Method Article

Modello di sistema autonomo translaminare per la modulazione della pressione intraoculare e intracranica nei segmenti posteriori del donatore umano

DOI:

10.3791/61006

⸱

April 24th, 2020

 ,  ,  , 
1North Texas Eye Research Institute, Department of Pharmacology and Neuroscience, University of North Texas Health Science Center, 2Mechanical Engineer Consultant, 3Department of Ophthalmology and Visual Sciences, School of Medicine and Public Health, University of Wisconsin

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Descriviamo e dettagliamo l'uso del sistema autonomo translaminare. Questo sistema utilizza il segmento posteriore umano per regolare in modo indipendente la pressione all'interno del segmento (intraoculare) e che circonda il nervo ottico (intracranico) per generare un gradiente di pressione translaminare che imita le caratteristiche della neuropatia ottica glaucomatosa.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C'è un bisogno attualmente insoddisfatto di un nuovo modello umano preclinico in grado di indirizzare l'eziologia della malattia ex vivo utilizzando la pressione intracranica (ICP) e la pressione intraoculare (IOP) in grado di identificare vari paradigmi patogenetici correlati alla patogenesi del glaucoma. I modelli di coltura di organi di perfusione del segmento anteriore anteriore umano ex vivo sono stati precedentemente utilizzati e applicati con successo come tecnologie efficaci per la scoperta della patogenesi del glaucoma e la sperimentazione di terapie. Lo screening preclinico dei farmaci e la ricerca condotta su sistemi di organi umani ex vivo possono essere più traducibili nella ricerca clinica. Questo articolo descrive in dettaglio la generazione e il funzionamento di un nuovo modello di pressione translaminare umana ex vivo chiamato sistema autonomo translaminare (TAS). Il modello TAS può regolare in modo indipendente ICP e IOP utilizzando segmenti posteriori di donatori umani. Il modello consente di studiare la patogenesi in modo preclinico. Può ridurre l'uso di animali vivi nella ricerca oftalmica. A differenza dei modelli sperimentali in vitro, la struttura, la complessità e l'integrità del tessuto della testa del nervo ottico (ONH) possono anche essere mantenute all'interno del modello TAS ex vivo.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stime globali in recenti sondaggi suggeriscono che 285 milioni di persone vivono con disabilità visive, tra cui 39 milioni che sono ciechi1. Nel 2010, l'Organizzazione Mondiale della Sanità ha documentato che tre delle nove principali cause di cecità elencate si verificano nel segmento posteriore dell'occhio1. Le malattie oculari del segmento posteriore coinvolgono la retina, la coroide e il nervo ottico2. La retina e il nervo ottico sono estensioni del sistema nervoso centrale (SNC) del cervello. Gli assoni delle cellule gangliari retiniche (RGC) sono vulnerabili ai danni perché escono dall'occhio attraverso la testa del nervo ottico (ONH) per formare il nervo ottico3. L'ONH rimane il punto più vulnerabile per gli assoni RGC a causa della rete 3D dei fasci di tessuto connettivo chiamata lamina cribrosa (LC)4. L'ONH è il sito iniziale di insulto agli assoni RGC nel glaucoma5,6,7, e i cambiamenti di espressione genica all'interno dell'ONH sono stati studiati nei modelli di ipertensione oculare e glaucoma8,9,10. Gli assoni RGC sono sensibili all'ONH a causa dei differenziali di pressione tra il compartimento intraoculare, chiamato pressione intraoculare (IOP), e all'interno dello spazio subaracnoideo perioptico esterno, chiamato pressione intracranica (ICP)11. La regione LC separa entrambe le aree, mantenendo normali differenziali di pressione, con IOP che vanno da 10-21 mmHg e ICP da 5-15 mmHg12. La differenza di pressione attraverso la lamina tra le due camere è chiamata gradiente di pressione translaminare (TLPG)13. Un importante fattore di rischio del glaucoma è l'elevata IOP14.

L'aumento della IOP aumenta la deformazione all'interno e attraverso la regione laminare6,15,16. Osservazioni sperimentali nell'uomo e modelli animali presentano l'ONH come il sito iniziale del danno assonale17,18. Il paradigma biomeccanico dello stress correlato alla IOP e del ceppo che causa danni glaucomatosi all'ONH influenza anche la fisiopatologia del glaucoma19,20,21. Anche se nell'uomo i cambiamenti indotti dalla pressione danneggiano meccanicamente gli assoni RGC22, i roditori privi di placche collagenose all'interno della lamina possono anche sviluppare il glaucoma7,23. Inoltre, la IOP elevata rimane il fattore di rischio più importante nei pazienti con glaucoma primario ad angolo aperto, mentre i pazienti con glaucoma a tensione normale sviluppano neuropatia ottica glaucomatosa anche senza IOP elevata. Inoltre, ci sono anche un sottogruppo di pazienti ipertesi oculari che non mostrano danni al nervo ottico. È stato anche suggerito che la pressione del liquido cerebrospinale (CSFp) possa svolgere un ruolo nella patogenesi del glaucoma. L'evidenza indica che l'ICP è abbassato a ~ 5 mmHg nei pazienti con glaucoma rispetto agli individui normali, causando così un aumento della pressione translaminare e svolgendo un ruolo cruciale nella malattia24,25. In precedenza, è stato dimostrato in un modello canino, che controllando i cambiamenti IOP e CSFp, ci possono essere grandi spostamenti del disco ottico26. L'innalzamento della CSFp negli occhi suini ha anche mostrato un aumento dello sforzo principale all'interno della regione LC e del tessuto neurale retrolaminare. L'aumento della tensione sugli RGC e sulla regione LC contribuisce al blocco del trasporto assonale e alla perdita di RGC27. La progressiva degenerazione degli RGC è stata associata alla perdita del supporto trofico28,29, alla stimolazione dei processi infiammatori/regolazione immunitaria30,31 e agli effettori apoptotici29,32,33,34,35. Inoltre, la lesione assonale (Figura 3) provoca effetti dannosi sugli RGC, innescando il fallimento rigenerativo36,37,38,39. Anche se gli effetti della IOP sono stati ben studiati, sono state condotte ricerche minime su variazioni anomale della pressione translaminare. La maggior parte dei trattamenti per il glaucoma si concentra sulla stabilizzazione della IOP. Tuttavia, anche se l'abbassamento della IOP rallenta la progressione della malattia, non inverte la perdita del campo visivo e previene la perdita completa di RGC. Comprendere i cambiamenti neurodegenerativi legati alla pressione nel glaucoma sarà fondamentale per prevenire la morte di RGC.

Le prove attuali indicano che le modulazioni della pressione translaminare dovute a vari cambiamenti meccanici, biologici o fisiologici in pazienti affetti da disabilità visive traumatiche o neurodegenerative possono causare una significativa perdita della vista. Attualmente, non esiste un vero modello preclinico del segmento posteriore umano che possa consentire lo studio del danno biomeccanico glaucomatoso all'interno dell'ONH umano ex vivo. L'osservazione e il trattamento del segmento posteriore dell'occhio è una sfida enorme in oftalmologia27. Esistono barriere fisiche e biologiche per colpire l'occhio posteriore, tra cui alti tassi di eliminazione, barriera emato-retinica e potenziali risposte immunologiche40. La maggior parte dei test di efficacia e sicurezza per nuovi bersagli farmacologici sono realizzati utilizzando modelli cellulari e animali in vivo in vitro41. L'anatomia oculare è complessa e gli studi in vitro non imitano accuratamente le barriere anatomiche e fisiologiche presentate dai sistemi di modelli tissutali. Anche se i modelli animali sono una necessità per gli studi di farmacocinetica, la fisiologia oculare dell'occhio posteriore umano può variare tra le varie specie animali, tra cui l'anatomia cellulare della retina, la vascolarizzazione e l'ONH41,42.

L'uso di animali vivi richiede norme etiche intensive e dettagliate, un elevato impegno finanziario e un'efficace riproducibilità43. Recentemente, sono seguite molte altre linee guida per l'uso etico degli animali nella ricerca sperimentale44,45,46. Un'alternativa alla sperimentazione animale è l'uso di modelli di occhio umano ex vivo per studiare la patogenesi della malattia e la potenziale analisi dei farmaci per proteggere i danni da ONH. Il tessuto umano post mortem è una risorsa preziosa per lo studio dei paradigmi delle malattie umane, soprattutto nel caso delle malattie neurodegenerative umane, perché l'identificazione di potenziali farmaci sviluppati in modelli animali richiede la necessità di essere traducibili all'uomo47. Il tessuto del donatore umano ex vivo è stato ampiamente utilizzato per lo studio dei disturbi umani47,48,49 e i sistemi di coltura di organi di perfusione del segmento anteriore umano hanno precedentemente fornito un modello ex vivo unico per studiare la fisiopatologia di IOP50,51,52 elevati.

Per studiare la pressione translaminare correlata a IOP e ICP negli occhi umani, abbiamo progettato e sviluppato con successo un sistema autonomo translaminare a due camere (TAS) in grado di regolare in modo indipendente IOP e ICP utilizzando segmenti posteriori dagli occhi dei donatori umani. È il primo modello umano ex vivo a studiare la pressione translaminare e sfruttare gli effetti biomeccanici del TLPG sull'ONH.

Questo modello TAS umano ex vivo può essere utilizzato per scoprire e classificare le modificazioni cellulari e funzionali che si verificano a causa dell'elevazione cronica della IOP o dell'ICP. In questo rapporto, descriviamo in dettaglio il protocollo passo-passo di dissezione, impostazione e monitoraggio del modello del segmento posteriore umano TAS. Il protocollo consentirà ad altri ricercatori di riprodurre efficacemente questo nuovo modello di segmento posteriore umano pressurizzato ex vivo per studiare la patogenesi delle malattie biomeccaniche.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli occhi sono stati ottenuti secondo le disposizioni della Dichiarazione di Helsinki per la ricerca che coinvolge tessuti umani.

NOTA: gli occhi di banche oculari affidabili (ad esempio, Lions Eye Institute for Transplant, Research, Tampa FL) sono stati raccolti entro 6-12 ore dalla morte e il siero del donatore è stato testato per l'epatite B, l'epatite C e il virus dell'immunodeficienza umana 1 e 2. Una volta ricevuti, gli occhi sono stati sezionati e impostati nel modello TAS entro 24 ore. I criteri di esclusione includevano qualsiasi patologia oculare. Gli occhi non sono stati esclusi in base all'età, alla razza o al sesso. Per garantire la vitalità della retina al ricevimento, gli espianti retinici sono stati prelevati dai donatori di tessuto e coltivati per 7 e 14 giorni (Figura supplementare 1). Queste retine sono state anche dissociate e sono cresciute RGC sane in coltura per 7 giorni con colorazione positiva per il marcatore RGC, proteina legante l'RNA con splicing multiplo (RBPMS), nonché colorazione positiva della catena leggera del neurofilamento (NEFL) nei loro neurofilamenti (Figura supplementare 2). .

1. Preparazione e sterilizzazione di attrezzature e forniture

  1. Fare riferimento alla Tabella dei materiali per un elenco completo delle forniture richieste, nonché i numeri di fornitore e di catalogo.
  2. Prima dell'uso, sterilizzare tutte le apparecchiature e gli strumenti in autoclave o utilizzando fiale di ossido di etilene.

2. Preparazione del mezzo di perfusione

  1. Aggiungere l'1% di penicillina streptomicina (10.000 U / mL di penicillina, 10.000 μg / mL di streptomicina in 0,85% NaCl) e l'1% di L-glutammina (200 mM) a 1.000 ml di glucosio alto Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM).
  2. Sterilizzare il mezzo di perfusione passando attraverso un filtro da 0,22 μm.

3. Configurazione del sistema autonomo translaminare (TAS)

  1. Impostare le siringhe di afflusso (serbatoi IOP e ICP).
    1. Aggiungere 30 mL del mezzo di perfusione (paragrafo 2) a una siringa da 30 mL. Attaccare un rubinetto a 3 vie alla siringa da 30 ml. Collegare un filtro idrofilo da 0,22 μm al rubinetto a 3 vie. Collegare un adattatore per stub Luer da 15 G al filtro idrofilo da 0,22 μm.
    2. Rimuovere le bolle d'aria dalla configurazione della siringa. Collegare il tubo all'adattatore per stub Luer da 15 G. Chiudere la porta laterale del rubinetto con un tappo di blocco universale non ventilato. Ripetere l'operazione per un totale di due configurazioni.
    3. Etichettare una siringa come pressione intracranica del canale 1 (CH1 ICP) e l'altra siringa come pressione intraoculare del canale 2 (CH2 IOP).
  2. Impostare siringhe di deflusso (serbatoi IOP e ICP).
    1. Attaccare un rubinetto a 3 vie a una siringa da 30 ml. Collegare un adattatore per stub Luer da 15 G al rubinetto a 3 vie. Collegare il tubo all'adattatore per stub Luer da 15 G.
    2. Chiudere la porta laterale del rubinetto con un tappo di blocco universale non ventilato. Ripetere l'operazione per un totale di due configurazioni. Etichettare una siringa come CH1 ICP e l'altra siringa come CH2 IOP.

4. Preparazione del globo oculare umano intero

NOTA: se vengono ricevuti occhi interi, seguire la procedura riportata di seguito per separare il segmento anteriore dal segmento posteriore dell'occhio. Se gli occhi vengono ricevuti in due, iniziare dal passaggio 4.4.

  1. Mettere un occhio intero nella soluzione di povidone-iodio per 2 minuti.
  2. Risciacquare l'occhio in soluzione tampone fosfato sterile (PBS) per risciacquare il povidone-iodio. Ripeti 2 volte.
  3. Rimuovere gli annessi da tutto il globo oculare usando pinze e forbici. Taglia in due l'occhio all'equatore per separare i segmenti anteriore e posteriore dell'occhio.
  4. Rimuovere la guaina del nervo ottico. Rimuovere l'umore vitreo dal segmento posteriore.
  5. Tagliare la sclera aggiuntiva dal segmento posteriore, se necessario, per garantire una buona aderenza alla cupola rotonda della camera IOP (inferiore). Usando la pinza, assicurarsi che la retina sia distribuita uniformemente sulla parte posteriore del segmento.
  6. Configurazione della camera IOP (inferiore)
    1. Posizionare il segmento posteriore umano nella camera IOP (inferiore) del TAS sopra la cupola rotonda con il nervo ottico rivolto verso l'alto.
    2. Sigillare il segmento posteriore utilizzando l'O-ring in resina epossidica con quattro viti, garantendo una tenuta ermetica.
    3. Inserire il tubo nelle porte IN e OUT della camera IOP (inferiore). La siringa di afflusso IOP con il mezzo contenente tubi viene inserita nella porta IN e la siringa di deflusso IOP vuota con tubo viene inserita nella porta OUT.
    4. Utilizzare il metodo push/pull per infondere lentamente il mezzo di perfusione nella porta di afflusso per riempire la oculare posteriore e contemporaneamente estrarre lentamente il mezzo di perfusione attraverso la siringa di deflusso per rimuovere eventuali bolle d'aria dalle linee. Interrompere l'infusione del mezzo una volta che entrambi i tubi IN e OUT sono privi di bolle d'aria.
    5. Blocca i rubinetti in posizione off. Rimuovere la siringa da 30 mL dal gruppo filtro della porta IOP IN e ricaricarla con un totale di 30 mL di mezzo. Sostituire la siringa da 30 mL sul gruppo filtro.
  7. Configurazione della camera ICP (superiore)
    1. Posizionare la camera/coperchio ICP (superiore) sul retro del segmento posteriore. Assicurarsi che il nervo ottico si trovi all'interno della camera superiore. Sigillare la camera superiore con quattro viti.
    2. Inserire il tubo nelle porte IN e OUT della camera ICP (superiore). La siringa di afflusso ICP con supporto contenente tubi viene inserita nella porta IN e la siringa di deflusso ICP vuota con tubo viene inserita nella porta OUT.
    3. Infondere delicatamente e lentamente il mezzo nella porta IN per riempire la camera ICP e rimuovere le bolle d'aria dalle linee utilizzando il metodo push/pull. Interrompere l'infusione del mezzo una volta che la camera ICP e sia il tubo IN che OUT sono privi di bolle d'aria.
    4. Blocca i rubinetti in posizione off. Rimuovere la siringa da 30 mL dall'ICP nel gruppo filtro porta e ricaricarla con un totale di 30 mL di mezzo. Sostituire la siringa da 30 mL sul gruppo filtro.

5. Configurazione del sistema di registrazione dei dati

NOTA: il sistema di registrazione dei dati è composto da una fonte di alimentazione a 8 canali, un amplificatore a ponte multicanale, trasduttori di pressione idrostatici e un computer con software di acquisizione dati (vedere Tabella dei materiali). Di seguito viene descritto come impostare e calibrare il sistema.

  1. Collegare il cavo di alimentazione alla parte posteriore della fonte di alimentazione a 8 canali e collegarlo a un dispositivo di backup della batteria.
  2. Collegare il cavo USB dalla fonte di alimentazione a 8 canali sul retro del computer.
  3. Collegare la fonte di alimentazione a 8 canali all'amplificatore a ponte multicanale utilizzando il cavo I2C in dotazione.
  4. Collegare i cavi Bayonet Neill-Concelman (BNC) agli ingressi del canale di fronte alla fonte di alimentazione a 8 canali e l'estremità dei cavi ai canali corrispondenti nella parte posteriore dell'amplificatore multicanale.
  5. Collegare i cavi del trasduttore alla parte anteriore dell'amplificatore multicanale.
  6. Installare il software di acquisizione dati sul computer.
    1. Eseguire il programma di installazione del software di acquisizione dati dal CD del software in dotazione.
    2. Seguire le istruzioni visualizzate sullo schermo del computer.
    3. Al termine dell'installazione, selezionare Fine.
  7. Accendere la fonte di alimentazione a 8 canali.
  8. Accendere il computer e avviare il software di acquisizione dati.
    1. Seleziona file | Nuovo.
    2. Seleziona | di installazione Impostazioni canale. Seleziona tre canali (in basso a sinistra dello schermo). Nella colonna Titolo canale rinominare i canali come segue: CH1 ICP; CH2 IOP; CH3 TLPG (IOP-ICP).
    3. Selezionare 2 mV per l'intervallo su tutti i canali. Nella colonna Calcolo selezionare Nessun calcolo per i canali 1 e 2.
    4. Nella colonna Calcolo selezionare Aritmetica per il canale 3. Nella sezione Formula : Selezionare canali/CH2; Selezionare l'aritmetica "-"; Selezionare canali/CH1. Nella sezione Output selezionare mmHg. Selezionare OK. Selezionare di nuovo OK .
  9. Impostare e calibrare i trasduttori di pressione idrostatici.
    NOTA: i trasduttori di pressione idrostatici devono essere calibrati prima degli esperimenti utilizzando il seguente metodo.
    1. Collegare i trasduttori di pressione idrostatici alle linee dei trasduttori collegati all'amplificatore a ponte multicanale.
    2. Collegare una siringa da 30 mL riempita d'aria alla porta laterale del trasduttore di pressione CH1 (ICP). Collegare lo sfigmomanometro alla parte inferiore del trasduttore di pressione CH1 (ICP).
    3. Nel grafico, visualizzare la pagina del software di acquisizione dati, impostare la velocità di campionamento facendo clic con il pulsante sinistro del mouse sulla freccia accanto al tempo di campionamento e selezionare 100. Quindi fare clic con il pulsante destro del mouse nell'area CH1 (ICP) della pagina.
    4. Selezionare Bridge Amp. Selezionare Filtro di rete. Selezionare Zero e attendere che il sistema si azzeri, facendo attenzione a non muovere il trasduttore di pressione.
    5. Pizzicare le linguette bianche del trasduttore di pressione e spingere l'aria attraverso il trasduttore fino a ottenere 40 mmHg sullo sfigmomanometro. Rilasciare le linguette bianche e rimuovere la siringa e lo sfigmomanometro.
    6. Nella pagina Conversione unità , seleziona il segno "meno (-)". Evidenziare il plateau più alto per indicare 40 mmHg. Fate clic sulla freccia per il punto 1 e immettete 40.
    7. Evidenziare il plateau più basso per indicare 0 mmHg. Fate clic sulla freccia per il punto 2 e immettete 0. Selezionare mmHg per le unità. Selezionare OK.
    8. Selezionare OK (pagina Bridge Amp). Ripetere i passaggi 9,1-9,7 per CH2 (IOP) utilizzando 100 mmHg per il plateau più alto e 0 per il plateau più basso.
  10. Collegare l'unità TAS/segmento posteriore al sistema di acquisizione dati.
    1. Posizionare l'unità TAS/segmento posteriore in un incubatore (37 °C, 5% CO2). Collegare il tubo ICP dalla porta OUT al trasduttore di pressione CH1 (ICP).
    2. Collegare il tubo IOP dalla porta OUT al trasduttore di pressione CH2 (IOP).
    3. Collegare le configurazioni della siringa (ICP e IOP) con il supporto dalle porte IN al supporto dell'anello.
    4. Nella pagina Visualizzazione grafico selezionare Avvia campionamento. Imposta la velocità di campionamento facendo clic con il pulsante sinistro del mouse sulla freccia accanto al tempo di campionamento e seleziona Lento e 1 minuto.
    5. Regolare le siringhe sull'anello in piedi verso l'alto o verso il basso per regolare le pressioni ICP e IOP in base ai requisiti del protocollo.
    6. Eseguire il rifornimento sistemico del mezzo nel sistema ogni 48-72 ore attraverso il metodo push and pull.

6. Recupero e analisi dei dati

  1. Aprire il file di dati nel software di acquisizione dati.
  2. Nella sezione Data Pad , fare clic sull'icona Aggiungi più a Data Pad . Apparirà una nuova finestra.
    1. Nella sezione Trova utilizzando selezionare Ora dal menu a discesa.
    2. Nella sezione Seleziona selezionare 1 ora ogni 1 ora dai menu a discesa.
    3. Nella sezione Passaggio selezionare Intero file, quindi fare clic su Aggiungi.
  3. Nella sezione Data Pad fare clic sull'icona Data Pad View . Evidenzia tutti i dati e copia/incolla in un foglio di calcolo.
  4. Calcola le deviazioni medie e standard per IOP, ICP e TLPG per ogni 24 ore. Raccogli i dati utilizzando l'opzione tabella pivot in un programma e grafico per fogli di calcolo.

7. Immunoistochimica e colorazione di ematossilina ed eosina dei segmenti posteriori

  1. Rimuovere i segmenti oculari posteriori seguendo vari punti temporali dal modello TAS e fissarli in formalina prima della paraffinazione.
  2. Sezionare gli occhi per produrre piani di tessuto sagittale.
  3. Deparaffinizzare i segmenti incorporati in paraffina con una soluzione di etanolo al 100%, etanolo al 95%, etanolo al 50%.
  4. Lavare le diapositive con PBS per 10 minuti e bloccare con un tampone di blocco a temperatura ambiente per 1 ora.
  5. Etichette di sezioni con anticorpi primari: anti-collagene IV (marcatore Extracellular Matrix (ECM), NB120-6586, 1:100) e anti-laminina (marcatore ECM, NB300-144, 1:100, anti-RBPMS (marcatore RGC), GTX118619, 1:50).
  6. Rileva gli anticorpi primari utilizzando gli anticorpi secondari Alexa Fluor (Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit, A11008, 1:500).
  7. Controbattere i nuclei cellulari usando la soluzione anti-dissolvenza DAPI.
  8. Cattura le immagini delle sezioni colorate e delle immagini di fase con lenti obiettivo 4x e 10x usando un microscopio a fluorescenza (vedi Tabella dei materiali).
  9. Per la colorazione di ematossilina ed eosina (H & E), elaborare le sezioni in un sistema di colorazione automatizzato (vedere Tabella dei materiali) per la deparaffinazione utilizzando una soluzione di etanolo al 100%, xilene 95%, etanolo al 50% e colorazione con H & E.
  10. Cattura immagini con le lenti obiettivo 4x e 10x utilizzando un microscopio con una sorgente luminosa a campo luminoso.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Progettazione e realizzazione del sistema autonomo translaminare
Il differenziale di pressione translaminare è un potenziale meccanismo chiave nella patogenesi di varie malattie, incluso il glaucoma. Gli usi per il modello descritto includono, ma non sono limitati a, lo studio del glaucoma (IOP elevata, forse ICP diminuita), lesioni cerebrali traumatiche (ICP elevato) ed esposizione a lungo termine alla compromissione visiva associata alla microgravità (ICP elevato, IOP elevato). Per aiutare a scoprir...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I tessuti umani post mortem sono una risorsa particolarmente preziosa per lo studio delle malattie neurodegenerative umane, poiché l'identificazione di potenziali farmaci sviluppati in modelli animali deve essere traducibile per l'uomo47. Gli effetti dell'elevazione della IOP umana sono ben consolidati, ma sono state condotte ricerche minime su variazioni anomale della pressione translaminare dell'ONH. Anche se esistono più modelli animali e modelli finiti di ONH umano, non esiste un modello umano...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori del manoscritto non hanno potenziali conflitti di interesse da rivelare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il finanziamento per questo progetto è stato attraverso fondi discrezionali della dott.ssa Colleen M. McDowell. Questo lavoro è stato supportato in parte da una sovvenzione illimitata da Research to Prevent Blindness, Inc. al Dipartimento di Oftalmologia e Scienze Visive di UW Madison. Ringraziamo i dottori Abbot F. Clark e Weiming Mao per la loro assistenza tecnica con il modello di coltura degli organi a perfusione. Ringraziamo il Lions Eye Institute for Transplant and Research (Tampa, FL) per aver fornito gli occhi dei donatori umani.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
#122, 1-1/8" interno x 1-5/16" diametro esterno, Viton O-Ring, 3/32" di spessore,
755 durometro 50 Confezione		B07DRGPPZJ
114 Buna-N O-Ring, durometro 70A, nero, 5/8" ID, 13/16" OD, 3/32" di larghezza (confezione da 100)AmazonB000FMYRHK
Siringhe da 30 ml senza agoVitality Medical302832
Rubinetto a 3 vie, 2 luer lock femmina, luer lock maschio girevole, tappo ventilatoQOSINA2C6201
4-40 X 1/2 PH PAN MS SS/CHROME e cacciavite Phillips di dimensioni adeguateElementi di fissaggio in acciaio inossidabile BrikksenPPMSSSCH4C,5 
ANPROLENE 16 LARGE AMPULEFisher ScientificNC9085343 
BetadinePurduePUR1815001EACH 
Corning 100 x 20mm piastre di coltura trattate con coltura tissutaleSigma-AldrichCLS430167-100EAstrong> 
Corning  Soluzione di L-glutamminaFisherScientific MT25005CI
Covidien 3033 Spugna di garza Curity, 4" x 4", 12 strati, sterile, 1200/CSMed Plus Medical SupplyCOV-3033-CS
Pinze per medicazione Curvi delicati (seghettati)KatenaK5-4010
Dumont #5 - Pinze finiFST11254-20
Forbici per gli occhi Katena curva standardK4-7410
Falcon 150 x 15 mm Piastre di Petri monouso sterili sempliciCapitol Scientific351058
Fisherbrand 4 oz. Contenitori per campioniFisher Scientific16-320-730
Fisherbrand Buste per sterilizzazione a tenuta istantaneaFisher Scientific01-812-54
Fisherbrand Buste per sterilizzazione a chiusura istantaneaFisher Scientific01-812-55
Fisherbrand Buste per sterilizzazione a chiusura istantaneaFisher Scientific01-812-58
HyClone Dulbecco's Modified Eagles MediumFisher ScientificSH3024302
HyClone Penicillina Streptomycin 100X SolutionFisher ScientificSV30010
Filtro idrofilo con ingresso Luer Lock femmina, uscita Luer Slip maschio, trasduttoriQosina28217
, DELTRAN ® II, Catalogo # DPT-200 con una portata di 3CC/HRAD instrumentsDPT-200
JG15-0.5HPX 15 Gauge 0.5" NT Premium Series Dispensing Tip 50/BoxJenson GlobalJG15-0.5HPX 15
Keyence B2? Microscopio X710KeyenceB2-X710
LabChart 8Strumenti ADLabChart 8
Leica ST5020 Multi-stainerLeicaST5020
Tappo Luer Lock universale non ventilato, biancoQOSINA65811
Amplificatore a ponte ottale (Modello # FE228)Strumenti ADFE228
Prodotti Pharmco ALCOOL ETILICO, 200 PROVAFisher ScientificNC1675398
Soluzione tamponata con fosfato (PBS)Sigma-AldrichD8537-500ML
PowerLab 8/35 (Modello # PL3508)AD instrumentsPL3508
ProLong Gold Antifade Mountant con DAPIThermoFisherP36935
Raccordo per tubo push-to-connect per aria e acqua  Adattatore diritto, 1/8" Tubo OD x 1/8 NPT maschioMcMAster-Carr7880T113
Raccordo per tubo Push-to-Connect con filettatura universale  per aria e acqua, adattatore, tubo da 1/8" OD x tubo da 1/8McMAster-Carr51235K101
Tubo flessibile Saint-Gobain Tygon S3 E-3603 500 ft.Fisher Scientific14-171-268
Superblock T20Fisher ScientificPI37536
Forbici chirurgiche - Sharp-BluntF.S.T.14001-14
Pinze per tessuti Delicato 1x2 denti CurvoKatenaK5-4110
Sistema autonomo translaminare (TAS)University of North Texas Health Science CenterN/A
USA Misura 030 O-ring Buna-N, B1000, 70 Durometro, Nero, Buna-N
(NBR, Nitrile, Buna)		Marco Rubber & Materie plasticheB1000-030
Amazon < di pressione idrostatici blu e trasparente

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. The British Journal of Ophthalmology. 96 (5), 614-618 (2012).
  2. Bastawrous, A., et al. Posterior segment eye disease in sub-Saharan Africa: review of recent population-based studies. Tropical Medicine & International Health. 19 (5), 600-609 (2014).
  3. Morgan, J. E. Circulation and axonal transport in the optic nerve. Eye. 18 (11), 1089-1095 (2004).
  4. Burgoyne, C. F. A biomechanical paradigm for axonal insult within the optic nerve head in aging and glaucoma. Experimental Eye Research. 93 (2), 120-132 (2011).
  5. Quigley, H. A., Addicks, E. M. Chronic experimental glaucoma in primates. II. Effect of extended intraocular pressure elevation on optic nerve head and axonal transport. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 19 (2), 137-152 (1980).
  6. Quigley, H. A., Addicks, E. M., Green, W. R., Maumenee, A. E. Optic nerve damage in human glaucoma. II. The site of injury and susceptibility to damage. Archives of Ophthalmology. 99 (4), 635-649 (1981).
  7. Howell, G. R., et al. Axons of retinal ganglion cells are insulted in the optic nerve early in DBA/2J glaucoma. The Journal of Cell Biology. 179 (7), 1523-1537 (2007).
  8. Johnson, E. C., Jia, L., Cepurna, W. O., Doser, T. A., Morrison, J. C. Global changes in optic nerve head gene expression after exposure to elevated intraocular pressure in a rat glaucoma model. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 48 (7), 3161-3177 (2007).
  9. Howell, G. R., et al. Molecular clustering identifies complement and endothelin induction as early events in a mouse model of glaucoma. Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1429-1444 (2011).
  10. Qu, J., Jakobs, T. C. The Time Course of Gene Expression during Reactive Gliosis in the Optic Nerve. PloS one. 8 (6), 67094(2013).
  11. Berdahl, J. P., Fautsch, M. P., Stinnett, S. S., Allingham, R. R. Intracranial pressure in primary open angle glaucoma, normal tension glaucoma, and ocular hypertension: a case-control study. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 49 (12), 5412-5418 (2008).
  12. Berdahl, J. P., Allingham, R. R. Intracranial pressure and glaucoma. Current Opinion in Ophthalmology. 21 (2), 106-111 (2010).
  13. Morgan, W. H., et al. The correlation between cerebrospinal fluid pressure and retrolaminar tissue pressure. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 39 (8), 1419-1428 (1998).
  14. Leske, M. C., Connell, A. M., Wu, S. Y., Hyman, L. G., Schachat, A. P. Risk factors for open-angle glaucoma. The Barbados Eye Study. Archives of Ophthalmology. 113 (7), 918-924 (1995).
  15. Quigley, H. A., Green, W. R. The histology of human glaucoma cupping and optic nerve damage: clinicopathologic correlation in 21 eyes. Ophthalmology. 86 (10), 1803-1830 (1979).
  16. Burgoyne, C. F., Downs, J. C., Bellezza, A. J., Hart, R. T. Three-dimensional reconstruction of normal and early glaucoma monkey optic nerve head connective tissues. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 45 (12), 4388-4399 (2004).
  17. Diekmann, H., Fischer, D. Glaucoma and optic nerve repair. Cell and Tissue Research. 353 (2), 327-337 (2013).
  18. Nickells, R. W., Howell, G. R., Soto, I., John, S. W. Under pressure: cellular and molecular responses during glaucoma, a common neurodegeneration with axonopathy. Annual Review of Neuroscience. 35, 153-179 (2012).
  19. Burgoyne, C. F., Downs, J. C. Premise and prediction-how optic nerve head biomechanics underlies the susceptibility and clinical behavior of the aged optic nerve head. Journal of Glaucoma. 17 (4), 318-328 (2008).
  20. Sigal, I. A., Ethier, C. R. Biomechanics of the optic nerve head. Experimental Eye Research. 88 (4), 799-807 (2009).
  21. Sigal, I. A., Flanagan, J. G., Tertinegg, I., Ethier, C. R. Modeling individual-specific human optic nerve head biomechanics. Part I: IOP-induced deformations and influence of geometry. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 8 (2), 85-98 (2009).
  22. Morgan, J. E., Jeffery, G., Foss, A. J. Axon deviation in the human lamina cribrosa. The British Journal of Ophthalmology. 82 (6), 680-683 (1998).
  23. Danias, J., et al. Quantitative analysis of retinal ganglion cell (RGC) loss in aging DBA/2NNia glaucomatous mice: comparison with RGC loss in aging C57/BL6 mice. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 44 (12), 5151-5162 (2003).
  24. Berdahl, J. P., Allingham, R. R., Johnson, D. H. Cerebrospinal fluid pressure is decreased in primary open-angle glaucoma. Ophthalmology. 115 (5), 763-768 (2008).
  25. Fleischman, D., Allingham, R. R. The role of cerebrospinal fluid pressure in glaucoma and other ophthalmic diseases: A review. Saudi Journal of Ophthalmology. 27 (2), 97-106 (2013).
  26. Morgan, W. H., et al. Optic disc movement with variations in intraocular and cerebrospinal fluid pressure. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 43 (10), 3236-3242 (2002).
  27. Feola, A. J., et al. Deformation of the Lamina Cribrosa and Optic Nerve Due to Changes in Cerebrospinal Fluid Pressure. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (4), 2070-2078 (2017).
  28. Koeberle, P. D., Bahr, M. Growth and guidance cues for regenerating axons: where have they gone. Journal of Neurobiology. 59 (1), 162-180 (2004).
  29. Kermer, P., Klocker, N., Bahr, M. Neuronal death after brain injury. Models, mechanisms, and therapeutic strategies in vivo. Cell and Tissue Research. 298 (3), 383-395 (1999).
  30. Koeberle, P. D., Gauldie, J., Ball, A. K. Effects of adenoviral-mediated gene transfer of interleukin-10, interleukin-4, and transforming growth factor-beta on the survival of axotomized retinal ganglion cells. Neuroscience. 125 (4), 903-920 (2004).
  31. Kipnis, J., et al. Neuronal survival after CNS insult is determined by a genetically encoded autoimmune response. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 21 (13), 4564-4571 (2001).
  32. Isenmann, S., Wahl, C., Krajewski, S., Reed, J. C., Bahr, M. Up-regulation of Bax protein in degenerating retinal ganglion cells precedes apoptotic cell death after optic nerve lesion in the rat. The European Journal of Neuroscience. 9 (8), 1763-1772 (1997).
  33. Kermer, P., et al. Caspase-9: involvement in secondary death of axotomized rat retinal ganglion cells in vivo. Brain research. Molecular Brain Research. 85 (1-2), 144-150 (2000).
  34. Kermer, P., Klocker, N., Labes, M., Bahr, M. Inhibition of CPP32-like proteases rescues axotomized retinal ganglion cells from secondary cell death in vivo. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 18 (12), 4656-4662 (1998).
  35. Kikuchi, M., Tenneti, L., Lipton, S. A. Role of p38 mitogen-activated protein kinase in axotomy-induced apoptosis of rat retinal ganglion cells. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 20 (13), 5037-5044 (2000).
  36. Barron, K. D., Dentinger, M. P., Krohel, G., Easton, S. K., Mankes, R. Qualitative and quantitative ultrastructural observations on retinal ganglion cell layer of rat after intraorbital optic nerve crush. Journal of Neurocytology. 15 (3), 345-362 (1986).
  37. Misantone, L. J., Gershenbaum, M., Murray, M. Viability of retinal ganglion cells after optic nerve crush in adult rats. Journal of Neurocytology. 13 (3), 449-465 (1984).
  38. Bahr, M. Live or let die - retinal ganglion cell death and survival during development and in the lesioned adult CNS. Trends in Neurosciences. 23 (10), 483-490 (2000).
  39. Klocker, N., Zerfowski, M., Gellrich, N. C., Bahr, M. Morphological and functional analysis of an incomplete CNS fiber tract lesion: graded crush of the rat optic nerve. Journal of Neuroscience Methods. 110 (12), 147-153 (2001).
  40. Del Amo, E. M., et al. Pharmacokinetic aspects of retinal drug delivery. Progress in Retinal and Eye Research. 57, 134-185 (2017).
  41. Rousou, C., et al. A technical protocol for an experimental ex vivo model using arterially perfused porcine eyes. Experimental Eye Research. 181, 171-177 (2019).
  42. Vézina, M. Assessing Ocular Toxicology in Laboratory Animals. , Humana Press. 1-21 (2012).
  43. de Boo, J., Hendriksen, C. Reduction strategies in animal research: a review of scientific approaches at the intra-experimental, supra-experimental and extra-experimental levels. Alternatives to Laboratory Animals. 33 (4), 369-377 (2005).
  44. Kirk, R. G. W. Recovering The Principles of Humane Experimental Technique: The 3Rs and the Human Essence of Animal Research. Science, Technology, & Human Values. 43 (4), 622-648 (2018).
  45. Burden, N., Chapman, K., Sewell, F., Robinson, V. Pioneering better science through the 3Rs: an introduction to the national centre for the replacement, refinement, and reduction of animals in research (NC3Rs). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (2), 198-208 (2015).
  46. Singh, J. The national centre for the replacement, refinement, and reduction of animals in research. Journal of Pharmacology and Pharmacotherapeutics. 3 (1), 87-89 (2012).
  47. White, K., et al. Effect of Postmortem Interval and Years in Storage on RNA Quality of Tissue at a Repository of the NIH NeuroBioBank. Biopreservation and Biobanking. 16 (2), 148-157 (2018).
  48. Ervin, J. F., et al. Postmortem delay has minimal effect on brain RNA integrity. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 66 (12), 1093-1099 (2007).
  49. Heinrich, M., Matt, K., Lutz-Bonengel, S., Schmidt, U. Successful RNA extraction from various human postmortem tissues. International Journal of Legal Medicine. 121 (2), 136-142 (2007).
  50. Johnson, D. H., Tschumper, R. C. Human trabecular meshwork organ culture. A new method. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 28 (6), 945-953 (1987).
  51. Gottanka, J., Chan, D., Eichhorn, M., Lutjen-Drecoll, E., Ethier, C. R. Effects of TGF-beta2 in perfused human eyes. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 45 (1), 153-158 (2004).
  52. Pang, I. H., McCartney, M. D., Steely, H. T., Clark, A. F. Human ocular perfusion organ culture: a versatile ex vivo model for glaucoma research. Journal of Glaucoma. 9 (6), 468-479 (2000).
  53. Aryee, M. J., Gutierrez-Pabello, J. A., Kramnik, I., Maiti, T., Quackenbush, J. An improved empirical bayes approach to estimating differential gene expression in microarray time-course data: BETR (Bayesian Estimation of Temporal Regulation). BMC Bioinformatics. 10, 409(2009).
  54. Feola, A. J., et al. Finite Element Modeling of Factors Influencing Optic Nerve Head Deformation Due to Intracranial Pressure. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 57 (4), 1901-1911 (2016).
  55. Downs, J. C. Optic nerve head biomechanics in aging and disease. Experimental Eye Research. 133, 19-29 (2015).
  56. Downs, J. C., Roberts, M. D., Burgoyne, C. F. Mechanical environment of the optic nerve head in glaucoma. Optometry and Vision Science. 85 (6), 425-435 (2008).
  57. Downs, J. C., et al. Viscoelastic characterization of peripapillary sclera: material properties by quadrant in rabbit and monkey eyes. Journal of Biomechanical Engineering. 125 (1), 124-131 (2003).
  58. Wagner, A. H., et al. Exon-level expression profiling of ocular tissues. Experimental Eye Research. 111, 105-111 (2013).
  59. Pels, E., Beele, H., Claerhout, I. Eye bank issues: II. Preservation techniques: warm versus cold storage. International Ophthalmology. 28 (3), 155-163 (2008).
  60. Reinhard, K., et al. Hypothermia Promotes Survival of Ischemic Retinal Ganglion Cells. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 57 (2), 658-663 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Translamanar Autonomous SystemIntraocular Pressure RegulationIntracranial Pressure ControlHuman Posterior SegmentOptic Nerve HeadPressure Gradient ModelingEx Vivo Ocular ModelHydrostatic Pressure TransducersPerfusion Fluid SetupData Acquisition System

Related Articles