (6 mesi se gli animali vengono spostati una volta alla settimana e tenuti a 15 gradi centigradi).
    6. Per l'espansione, suddividere una piastra completa da 60 mm su piastre da 100 mm per l'espansione. Come telaio di riferimento, gli animali con fecondità di tipo selvatico possono avere una piastra completa di 60 mm tagliata in 4ths-6ths ed essere tagliati su una grande piastra a 20 gradi centigradi per 2 giorni o 15 gradi centigradi per 3 giorni per creare una piastra completa di 100 mm senza raggiungere la fame.

2. Gestione/sincronizzazione dei worm mediante sbiancamento

  1. Protocollo di sbiancamento per sincronizzare i worm
    1. Lavare i vermi gravidi (adulti pieni di uova) dai piatti di agar utilizzando M9 (Tabella 1). Iniziare da una popolazione non sincronizzata di vermi (cioè, vermi in blocchi dal passaggio 1.1.6) alla candeggina per gli esperimenti, in quanto una significativa deriva genetica può verificarsi su cicli successivi di sincronizzazione tramite sbiancamento.
    2. Spostare la miscela verme/M9 in un tubo conico da 15 mL utilizzando una pipetta di vetro; diverse piastre di vermi possono essere raccolte in un unico tubo conico da 15 mL.
    3. Spin animali verso il basso per 30 s a 1.000 x g. Aspirate M9 supernatante. Non è necessario lavare i batteri residui a meno che non vi sia una quantità eclatante di contaminazione o grandi ciuffi di batteri. In questo caso, eseguire diversi washes con M9.
    4. Preparare una nuova scorta di soluzione di sbiancamento (Tabella 1). La soluzione di sbiancamento può essere conservata per diversi giorni a 4 gradi centigradi, ma utilizzare una soluzione di sbiancamento appena fatta in quanto lo sbiancamento inefficiente può causare uno sbiancamento irregolare, che causerà danni alle uova prima di eliminare tutte le carcasse del verme.
    5. Aggiungere agli animali una soluzione di sbiancamento da 2 a 10 mL (1 mL di soluzione di candeggina per ogni 0,1 mL di pellet animale). Invertire la miscela di candeggina e verme per 5 min (non superare i 10 min; si noti che i tempi di sbiancamento possono variare e devono essere titolerati specificamente per ogni laboratorio). Agitare vigorosamente per aiutare a sciogliere le carcasse del verme più velocemente e per una conservazione ottimale delle uova. Osservare periodicamente al microscopio di scarico o mettere il tubo conico ad una luce per osservare quando le carcasse del verme adulto si sono completamente disciolte e rimangono solo le uova nel tubo.
    6. Pellet le uova filando a 1.000 x g per 30 s e poi aspirare il supernatante. Le uova possono essere centrifughe più velocemente dei vermi senza interrompere la loro integrità, quindi se non sono sicuro della velocità di centrifuga, le uova possono essere filate fino a 2.500 x g senza alterare la loro fisiologia.
    7. Aggiungere M9 fino a 15 mL e invertire il tubo per cancellare la candeggina dalle uova.
    8. Ripetere i passaggi 2.1.6-2.1.7 (processo di lavaggio/pellet) 2-3 più volte per rimuovere la candeggina.
    9. Uovo di pipet/M9 si mescolano su piatti e crescono a 15-20 gradi centigradi per la sperimentazione. Per ottenere una misura del numero di vermi da utilizzare, eseguire conteggi approssimativi delle uova conlatando 5 - L. di miscela di uova su un piatto di agar o scivolo e dividendo il numero di uova per 5 per determinare il numero di uova per 1 : L di volume. Una media di 3 conteggi indipendenti può migliorare la precisione. Per evitare la fame, una tabella di conteggi di uova raccomandati per piastra è disponibile nella tabella 2.
    10. Se necessario, L1 arresta gli animali per una più stretta sincronizzazione temporale mettendo la miscela uovo/M9 in un rotatore a 20 gradi centigradi per un massimo di 24 h. Per gli animali di tipo selvatico, non sono stati rilevati difetti nella fisiologia animale quando L1 si arresta fino a 48 h. Tuttavia, i mutanti sensibili alla fame (ad esempio, mutanti lisosomi o autofagia) fanno molto male con l'arresto di L1, e quindi non è consigliabile eseguire questo metodo di sincronizzazione per i mutanti che sono noti per essere sensibili alla fame. Se è necessaria una sincronizzazione più rigorosa per gli animali che non possono essere arrestati L1, utilizzare il metodo di laici d'uovo descritto nella sezione 2.2.
  2. Protocollo di laici d'uovo per la sincronizzazione dei vermi
    NOTA: Come metodo alternativo per lo sbiancamento, può essere eseguito un saggio di lapide d'uovo. La deposizione delle uova viene utilizzata quando lo sbiancamento degli animali non fornisce una sincronizzazione abbastanza vicina, in quanto le uova all'interno del sacco di uova degli animali adulti possono essere diverse come 8-12 h di distanza. Per i paradigmi sperimentali in cui è fondamentale che gli animali siano il più possibile in scena, ma dove l'arresto di L1 non è possibile (ad esempio, nei mutanti affamati), si raccomandano i saggi laici di uova. Tuttavia, va notato che a causa del lavoro coinvolto nel protocollo di laici di uova, è meno fattibile eseguire esperimenti su larga scala.
    1. Posizionare 4-12 adulti gravidi (vedere Nota dopo il passaggio 2.2.2) su una piastra NGM standard OP50 o HT115 (vedere la sezione 1 sopra per le raccomandazioni sui ceppi batterici). A seconda della scala degli esperimenti, è possibile utilizzare più piastre. Assicurarsi di documentare attentamente quanti animali sono su ogni piatto per il passaggio 2.2.
    2. Collocare gli animali alla temperatura desiderata per gli esperimenti (15-20 gradi centigradi) per 4-8 h.
      NOTA: Il numero di ore che gli animali vengono lasciati sul piatto determinerà quanto strettamente sincronizzato il primo uovo deposto e l'ultimo uovo deposto sarà, in modo che la tempistica può essere regolata in base alle esigenze. Poiché tempi di incubazione più brevi significano che ogni animale ha meno tempo per deporre le uova, più animali dovrebbero essere messi su piatti per garantire che vengano deposte abbastanza uova. Mentre l'effettivo tasso di deposizione delle uova non è completamente normalizzato a causa della tendenza degli animali a passare attraverso brevi raffiche di deposizione delle uova piuttosto che un tasso normalizzato di uova deposte, il tasso medio di uova deposte per animale può essere stimato a 5 ovuli all'ora per gli animali che espongono fecondità di tipo selvatico19. Quando si cerca di coltivare animali fino alla fase adulta del primo giorno, è il tempo di avere <100 uova per piatto per evitare la fame (fare riferimento alla Tabella 2 per ulteriori dettagli sugli animali raccomandati per piatto).
    3. Rimuovere gli animali adulti dai piatti. Assicurarsi che tutti gli animali adulti vengano rimossi dalle piastre, poiché gli animali continueranno a deporre le uova e a provocare una popolazione non sincronizzata e/o la fame della piastra.

3. Condizioni di crescita dei vermi per l'imaging di giornalisti trascrizionali

  1. Crescita dei vermi
    1. Cultura batterica inoculata di HT115 che ospita pLasmide di RNAi (EV) e/o portando una cassetta RNAi contro i geni bersaglio desiderati in supporti LB integrati con 100 g/mL di carcillina e tetraciclina da 20 g/mL.
    2. Coltivare la coltura durante la notte (16 ore) fino alla saturazione in un incubatore tremante di 37 gradi centigradi.
    3. Avvistale di 60 mm NGM RNAi con 200 litri di coltura batterica satura e piastre NGM RNAi da 100 mm con 1.000 l di coltura batterica satura. Lasciare asciugare a temperatura ambiente (22 gradi centigradi) durante la notte al buio (coperto liberamente con un foglio di alluminio).
    4. Collocare la popolazione sincronizzata di vermi transgenici che trasportano reporter fluorescenti (vedi tabella 3 per l'elenco completo) su piastre NGM RNAi seminata con batteri di scelta.
    5. Crescere a 15-20 gradi centigradi alle fasi richieste per giornalisti specifici, come descritto di seguito.
  2. Considerazioni per la messa in scena di worm per le sperimentazioni
    1. Eseguire esperimenti per i giornalisti trascrizionali al primo giorno di età adulta, ad eccezione dei saggi che richiedono animali L4. Secondo WormAtlas, gli animali L4 sono ottenuti circa 2,5 giorni (56 h) di crescita a 20 gradi centigradi dalla fase delle uova (www.wormatlas.org).
    2. Per gli adulti del primo giorno, utilizzare gli animali a circa 3-4 giorni (65-96 h) di crescita a 20 gradi centigradi dopo aver placcato le uova.
      NOTA: Questa vasta gamma è spiegata come segue: 65 h a 20 gradi centigradi è quando gli animali raggiungono la "deposizione delle uova", che è il vero stato di "età adulta". 96 h è quando gli animali entrano ciò che WormAtlas descrive come "uovo-deposizione massima", che è quando l'adulto è un adulto gravido e ha un sacco di uova pieno. Questo è quando gli animali sarebbero descritti come più vecchi del giorno 1 e possono iniziare a visualizzare le differenze, e quindi i protocolli descritti qui sono tutti raccomandati per iniziare in questa fase "giorno 1" a partire da 65 h e fino a 96 h. Per i saggi qui descritti, non sono state osservate grandi differenze quando si utilizzano animali in questa finestra di 65-96 h.
    3. Per le repliche di un singolo esperimento, utilizzare un punto di tempo simile per una riproducibilità più robusta (ad esempio, eseguire tutti gli esperimenti a 65 h o 96 h dopo la placcatura delle uova).
      NOTA: Alcuni animali transgenici e mutanti mostrano tassi di crescita rallentati. Per questo esistono due raccomandazioni. 1) Utilizzare una sincronizzazione sfalsata, in cui gli animali possono essere sbiancati in momenti diversi per poter eseguire la sperimentazione allo stesso tempo. Ciò è consigliato quando la variabilità tecnica nella saggia può essere maggiore delle variabili tecniche che possono derivare dal saggio di sincronizzazione (ad esempio, i test di sopravvivenza, che durano per lunghi durati possono soffrire se non vengono eseguiti contemporaneamente). 2) Utilizzare un'analisi sfalsata, in cui gli animali possono essere sbiancati contemporaneamente, ma il saggio stesso viene eseguito in momenti diversi. Questo è raccomandato per i saggi molto semplici che non hanno variabilità intrinseca (ad esempio, l'induzione di RNAi delle risposte allo stress).

4. Induzione delle risposte allo stress

  1. Utilizzo di hsp-4p::GFP come lettura per l'attivazione dell'UPRER
    1. Indurre lo stress ER usando RNAi
      1. Preparare piastre macchiate con batteri RNAi che prendono di mira il gene di interesse sulle piastre NGM RNAi (Tabella 1) come nella sezione 3. Utilizzare EV come controllo per i livelli basali di UPRER e il knockdown RNAi del tag-335 (enzima per la glicosilazione legata a N delle proteine residenti nel ER; Il knockdown dell'RNAi ha effetti simili al trattamento della tunicamicina) come controllo positivo per l'attivazione dell'UPRER sotto stress ER.
      2. Sincronizzare gli animali reporter hsp-4p::GFP utilizzando i metodi descritti nella sezione 2.
      3. Piatto uova su piastre di RNAi utilizzando i criteri raccomandati nella tabella 2.
      4. Incubare le uova a 20gradi centigradi per circa 3-4 giorni (65-96 h) per eseguire esperimenti al primo giorno di età adulta. Per gli esperimenti UPRER, ci sono differenze nella fluorescenza basale del reporter hsp-4::GFP se coltivato a temperature diverse. Pertanto, eseguire tutti gli esperimenti a 20 .
    2. Indurre lo stress ER utilizzando un agente chimico
      1. Sincronizzare gli animali reporterh-4p::GFP utilizzando i metodi descritti nella sezione 2 e crescere a 20 gradi centigradi fino a quando gli animali raggiungono lo stadio L4. Trasferire gli animali in un tubo di M9. Consentire ai vermi di stabilirsi (2-3 min per gravità o un giro di 30 s a 1.000 x g),quindi rimuovere M9.
      2. Diluire tunicamycin a 25 ng/mL in M9 (una diluizione 1:40 da 1 0mmg/mL di stock). Come controllo, diluire anche un volume equivalente di DMSO in M9.
      3. Aggiungere 25 ng/mL tunicamycin/M9 o controllare la soluzione DMSO/M9 ai vermi (utilizzare 400-500 mL per un tubo da 1,5 mL o 2 mL per un tubo conico da 15 mL). Incubare a 20 gradi centigradi su una piattaforma rotante per 3-4 ore.
        NOTA: La tunicamicina può anche essere diluita direttamente nella miscela worm/M9.
      4. Lasciare che i vermi si depositino, rimuovano la soluzione M9/TM e lavicono con 1 mL di M9.
      5. Trasferire gli animali su piastre NGM o piastre NGM RNAi e consentire di recuperare durante la notte (o 15-20 h) e raggiungere il giorno 1 dell'età adulta a 20 gradi centigradi prima di eseguire la microscopia fluorescente (sezione 5). Viene eseguito un recupero notturno per consentire l'accumulo di un livello rilevabile di GFP.
      6. In alternativa, indurre hsp-4p::GFP spostando gli animali L4 in piastre di agar contenenti 25 ng/L tunicamycin per 16-24 h. Questo ha un'induzione molto più robusta di hsp-4p::GFP a causa della maggiore durata dello stress, e quindi l'intervallo dinamico è molto più basso rispetto all'analisi descritta sopra.
  2. Utilizzo di hsp-6p::GFP come lettura per l'attivazione dell'UPRMT
    1. Indurre lo stress mitocondriale utilizzando RNAi
      1. Attivare UPRMT seguendo lo stesso protocollo della sezione 4.1.1, tranne usando il knockdown RNAi dei geni mitocondriali, come il cox-5b/cco-1 (sottounità citocromatica c oxidase 5B; il knockdown inibisce l'attività della catena di trasporto degli elettroni). Per l'attivazione UPRMT attraverso perturbazioni nella funzione della catena di trasporto degli elettroni, il knockdown RNAi deve essere eseguito durante lo sviluppo iniziale20. Pertanto, eseguire RNAi da tratteggio per questi esperimenti.
    2. Indurre lo stress mitocondriale usando un agente chimico
      1. Preparare piastre avvistate con batteri RNAi che prendono di mira il gene di interesse come nella sezione 3. Utilizzare batteri HT115 anche in esperimenti che non coinvolgono RNAi knockdown (vedi Sezione 1). Assicurarsi che entrambe le piastre DI RNAi NGM (o NGM RNAi , DMSO0.2) e le piastre NGM RNAi - antimicina A (Tabella 1) siano entrambe preparate per il passaggio 4.2.2.5.
      2. Sincronizzare gli animali reporter del reporter hsp-6p::GFP o hsp-60p::GFP utilizzando i metodi descritti nella sezione 2.
      3. Piatto uova su piastre di semi di scelta utilizzando i criteri raccomandati nella tabella 2. Poiché l'antimicina A è disciolta nella DMSO, far crescere gli animali su placche NGM RNAi - DMSO0.2 dal portello.
      4. Incubare le uova a 20gradi per 2 giorni (56 h) fino allo stadio L4. In alternativa, coltiva gli animali a 15 gradi centigradi per 3 giorni.
      5. Spostare i vermi da NGM RNAi - piastre DMSO0.2 a NGM RNAi - antimicina A piastre o PIastre NGM RNAi - DMSO0.2 come controllo. I vermi possono essere spostati manualmente con un plettro per esperimenti su piccola scala, ma per esperimenti su larga scala, si consiglia di lavare gli animali con M9, stabilirsi con centrifugazione, aspirare M9, e poi placcare a piastre NGM RNAi - antimicina A.
      6. Incubare i vermi per un ulteriore 20 h e immagine al giorno 1 adulto (sezione 5).
  3. Uso di gst-4p::GFP come lettura per la risposta allo stress ossidativo.
    1. Indurre OxSR utilizzando RNAi
      1. In alternativa, indurre gst-4p::GFP utilizzando RNAi-knockdown di wdr-23 (codifica un regolatore negativo di skn-1; così, il suo knockdown induce OxSR) utilizzando il protocollo descritto nella sezione 4.1.1.
    2. Indurre l'OxSR utilizzando l'esposizione all'idroperossido chimico ossidante Tert-butyl (TBHP)
      1. Preparare piastre avvistate con batteri RNAi che prendono di mira il gene di interesse come nella sezione 3. Utilizzare batteri HT115 anche in esperimenti che non coinvolgono RNAi knockdown (vedi Sezione 1).
      2. Sincronizzare gli animali reporter gst-4p::GFP utilizzando i metodi descritti nella sezione 2.
      3. Piatto uova su piastre di semi di scelta utilizzando i criteri raccomandati nella tabella 2. Assicurarsi di preparare più piastre del necessario come il protocollo di trattamento della droga provoca la perdita di >10-20% degli animali. Per l'imaging, iniziare con >100 animali e per la selezione, iniziare con >1,000 animali.
      4. Incubare le uova in 20 gradi centigradi per 2 giorni (56 h) fino allo stadio L4. In alternativa, coltiva gli animali a 15 gradi centigradi per 3 giorni.
      5. Lavare gli animali L4 dalle piastre e dividere in due tubi conici da 15 mL per condizione. Volume aspirato fino ad almeno 1 mL e aggiungere un volume uguale di appena fatto 2 mM TBHP. Utilizzare un volume liquido totale ad almeno 2 mL, poiché volumi più bassi possono causare una significativa mortalità di vermi durante la rotazione. Non lavare prima del trattamento farmacologico, poiché i batteri residui dalle piastre aiuteranno a garantire che i vermi non prevedano durante l'incubazione.
      6. Incubare i vermi sul rotatore per 4 ore a 20 gradi centigradi.
      7. Lavare i vermi ruotando a 1.000 x g,aspirando mix M9 e sostituendo con 15 mL di M9. Ripetere per un secondo lavaggio.
      8. Piastra di vermi su RNAi EV per il recupero durante la notte (16-24 h) a 20 gradi centigradi. I vermi possono essere recuperati sull'RNAi corrispondente di scelta, ma non sono state osservate differenze significative quando vengono recuperati su EV RNAi, quindi questo può essere fatto per la facilità di configurazione sperimentale. Prendere le immagini del giorno 1 adulti dopo il recupero.
        NOTA: viene eseguito un recupero notturno per consentire l'accumulo di un livello rilevabile di GFP. Senza questo recupero, non vi è alcun segnale GFP rilevabile. Se si desidera un recupero a breve termine, è possibile utilizzare il saggio descritto nella sezione 4.3.3.
    3. Indurre l'OxSR utilizzando l'esposizione al paraquat chimico ossidante (PQ)
      1. Ripetere tutti i passaggi nella sezione 4.2.2 per ottenere 2 lotti di animali L4 gst-4p::GFP in tubi conici da 15 mL per condizione.
      2. Volume aspirato fino ad almeno 1 mL e aggiungere un volume uguale di PQ fresco 100 M. Simile a 4.3.2.5, si consiglia un volume minimo di 2 mL.
      3. Incubare i vermi sul rotatore per 2 h a 20 gradi centigradi.
      4. Lavare i vermi ruotando a 1.000 x g,aspirando M9 e sostituendo con 15 mL di M9. Ripetere per un secondo lavaggio.
      5. Piastrare vermi su EV RNAi per recuperare per 2 h a 20 gradi centigradi, e poi prendere le immagini subito dopo il recupero.
        NOTA: 2 h di recupero è stato il recupero minimo richiesto per visualizzare l'induzione GFP.
  4. Utilizzo di hsp-16.2p::GFP e hsp-70p::GFP come lettura per l'attivazione HSR.
    1. Indurre HSR utilizzando l'esposizione a temperature elevate
      1. Preparare piastre avvistate con batteri RNAi che prendono di mira il gene di interesse come nella sezione 3. Utilizzare i batteri HT115, anche in esperimenti che non coinvolgono RNAi knockdown (vedi Introduzione).
      2. Sincronizzare gli animali reporter hsp-16.2p::GFP o hsp-70p::GFP utilizzando i metodi descritti nella sezione 2.
      3. Piatto uova su piastre di semi di scelta utilizzando i criteri raccomandati nella tabella 2. Assicurarsi di preparare 2 volte il numero di piastre necessarie in quanto metà del campione sarà esposta a temperature elevate per l'induzione di shock termico, e l'altra metà servirà come un controllo non riscaldato.
      4. Incubare le uova a 20gradi centigradi per circa 3-4 giorni (65-96 h) per eseguire esperimenti al primo giorno di età adulta. Non far crescere vermi a 15 gradi centigradi per esperimenti di shock termico in quanto vi sono solo piccole differenze tra gli animali che sperimentano shock termico su 15 .
      5. Spostare i gruppi sperimentali di animali in un'incubatrice di 34 gradi centigradi per 2 h. Posizionare le piastre nell'incubatrice come un unico strato (cioè senza impilamento di piastre) per garantire la distribuzione più rapida ed equa del calore attraverso le piastre.
      6. Spostare gli animali con shock termico in un'incubatrice di 20 gradi centigradi per recuperare per 2 h e quindi immagine immediatamente (vedere sezione 5). Gli animali possono essere recuperati più a lungo se necessario per una maggiore induzione di GFP.
        NOTA: 2 h di recupero è stato il recupero minimo richiesto per visualizzare l'induzione GFP.

5. Imaging con un microscopio stereo o un microscopio a campo largo/composto a basso ingrandimento

  1. Preparazione di vermi per la microscopia fluorescente
    1. Pipette 5-10 - L di 100 mM di azide di sodio sopra una piastra NGM standard (cioè nessun batterio).
      NOTA: La concentrazione di azide di sodio può essere abbassata a partire da 10 mM, anche se l'immobilizzazione più robusta è stata osservata a 100 mM di azie di sodio senza alcun effetto rilevabile sul segnale fluorescente.
    2. Sotto un microscopio dissezioso, scegli 10-20 animali da piastre sperimentali e trasferiscili nel punto di azide di sodio. Gli animali dovrebbero cessare il movimento poco dopo l'atterraggio nell'azide di sodio, e l'azide di sodio stesso evapora in pochi secondi.
    3. Una volta che l'azide di sodio è evaporato, allineare gli animali alla configurazione di imaging desiderato. Spostare gli animali fianco a fianco con i lati anteriori e posteriori nello stesso orientamento per tutti gli animali. Immagine di animali immediatamente.
      NOTA: non sono stati osservati cambiamenti nel segnale dei giornalisti per nessuno dei reporter trascrizionali nella tabella 3 per un massimo di 15 min dopo paralizzarsi nell'azide di sodio.
  2. Acquisizione di immagini con uno stereomicroscopio
    NOTA: Per questo protocollo, è stato utilizzato un microscopio Leica M205FA dotato di una telecamera CCD monocromatica Leica DFC3000G, filtro Leica GFP standard (ex 395-455, EM 480 LP) e software LAS X. Le impostazioni consigliate per i tempi di esposizione sono disponibili nella tabella 4.
    1. Avviare il programma LAS X.
    2. Avviare un nuovo progetto: aprire la scheda di acquisizione, fare clic su Apri progetti e fare clic su Cartella per aprire un nuovo progetto. Questo progetto può essere rinominato facendo clic con il pulsante destro del mouse sulla cartella e scorrendo verso il basso fino a Rinomina o facendo clic su F2. Nella scheda acquisizione, ci sono anche opzioni per regolare il tempo di esposizione e lo zoom alle impostazioni desiderate.
    3. Posizionare il campione di verme al microscopio e individuare il punto focale corretto dei vermi utilizzando l'impostazione del campo luminoso per ridurre al minimo lo sbiancamento fluorescente. Il centro del campione è dove la linea di uova è chiaramente visibile e non sfocata. Impostare il tempo di esposizione, lo zoom, la messa a fuoco e i condensatori dei campi luminosi sulle impostazioni desiderate.
    4. Acquisire un'immagine utilizzando il pulsante Acquisisci immagine.
    5. Salvare l'immagine in formato .lif (Leica Image File) in quanto salva tutte le immagini e i metadati non elaborati. Un TIFF può anche essere esportato facendo clic con il pulsante destro del mouse sull'immagine (o sul progetto) e sotto l'opzione Salva con nome fare clic su TIFF. Questo memorizzerà tutti i canali (ad esempio, bright-field e GFP) con eventuali modifiche (ad esempio, se il contrasto è stato regolato, questo verrà salvato nel TIFF).
  3. Analisi quantitativa delle immagini fluorescenti
    1. Se verrà eseguita l'analisi quantitativa, prendere immagini 3D. Questa operazione viene eseguita facendo clic sull'opzione della sezione z con la "z" in alto a destra. Le sezioni z saranno attive se questa casella è rossa.
    2. Ottimizzare le sezioni z selezionando l'intervallo e lo spessore della sezione in basso a sinistra delle opzioni regolabili. Quando possibile, utilizzare il pulsante Ottimizzazione sistema per le impostazioni ottimali.
    3. Acquisire l'immagine e memorizzarla come descritto in precedenza nella sezione 5.2. Allineare i vermi con spazi tra di loro per misurazioni più facili.
    4. Importare immagini TIFF nel software di imaging preferito (ad esempio, ImageJ).
    5. Per ImageJ, scegliere Imposta misuredal menu Analizza . Controllare quanto segue: area, valore grigio medio, densità integrata, etichetta di visualizzazione.
    6. Utilizzando lo strumento ROI (regione di interesse), disegnare un ROI. Misurare ogni verme singolarmente. Dal menu Analizza, scegliere Misura o premere M. Disegnare un ROI sullo sfondo dove non ci sono vermi, e quindi misurare lo sfondo nello stesso modo. Copiare o salvare le misure visualizzate nella finestra Risultati.
    7. Sottrarre la densità integrata dello sfondo dalla densità integrata di ogni ROI misurato. L'intensità dello sfondo per un ROI è definita come il prodotto del valore grigio medio dello sfondo e l'area del ROI disegnata.
  4. Acquisizione di immagini con un microscopio composto/wide-field
    NOTA: per l'imaging di reporter trascrizionali utilizzando un microscopio composto/wide-field, questo protocollo utilizza un microscopio Revolve ECHO R4 dotato di un obiettivo Olympus 4x Plan Fluorite NA 0.13, un filtro standard Olympus FITC (ex 470/40; em 525/50; DM 560) e un iPad Pro per la fotocamera e per guidare il software ECHO. Le impostazioni consigliate per i tempi di esposizione sono disponibili nella tabella 4.
    1. Utilizzare il touchpad per avviare il programma di controllo. Creare un nuovo album e un nuovo nome file.
    2. Piastra di posizione sotto l'obiettivo. Impostare il tempo di esposizione e l'intensità della fluorescenza utilizzando la linea di base (trattamento EV/controllo) e il controllo positivo, in modo che il segnale sia visibile ma non saturo.
    3. Salvare un'immagine a campo luminoso e un'immagine GFP/FITC.

6. Misurazioni quantitative dei giornalisti utilizzando un citometro di flusso di particelle di grandi dimensioni

NOTA: la crescita e la preparazione di vermi per l'analisi del citometro del flusso di particelle di grandi dimensioni possono seguire gli stessi paradigmi delle sezioni da 1 a 5 per la preparazione dei vermi per l'imaging fluorescente, con l'eccezione che è necessario un numero maggiore di animali. Utilizzare >500 animali per condizione, poiché alcuni animali vengono persi durante la manipolazione, non tutti gli animali superano i criteri di filtraggio durante la quantificazione e alcuni animali non vengono letti correttamente dal citometro di flusso. Lavare gli animali pronti per lo smistamento delle piastre in 5-10 mL di soluzione M9 in tubi conici da 15 mL per la successiva selezione sul citometro di flusso.

  1. Impostazione dell'ordinamento con un citometro di flusso di particelle di grandi dimensioni
    1. Prima di accendere il citometro di flusso
      1. Assicurarsi che la bottiglia liquida di corona non sia vuota. Preparare il liquido di ottana dallo stock 250x almeno un paio d'ore prima dell'uso della selezionatrice, in quanto vi è una piccola quantità di detersivo nel liquido di ottana, che può causare bolle che possono causare artefatti durante l'acquisizione.
      2. Assicurarsi che tutti i contenitori dei rifiuti non siano pieni.
    2. Accensione del citometro di flusso
      1. Accendere il compressore d'aria. Trasformarlo in Auto. Controllare il misuratore di pressione - dovrebbe essere di circa 30 psi.
      2. Accendere lo strumento. Utilizzare l'interruttore di alimentazione che si trova accanto al cavo di alimentazione a sinistra dello strumento.
      3. Accendere i laser. Una sorgente luminosa di 488 nm è in genere sufficiente per la maggior parte degli esperimenti, anche se è necessario utilizzare una sorgente luminosa da 561 nm se è necessaria un'eccitazione maggiore per la fluorescenza rossa.
      4. Aprire il software FlowPilot; lo strumento dovrebbe fare una serie di clic accendono le diverse valvole.
      5. Accendere i laser nella finestra del software facendo clic su Start. Avviare il laser nella finestra popup del controllo laser Argon facendo clic su Esegui. Questo dovrebbe causare il laser per accendere e raggiungere circa 12 mW. Il livello di sorgente luminosa 488 salirà a circa 12.
      6. Fare clic su Fine per chiudere la finestra.
    3. Controlli sul software prima di procedere
      1. Controllare i misuratori di pressione -Osservare i 4 valori di pressione visualizzati nella parte inferiore della finestra. I valori devono essere intorno alla configurazione originale (Sheath 5.5-5.7; Campione 5.7-6.0; Sorter 3.1-3.3; Pulire 8.5-8.7). Se l'aspetto è simile, selezionare la casella accanto a Pressione OK.
      2. Controllare la fluidicsina -Per assicurarsi che non ci siano bolle d'aria e detriti che bloccano il flusso di diame / campione attraverso la cella di flusso, fare clic su Pulisci più volte.
      3. Controllare la velocità di flusso della sequenza - Per questo, raccogliere la foia per 60 s. Switch Off Sort, quindi attivare la focherazione nei controlli manuali per avviare il flusso di focherazione. Raccogliere in un tubo da 15 mL per 60 s; la portata deve essere di 9-10 mL/min.
    4. Pulizia prima dell'uso del citometro di flusso
      1. Inserire nella raccolta 'cup' la soluzione di candeggina da 3-5 mL e fare clic su Acquisisci. Lasciare correre per 30 s, fare clic su Interrompie rimuovere l'eccesso con vuoto.
      2. Risciacquare la "tazza" della collezione con acqua deionizzata e rimuovere con vuoto. Ripetere 2x.
      3. Inserire 3-5 mL di soluzione di pulizia COPAS nella collezione 'cup' e fare clic su Acquisisci. Lasciare correre per 30 s, fare clic su Interrompie rimuovere la soluzione di pulizia in eccesso con vuoto.
      4. Risciacquare la "tazza" della collezione con acqua deionizzata e rimuovere con vuoto. Ripetere 2x.
      5. Inserire la soluzione M9 da 3-5 mL nella raccolta 'cup' e fare clic su Acquisisci. Lasciare correre per 30 s, fare clic su Interrompie rimuovere la soluzione M9 in eccesso con vuoto.
  2. Esecuzione di campioni su Sorter
    1. Regolare la potenza del PMT laser e il gating delle dimensioni in base alla condizione che causa l'attivazione più brillante del reporter trascrizionale di interesse. Le impostazioni consigliate sono disponibili nella tabella 4.
    2. Aggiungere vermi preparati a 'cup'. Fare clic su Acquisisci. Guardare per assicurarsi che tutto il liquido non sia assorbito nella macchina; questo farà sì che il citometro di flusso acquisisca aria e crei bolle nel rivelatore.
    3. Fare clic su Interrompi quando il campione è basso e/o sono stati raccolti un numero sufficiente di animali.
    4. Fare clic su Configurazione . Memorizzazione dei dati Solo gated. In questo modo i dati verranno salvati solo in base ai vincoli di dimensione. Fai clic su Store Gated e salva i dati gated. Fare clic su Cancella per cancellare i dati.
    5. Risciacquare la "tazza" della collezione con acqua deionizzata e rimuovere con vuoto. Ripetere 2x.
    6. Ripetere i passaggi 6.2.1-6.2.5 con il resto dei campioni.
  3. Calibrazione/ Controllo qualità - se necessario
    NOTA: Questo richiede il controllo in esecuzione 42 particelle fluorescenti GYR m fornite, per calibrare il laser 488.
    1. Premere il labbro metallico sulla parte superiore della tazza campione per rimuovere il tubo dell'aria. Svitare il tappo e utilizzare una siringa per rimuovere il liquido dalla tazza del campione.
    2. Mescolare bene la bottiglia di particelle di controllo prima dell'uso e aggiungere pochi millilitri nella tazza del campione. Chiudere il tappo e rimettere l'aria premendolo fino a quando non fa clic in posizione.
    3. Nel software, accedere all'opzione Strumenti e fare clic su Esegui particelledi controllo .
    4. Per le particelle di controllo, reimpostare i valori PMT su: GREEN - 325; GIALLO - 365; ROSSO - 575.
    5. Fare clic su Acquisisci. La fala deve essere accesa seguita dal campione. Una volta che le perline iniziano a passare attraverso la cella di flusso, la portata sarà visibile nella parte inferiore dello schermo. In modo ottimale, la portata deve essere compresa tra 5/s e 15/s. Se la portata è troppo bassa o zero, ruotare fisicamente la valvola campione in senso orario per aumentare la portata. Se la portata è troppo elevata, ruotare la valvola campione fisicamente in senso antiorario per ridurre la portata.
      NOTA: Normalmente, in modalità di risparmio di perline, 500 perline vengono lette prima di spegnere. I dati possono essere cancellati e perline ri-lette.
    6. Una volta completata la lettura, verificare la presenza di singoli picchi puliti per i 5 parametri e i valori CV. Il Coefficiente di varianza (CV) deve essere <15%. Inoltre, assicurati che i valori CV per i tre diversi canali fluorescenti siano vicini l'uno all'altro.
    7. Effettuare un record del controllo QC: nella scheda File, fare clic su Salva come immagine dello schermo.
  4. Pulizia e spegnimento
    1. Utilizzare un vuoto per rimuovere il campione dalla tazza campione e ripetere la sezione 4.1.4.
    2. Inserire 3-5 mL di acqua deionizzata nella raccolta 'cup' e fare clic su Acquisisci, lasciare correre per 30 s e quindi fare clic su Interrompi. Lasciare un po' d'acqua distillata nella tazza del campione.
    3. Svuotare la tazza di recupero del campione e la bottiglia di scarto.
    4. Spegnere il software. Nella scheda File fare clic su Esci. Nel menu a comparsa, fare clic su Disattiva senza eliminazione.
    5. Spegnere il laser, spegnere lo strumento, quindi spegnere il compressore d'aria. Chiudere il portello per coprire lo strumento.

7. Saggi fisiologici per misurare la sensibilità allo stress in C. elegans

  1. Misurazione della sensibilità allo stress ER mediante esposizione alla tunicamicina
    1. Preparare piastre DMSO NGM RNAi avvistate con batteri RNAi che prendono di mira il gene di interesse come nella sezione 3. Utilizzare batteri HT115 anche in esperimenti che non coinvolgono RNAi knockdown (vedi Sezione 1). Ricordatevi di seme anche piastre NGM RNAi TM (vedi Tabella 1). Semina una quantità sufficiente di piatti: pianifica le serie di placche NGM RNAi DMSO e 2-3 set di piastre NGM RNAi TM.
    2. Sincronizzare gli animali di scelta utilizzando i metodi descritti nella sezione 2.
    3. Piatto uova su NGM RNAi DMSO piastre di semi di scelta utilizzando i criteri raccomandati nella tabella 2. Assicurarsi di preparare 2 volte il numero di piastre necessarie in quanto metà del campione verrà trasferita alle piastre NGM RNAi TM.
    4. Incubare le uova a 20 gradi centigradi per circa 3-4 giorni (65-96 h) al primo giorno di età adulta.
    5. Al primo giorno, preparare le durate di vita trasferendo gli animali su piastre separate. Per conservare le piastre (poiché i costi TM sono elevati), utilizzare 8 piastre di 15 animali per condizione, per un totale di 120 animali per condizione. Questo permette un numero gestibile di animali per piatto per il punteggio e permette una quantità sufficiente di animali per analisi statistiche, anche con una certa censura.
    6. Per i primi 5-7 giorni, allontanagli gli animali adulti dalla progenie ogni giorno su un nuovo piatto fino a quando la progenie non è più visibile. Durante questa fase, censurare gli animali che sono insaccati, esporre sportrusioni/esplosioni volunti, o strisciare sui lati delle piastre, in quanto queste non sono morti associate con sensibilità allo stress ER. Si noti che il trattamento TM provoca l'arresto negli animali, e quindi solo 1-2 mosse di questi animali ogni 2-3 giorni è sufficiente a ridurre al minimo i costi associati alla produzione di piastre contenenti TM. Gli animali di tipo selvatico hanno una sopravvivenza media di 15-17 giorni su DMSO e 12-14 giorni su tunicamcyin.
    7. Dopo che gli animali hanno smesso di produrre progenie, segna la durata della vita ogni 1-2 giorni fino a quando tutti gli animali sono classificati come morti o censurati. TM-trattare gli animali ogni giorno durante il giorno 6-14 di età adulta per una risoluzione più alta.
  2. Misurazione della sensibilità allo stress mitocondriale e ossidativo utilizzando l'esposizione al paraquat
    1. Preparare piastre avvistate con batteri RNAi che prendono di mira il gene di interesse come nella sezione 3. Utilizzare batteri HT115 anche in esperimenti che non coinvolgono RNAi knockdown (vedi Introduzione).
    2. Sincronizzare gli animali di scelta utilizzando i metodi descritti nella sezione 2.
    3. Piatto uova su piastre di semi NGM RNAi a scelta utilizzando i criteri raccomandati nella tabella 1. Il saggio richiede 60-100 animali per condizione, quindi preparatevi di conseguenza.
    4. Incubare le uova a 20 gradi centigradi per circa 3-4 giorni (65-96 h) al primo giorno di età adulta.
    5. Preparare una fiala fresca da 100 mM in soluzione M9.
    6. Pipette 50-75 - L di M9-paraquat in altrettanti pozzi di una piastra piatta di 96 po' di fondo come desiderato. Si raccomanda generalmente di avere 8-10 pozzi per condizione contenenti 8-10 animali per pozzo. Ciò consente un numero facilmente visibile di animali per pozzo con 80 dollari per ceppo.
    7. Scegli 8-10 animali per condizione e trasferiscili in ogni pozzo contenente M9 paraquat. Utilizzare un plettro per trasferire gli animali nei pozzi piuttosto che pipettare per evitare differenze di volume e cambiamenti involontari nelle concentrazioni di paraquat.
    8. Ogni 2 h, punteggio per la morte di animali in ogni pozzo. Toccare delicatamente le piastre, che causerà gli animali vivi a thrash o piegarsi. Si noti che è possibile che gli animali vivi sono a volte paralizzati abbastanza a lungo da essere segnati come morti. Pertanto, se il numero di animali vivi supera il numero di animali vivi da un periodo di tempo precedente, è probabile che l'animale sia vivo e debba essere senza punteggio (ad esempio, se all'ora 4, 2/10 gli animali sono considerati morti, e all'ora 6, solo 1/10 animali sono morti, l'ora 4 dovrebbe essere indicata come 1/10 animali morti).
  3. Misurazione della sensibilità al calore mediante esposizione a temperature elevate
    1. Preparare piastre avvistate con batteri RNAi che prendono di mira il gene di interesse come nella sezione 3. Utilizzare batteri HT115 anche in esperimenti che non coinvolgono RNAi knockdown (vedi Sezione 1).
    2. Sincronizzare gli animali di scelta utilizzando i metodi descritti nella sezione 2.
    3. Piatto uova su piastre di semi di scelta utilizzando i criteri raccomandati nella tabella 1. Avere 60-100 animali per condizione per i saggi di termotolleranza. Per i saggi di termotolleranza, utilizzare i saggi laici di arresto L1 o di uova per la migliore sincronizzazione in quanto vi è una notevole variabilità in base all'età degli animali nel saggio.
    4. Incubare gli animali a 20oC per circa 3-4 giorni (65-96 h) per effettuare esperimenti al primo giorno di età adulta. Non far crescere vermi a 15 gradi centigradi per esperimenti di shock termico in quanto vi è una differenza minore tra gli animali che sperimentano shock termico da 15 s. contro 20 .
    5. Al primo giorno, preparare gli animali trasferendoli su piatti separati. Si raccomanda generalmente di avere 10-15 animali per piastra con 4-6 piastre, per un totale di 60 animali. Ciò consente un numero gestibile di animali per piastra per il punteggio e consente di estrarne un tempo minimo per gli animali dalle temperature elevate.
    6. Collocare gli animali in un'incubatrice di 37 gradi centigradi e segnare ogni 2 h. Iniziare a segnare per la termotolleranza a 37 gradi centigradi all'ora 5, in quanto poco o nessun decesso si verifica prima di 5 ore. La termotolleranza mediana viene eseguita a 9 ore, quindi le ore 7, 9 e 11 sono tempi critici, anche se a causa dell'incubatore e della variabilità da laboratorio a laboratorio, questo potrebbe dover essere titolato per laboratorio. Inoltre, qualsiasi metodo per ridurre la variabilità aiuterà (ad esempio, non impilare piastre, posizionare le piastre nella stessa area all'interno di una singola incubatrice, ridurre al minimo il tempo di apertura o chiusura dell'incubatrice, togliere solo le piastre dall'incubatrice alla volta per ridurre al minimo il tempo che gli animali trascorrono al di fuori di 37 gradi centigradi, ecc. Per una guida completa, vedere21).
    7. In alternativa al punto 7.3.6, collocare gli animali a 34 gradi centigradi invece di 37 gradi centigradi. La termotolleranza mediana a 34 gradi centigradi è di poco superiore a 14 h, quindi i punti temporali 12, 14 e 16 sono fondamentali per i saggi di termotolleranza a 34 gradi centigradi.

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Risultati

Utilizzo di reporter trascrizionali per misurare l'attivazione delle risposte allo stress
Qui vengono utilizzati reporter trascrizionali fluorescenti, che servono come strumenti robusti per misurare l'attivazione della maggior parte delle risposte allo stress in C. elegans. L'espressione GFP è guidata sotto il promotore di obiettivi canonici di regolatori trascrizionali principali coinvolti nella risposta alle sollecitazioni specifiche del compartimento. Un el...

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Discussione

Qui, vengono descritti metodi per interrogare le risposte allo stress cellulare in C. elegans,utilizzando reporter trascrizionali fluorescenti e analisi di sopravvivenza allo stress fisiologico. Tutti i giornalisti utilizzano l'espressione GFP guidata sotto il promotore di un obiettivo trascrizionale a valle dei fattori di trascrizione coinvolti nel montaggio delle risposte allo stress cellulare. L'uso di hsp-4p::GFP modulato da UPRERmediato da XBP-1s , hsp-6p::GFP controllato da ATF...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

R.BZ. è supportato dalla borsa di studio A lungo termine EMBO e dalla Larry L. Hillblom Foundation. R.H.S è supportato dalla sovvenzione 5F32AG032023-02 attraverso il National Institute of Aging (NIA) e la Glenn Foundation for Medical Research Postdoctoral Fellowship. A.F. è sostenuta dalla sovvenzione F32AG051355 attraverso la NIA. H.K.G. è supportato dalla sovvenzione DGE1752814 attraverso il National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program. M.G.M. è supportato da 1F31AG060660-01 attraverso NIA. A.D. è supportato dalla Thomas and Stacey Siebel Foundation, dall'Howard Hughes Medical Institute e dal 4R01AG042679-04 e da 5R01AG055891-02 della NIA e da 5R01ES021667-09 del NIEHS. Ringraziamo Larry Joe, Melissa Sanchez, Naame Kelet e Anel Esquivel per un'assistenza tecnica significativa. Ringraziamo il laboratorio Morimoto e il CGC (finanziato dal NIH Office of Research Infrastructure Program P40 OD010440) per le varietà.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Antimicina ASigma-AldrichA8674per stress mitocondriale
Bacto PeptoneFisher ScientificDF0118072per piastre NGM
BD Difco agar granulatoVWR90000-782per piastre NGM
Cloruro di calcio diidratoVWR97061-904per piastre NGM
CarbenicillinaBioPioneerC0051-25per RNAi
ColesteroloSigma-Aldrich57-88-5per piastre NGM
COPAS BiosorterUnion Biometrica350-5000-000dotato di sorgente luminosa a 488 nm.
Soluzione detergente COPASUnion Biometrica300-5072-000da utilizzare con COPAS
Soluzione di guainaCOPAS Union Biometrica300-5070-100da utilizzare con COPAS
DMSOSigma-Aldrich 472301solvente per farmaci
IPTG senza diossanoDenville ScientificCI8280-4per RNAi
LB Brodo MillerFisher ScientificBP1426500per
stereoscopio LB M205FALeica10450040dotato di una fotocamera CCD monocromatica Leica DFC3000G, filtro Leica GFP standard (ex 395-455, EM 480 LP) e software LAS X
Solfato di magnesio eptaidratoVWREM-MX0070-3per piastre NGM, M9
ParaquatSigma-Aldrich36541per stress ossidativo/mitocondriale
Cloruro di potassioFisherP217-500per soluzione di candeggina
Fosfato di potassio bibasicoVWREM-PX1570-2per piastre NGM
Fosfato di potassio monobasicoVWREM-PX1565-5per M9
RevolveECHO75990-514dotato di obiettivo Olympus 4x Plan Fluorite NA 0.13, filtro FITC Olympus standard (ex 470/40; em 525/50; DM 560) e un iPad Pro per la fotocamera e per pilotare il software ECHO
Sodium AzideSigma-Aldrich71289-50Gper l'imaging
Sodium ChlorideEMD MilliporeSX0420-5per lastre NGM, M9
Sodium phosphate dibasicoVWR71003-472per M9
Tert-butyl hydroperoxideSigma-Aldrich458139per lo stress
ossidativoTetraciclina cloridratoSigma-AldrichT7660-5Gper RNAi
TunicamicinaSigma-AldrichT7765-50MGper stress ER

Riferimenti

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