Method Article

Caratterizzazione delle strutture amiloidi nell'invecchiamento C. Elegans utilizzando Fluorescence Lifetime Imaging

DOI:

10.3791/61004

⸱

March 27th, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Leibniz Research Institute for Molecular Pharmacology im Forschungsverbund Berlin, 2NeuroCure Cluster of Excellence, Charité - Universitätsmedizin Berlin, 3Molecular Neuroscience Group, Department of Chemical Engineering and Biotechnology, University of Cambridge, 4Cell Biology, University of Bremen

In This Article

Summary

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L'imaging a vita di fluorescenza monitora, quantifica e distingue le tendenze di aggregazione delle proteine nei modelli di malattia di C. elegans viventi, invecchiamento e stressati.

Abstract

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Le fibrille amiloidi sono associate a una serie di malattie neurodegenerative come la Malattia di Huntington, Parkinson o Alzheimer. Queste fibrille amiloidi possono seprussiane le proteine metastabili endogene così come i componenti della rete proteostasi (PN) e quindi esacerbare il ripiegamento mistribosco proteico nella cellula. Ci sono un numero limitato di strumenti disponibili per valutare il processo di aggregazione delle proteine amiloidi all'interno di un animale. Presentiamo un protocollo per la microscopia a vita di fluorescenza (FLIM) che consente il monitoraggio e la quantificazione della fibrillazione amiloide in cellule specifiche, come i neuroni, in modo non invasivo e con la progressione dell'invecchiamento e il PN. FLIM è indipendente dai livelli di espressione del fluoroforo e consente un'analisi del processo di aggregazione senza ulteriori colorazioni o sbiancamenti. I fluorofori vengono spenti quando si trovano nelle immediate vicinanze di strutture amiloidi, il che si traduce in una diminuzione della durata della fluorescenza. Lo spegnimento è direttamente correlato all'aggregazione della proteina amiloide. FLIM è una tecnica versatile che può essere applicata per confrontare il processo di fibrilizzazione di diverse proteine amiloidi, stimoli ambientali o background genetici in vivo in modo non invasivo.

Introduction

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L'aggregazione proteica si verifica sia nell'invecchiamento che nella malattia. I percorsi che portano alla formazione e alla deposizione di grandi amiloidi o inclusioni amorfosi sono difficili da seguire e la loro cinetica è altrettanto difficile da svelare. Le proteine possono misfold a causa di mutazioni intrinseche all'interno delle loro sequenze di codifica, come nel caso delle malattie genetiche. Le proteine si piegano male perché la rete proteostasi (PN) che le mantiene solubili e piegate correttamente è compromessa, come accade durante l'invecchiamento. Il PN comprende chaperones molecolari e macchine per degradazione ed è responsabile della biogenesi, del rip....

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Protocol

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1. Sincronizzazione di C. elegans

  1. Sincronizzare C. elegans tramite il trattamento della soluzione di ipoclore alcalina o tramite semplice deposizione delle uova per 4 h a 20.
  2. Coltivare e mantenere i nematodi a 20 gradi centigradi sulle piastre del mezzo di crescita dei nematodi (NGM) seminate con OP50 E. coli secondo le procedure standard9. Età i nematodi fino alla fase di sviluppo desiderata o giorno.
    NOTA: In questo protocollo, i giovani adulti sono immagini il giorno 4 e vecchi nematodi sono immagine il giorno 8 della vita.

2. Knockdown ....

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Results

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Il protocollo mostra come monitorare con precisione la formazione di specie aggregate nei C. elegan viventi,sia durante il suo invecchiamento naturale che quando sottoposto a stress. Abbiamo selezionato quattro diversi ceppi di nematodi transgenici che esprimono proteine della poliglutamina di 40Q, 44Q o 85Q. Queste proteine sono sintetizzate in tessuti diversi e sono state fuse a diversi fluorofori. I ceppi C. elegans espresso Q40-mRFP nei muscoli della parete del corpo.......

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Discussion

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Il protocollo qui presentato descrive una tecnica basata sulla microscopia per identificare le specie aggregate nel sistema modello C. elegans. FLIM può caratterizzare con precisione la presenza di specie aggregate e solubili fuse in un fluoroforo attraverso la misurazione dei loro decadimenti di durata della fluorescenza. Quando una proteina di fusione inizia ad aggregare la sua durata media registrata passerà da un valore superiore a un valore più bassodi 16. La propensione all'aggregaz.......

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Disclosures

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

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Il ceppo muscolare-Q40-mRFP fornito dal CGC, che è finanziato dal NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Il neuronale-Q40-CFP era un dono gentile del Morimoto Lab. Riconosciamo il DFG (KI-1988/5-1 a JK, la borsa di studio NeuroCure PhD del Cluster di Eccellenza NeuroCure a MLP), l'EMBO (Short term fellowship to MLP) e la Società dei Biologi (travel grants to CG and MLP) per il finanziamento. Riconosciamo anche l'impianto di imaging Advanced Light Microscopy presso il Centro Max Delbràck per la Medicina Molecolare di Berlino, per aver fornito la configurazione per l'immagine dei costrutti YFP.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Agar-Agar Kobe ICarl Roth GmbH + Co. KG5210.2Componente NGM
Ahringer Library hsp-1 siRNAFonte BioScience UK LimitedF26D10.3
AmpicillinaCarl Roth GmbH + Co. KGK029.3Antibiotico
B& H DCS-120 SPC-150Becker & Hickl GmbHFLIM Software per l'acquisizione
B& H SPC830-SPC ImmagineBecker & Hickl GmbHFLIM Software per l'acquisizione
BD Bacto PeptoneBD-Bionsciences211677NGM component
C. elegans iQ44-YFPCAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)OG412
C. elegans iQ85-YFPGentile regalo da Morimoto Lab
C. elegans mQ40-RFPGentile regalo da Morimoto Lab
C. elegans nQ40-CFPGentile regalo da Morimoto Lab
Deckglä ser-18x18mmCarl Roth GmbH + Co. KG0657.2Vetrini coprioggetti
Isopropil-beta;-D-tiogalattopiranoside (IPTG)Carl Roth GmbH + Co. KG2316.4
Leica M165 FCLeica Camera AGStereomicroscopio di montaggio
Leica TCS SP5Leica Camera AGMicroscopio confocale
Levamisolo cloridratoAppliChem GmbHA4341Anestetico
OP50 Escherichia coliCAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)OP50
PicoQuant PicoHarp300PicoQuant GmbHSoftware per l'acquisizione di
sodio Azide di sodioCarl Roth GmbH + Co. KGK305.1Anestetico
Cloruro di sodioCarl Roth GmbH + Co. KG3957.2Componente
NGMStandard-Objektträ gerCarl Roth GmbH + Co. KG0656.1Vetrini in vetro
Universal AgaroseBio & Vendita GmbHBS20.46.500
Zeiss AxioObserver.Z1Carl Zeiss AGMicroscopio confocale
Zeiss LSM510-Meta NLOCarl Zeiss AGMicroscopio confocale

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. Pathways of cellular proteostasis in aging and disease. Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).
  2. Kikis, E. A. The struggle by Caenorhabditis elegans to maintain proteostasis during aging and disease. Bio....

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Fluorescence Lifetime ImagingAmyloid FibrilizationC Elegans ModelProtein Aggregation AnalysisNoninvasive MonitoringFLIM AcquisitionLifetime MeasurementPhoton DetectionAgarose Pad PreparationNeurodegenerative Disease Study

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