Qui, caratterizziamo le risposte di stress proteotossico cellulare nel nematode C. elegans misurando l'attivazione di reporter trascrizionali fluorescenti e analizzando la sensibilità allo stress fisiologico.
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Articolo metodologico
Misurazioni delle risposte allo stress fisiologico in C. Elegans
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gli organismi sono spesso esposti ad ambienti fluttuanti e cambiamenti nell'omeostasi intracellulare, che possono avere effetti negativi sul loro proteoma e sulla fisiologia. Così, gli organismi hanno evoluto risposte mirate e specifiche allo stress dedicate a riparare i danni e mantenere l'omeostasi. Questi meccanismi includono la risposta proteica dispiegata del reticolo endolamico (UPRER),la risposta proteica dispiegata dei mitocondri (UPRMT), la risposta allo shock termico (HSR) e la risposta allo stress ossidativo (OxSR). I protocolli qui presentati descrivono i metodi per rilevare e caratterizzare l'attivazione di questi percorsi e le loro conseguenze fisiologiche nel nematode, C. elegans. In primo luogo, l'uso di reporter trascrizionali fluorescenti specifici del percorso è descritto per la caratterizzazione cellulare rapida, lo screening farmacologico o lo screening genetico su larga scala (ad esempio, RNAi o librerie mutanti). Inoltre, vengono descritti saggi fisiologici complementari e robusti, che possono essere utilizzati per valutare direttamente la sensibilità degli animali a fattori di stress specifici, servendo come convalida funzionale dei reporter trascrizionali. Insieme, questi metodi consentono una rapida caratterizzazione degli effetti cellulari e fisiologici delle perturbazioni proteotossiche interne ed esterne.
Introduzione
La capacità di un organismo di rispondere ai cambiamenti nell'ambiente intra ed extracellulare è cruciale per la sua sopravvivenza e adattamento. Questo si ottiene a livello cellulare attraverso numerose vie protettive che garantiscono l'integrità della cellula. Mentre numerosi componenti cellulari sono soggetti a danni associati allo stress, uno dei principali coinvolgimenti delle risposte allo stress cellulare è quello di riparare e proteggere l'omeostasi del proteoma cellulare. Tuttavia, la compartimentazione delle proteine in strutture speciali, chiamate organelli, rappresenta una sfida per la cellula, in quanto non può basarsi su una forma centralizzata di contro....
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Protocollo
1. Condizioni di crescita standard delle temperature e OP50 rispetto all'HT115
- Crescita ed espansione standard
- Coltivare una cultura di OP50 in LB (Tabella 1) o supporti equivalenti di scelta per 24-48 h a temperatura ambiente (22-25 gradi centigradi). Crescere batteri a temperatura ambiente come OP50 è un uracicolo auxotroph e c'è una maggiore incidenza di rerevertant (ad esempio, mutanti soppressori) quando coltivato a 37 gradi centigradi. L'archiviazione a lungo termine delle colture OP50 non è consigliata (massimo 1 settimana a 4 gradi centigradi).
- Semina un volume di 100-200 dollari di coltura OP50 satura su una piast....
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Risultati
Utilizzo di reporter trascrizionali per misurare l'attivazione delle risposte allo stress
Qui vengono utilizzati reporter trascrizionali fluorescenti, che servono come strumenti robusti per misurare l'attivazione della maggior parte delle risposte allo stress in C. elegans. L'espressione GFP è guidata sotto il promotore di obiettivi canonici di regolatori trascrizionali principali coinvolti nella risposta alle sollecitazioni specifiche del compartimento. Un el.......
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Discussione
Qui, vengono descritti metodi per interrogare le risposte allo stress cellulare in C. elegans,utilizzando reporter trascrizionali fluorescenti e analisi di sopravvivenza allo stress fisiologico. Tutti i giornalisti utilizzano l'espressione GFP guidata sotto il promotore di un obiettivo trascrizionale a valle dei fattori di trascrizione coinvolti nel montaggio delle risposte allo stress cellulare. L'uso di hsp-4p::GFP modulato da UPRERmediato da XBP-1s , hsp-6p::GFP controllato da ATF.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
R.BZ. è supportato dalla borsa di studio A lungo termine EMBO e dalla Larry L. Hillblom Foundation. R.H.S è supportato dalla sovvenzione 5F32AG032023-02 attraverso il National Institute of Aging (NIA) e la Glenn Foundation for Medical Research Postdoctoral Fellowship. A.F. è sostenuta dalla sovvenzione F32AG051355 attraverso la NIA. H.K.G. è supportato dalla sovvenzione DGE1752814 attraverso il National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program. M.G.M. è supportato da 1F31AG060660-01 attraverso NIA. A.D. è supportato dalla Thomas and Stacey Siebel Foundation, dall'Howard Hughes Medical Institute e dal 4R01AG042679-04 e da 5R01AG055891-02 della NIA e da 5....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Antimicina A | Sigma-Aldrich | A8674 | per stress mitocondriale |
| Bacto Peptone | Fisher Scientific | DF0118072 | per piastre NGM |
| BD Difco agar granulato | VWR | 90000-782 | per piastre NGM |
| Cloruro di calcio diidrato | VWR | 97061-904 | per piastre NGM |
| Carbenicillina | BioPioneer | C0051-25 | per RNAi |
| Colesterolo | Sigma-Aldrich | 57-88-5 | per piastre NGM |
| COPAS Biosorter | Union Biometrica | 350-5000-000 | dotato di sorgente luminosa a 488 nm. |
| Soluzione detergente COPAS | Union Biometrica | 300-5072-000 | da utilizzare con COPAS |
| Soluzione di guaina | COPAS Union Biometrica | 300-5070-100 | da utilizzare con COPAS |
| DMSO | Sigma-Aldrich 472301 | solvente per farmaci | |
| IPTG senza diossano | Denville Scientific | CI8280-4 | per RNAi |
| LB Brodo Miller | Fisher Scientific | BP1426500 | per |
| stereoscopio LB M205FA | Leica | 10450040 | dotato di una fotocamera CCD monocromatica Leica DFC3000G, filtro Leica GFP standard (ex 395-455, EM 480 LP) e software LAS X |
| Solfato di magnesio eptaidrato | VWR | EM-MX0070-3 | per piastre NGM, M9 |
| Paraquat | Sigma-Aldrich | 36541 | per stress ossidativo/mitocondriale |
| Cloruro di potassio | Fisher | P217-500 | per soluzione di candeggina |
| Fosfato di potassio bibasico | VWR | EM-PX1570-2 | per piastre NGM |
| Fosfato di potassio monobasico | VWR | EM-PX1565-5 | per M9 |
| Revolve | ECHO | 75990-514 | dotato di obiettivo Olympus 4x Plan Fluorite NA 0.13, filtro FITC Olympus standard (ex 470/40; em 525/50; DM 560) e un iPad Pro per la fotocamera e per pilotare il software ECHO |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 71289-50G | per l'imaging |
| Sodium Chloride | EMD Millipore | SX0420-5 | per lastre NGM, M9 |
| Sodium phosphate dibasico | VWR | 71003-472 | per M9 |
| Tert-butyl hydroperoxide | Sigma-Aldrich | 458139 | per lo stress |
| ossidativoTetraciclina cloridrato | Sigma-Aldrich | T7660-5G | per RNAi |
| Tunicamicina | Sigma-Aldrich | T7765-50MG | per stress ER |
Riferimenti
- Higuchi-Sanabria, R., Frankino, P. A., Paul, J. W., Tronnes, S. U., Dillin, A. A Futile Battle? Protein Quality Control and the Stress of Aging. Developmental Cell. 44 (2), 139-163 (2018).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
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Ristampe e permessi
Tag
Risposta allo stress di C elegansrisposta al shock termicorisposta alle proteine malripiegaterisposta allo stress ossidativoreporter trascrizionali fluorescentianalisi tramite citometria a flussosaggio di sensibilit al paraquatsaggio di sopravvivenza per la termotolleranzaknockdown di XBP 1knockdown di DAF 2
