Presentato qui è un protocollo per valutare le proprietà contraili dei miofibrili muscolari striati con risoluzione nano-Newton. Il protocollo utilizza una configurazione con una sonda a forza ottica basata sull'interferometria. Questa configurazione genera dati con un elevato rapporto segnale-rumore e consente la valutazione della cinetica contrattinale delle miofibrils.
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Articolo metodologico
Isolamento di Myofibrils da biopsie muscolari scheletriche e determinazione della funzione Contractile con un trasduttore della forza di risoluzione Nano-Newton
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule muscolari striate sono indispensabili per l'attività di esseri umani e animali. Le fibre muscolari singole sono costituite da miofibrils, che consistono in sarcomere collegati in serie, le più piccole unità contraili nel muscolo. La disfunzione sarcomerica contribuisce alla debolezza muscolare nei pazienti con mutazioni nei geni che codificano per le proteine sarcomeriche. Lo studio della meccanica miofibrile consente la valutazione delle interazioni actin-myosin senza potenziali effetti confusi di miofibrili danneggiati e adiacenti quando si misura la contrattilità delle singole fibre muscolari. I danni ultrastrutture e il disallineamento dei miofibrils potrebbero contribuire a una contrattura compromessa. Se nei miofibrils sono presenti danni strutturali, probabilmente si rompono durante la procedura di isolamento o durante l'esperimento. Inoltre, gli studi in miofibrils forniscono la valutazione delle interazioni actin-myosin in presenza dei vincoli geometrici dei sarcomere. Ad esempio, le misurazioni nei miofibrils possono chiarire se la disfunzione miofibrillare sia l'effetto primario di una mutazione in una proteina sarcomerica. Inoltre, la perfusione con soluzioni di calcio o composti è quasi istantanea a causa del piccolo diametro del miofibril. Questo rende myofibrils eminentemente adatto a misurare i tassi di attivazione e rilassamento durante la produzione di forza. Il protocollo descritto in questo documento utilizza una sonda di forza ottica basata sul principio di un interferometro Fabry-Pérot in grado di misurare le forze nella gamma nano-Newton, accoppiato a un motore di lunghezza piezo e un sistema di perfusione in fase rapida. Questa configurazione consente lo studio della meccanica miofibrile con misurazioni della forza ad alta risoluzione.
Introduzione
Le cellule muscolari striate sono indispensabili per le attività quotidiane. Il movimento degli arti, la funzione respiratoria e il movimento di pompaggio del cuore si basano sulla forza generata dalle cellule muscolari. Il muscolo scheletrico è costituito da fascicle muscolari contenenti fasci di fibre muscolari singole (Figura 1A). Queste fibre muscolari sono costituite da miofibrils, che sono formate da sarcomere collegati in serie (Figura 1B,D). I sarcomere contengono filamenti sottili e spessi. Questi consistono principalmente in catene di molecole di actina e miosina, rispettivamente (<....
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Protocollo
Il protocollo per ottenere biopsie umane è stato approvato dal comitato di revisione istituzionale del VU University Medical Center (#2014/396) e il consenso scritto informato è stato ottenuto dai soggetti. Il protocollo per ottenere biopsie muscolari animali è stato approvato dal comitato etico animale locale presso l'Università VU (AVD114002016501)
1. Preparazione e isolamento miofibrile
NOTA: Utilizzare metodi descritti in precedenza per la glicecinazione delle biopsie, preparare le diverse soluzioni di concentrazione di calcio (pCa)7,16,
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Risultati
Le tracce dei dati sono state registrate e aperte con il software del controllore di sistema (vedere Tabella dei materiali). Le tracce complete o i segmenti selezionati sono stati esportati negli appunti o nel file di testo per un'ulteriore analisi con il software desiderato. Le valvole per controllare il flusso delle diverse soluzioni sono state commutate con software personalizzato o manualmente. Uno script MATLAB personalizzato è stato utilizzato per analizzare i tassi di attivazione, riqualificazione.......
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Discussione
Descritto è un protocollo per valutare la funzione contrattile dei miofibrili isolati dai tessuti muscolari scheletrici umani o animali. La risoluzione della forza di questa configurazione è stata descritta in precedenza da Chavan et al.12. In breve, è determinato dalle fluttuazioni casuali della lunghezza della cavità Fabry-Pérot formata tra la fibra di rilevamento e il cantilever, che producono la parte dominante del rumore all'uscita del readout (espresso in V) che, moltiplicato per la sensibil.......
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Dichiarazioni
Michiel Helmes è azionista e co-proprietario di IONOptix Inc.
Ringraziamenti
Questo progetto è stato finanziato da AFM-Telethon e A Foundation Building Strength per le miopatie nemaline. Gli autori desiderano riconoscere il creatore dei prodotti menzionati in questo articolo, IONOptix Inc.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Prodotti Bio Spec, Inc. | 985370-XL | Per isolare le miofibrille | |
| Codificato | Matlab | ||
| Fabbricato | Include il programma Labview per il controllo della connessione seriale; Per controllare le valvole | ||
| Fabbricato | Per raffreddare il modulo | ||
| Fabbricato | |||
| Camera tissutale | |||
| Fabbricato | Per controllare le valvole; Include un software per PC per il controllo tramite USB | ||
| IonOptix | : software di registrazione dati con generatore di segnali avanzato per piezo e IonOptix | ||
| Per registrare la lunghezza | |||
| IonOptix | Include: Optiforce (interferometro), micromanipolatori, interfaccia di segnale, motore piezoelettrico e controller. Basato sulla sonda di forza MyoStretcher | ||
| IonOptix | |||
| Sigma-Aldrich | 529265 | Poli(2-idrossietilmetacrilato); Rivestimento per vetrini da microscopio per evitare l'incollaggio del tessuto | |
| Sigma-Aldrich | 78471 | Cristalli da sciogliere in etanolo con conseguente colla | |
| TE Technology, Inc. | TE-63-1.0-1.3 | Per raffreddare la camera | |
| TE Technology, Inc. | TC-720 | Include un software per PC per il controllo tramite USB | |
| Tecan Trading AG | 20736652 | ||
| Tecan Trading AG | 20739263 | Pompa a siringa per indurre il flusso di fondo insieme al sistema di perfusione a passo rapido; Deflusso dalla camera | |
| Thermo scientific | 2441081 | ||
| Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.) | fuori produzione | : SF-77CST/VCS-77CSP | |
| Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.) | TG150-4 | Per perfondere il tessuto | |
| 1 PC per IonWizard e 1 PC per altri software |
Riferimenti
- Winter, J. M., Ottenheijm, C. A. C. Sarcomere Dysfunction in Nemaline Myopathy. J. Neuromuscular. Disease. 4, 99-113 (2017).
- Colomo, F., Piroddi, N., Poggesi, C., te Kronnie, G., Tesi, C. Active and passive forces of isolated myofibrils from cardiac and f....
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Ristampe e permessi
