Terahertz Imaging and Characterization Protocol for Freshly Excised Breast Cancer Tumors

L'imaging e la spettroscopia Terahertz (THz) sono state un'area di ricerca in rapida crescita nell'ultimo decennio. Il continuo sviluppo di emettitori THz più efficienti e coerenti nell'intervallo di 0,1-4 THz ha fatto crescere significativamente le loro applicazioni¹. Un'area in cui THz ha mostrato promesse e una crescita significativa è il campo biomedico². La radiazione THz ha dimostrato di non essere non ionizing e biologicamente sicura ai livelli di potenza generalmente utilizzati per analizzare i tessuti fissi³. Di conseguenza, l'imaging e la spettroscopia THz sono stati utilizzati per classificare e differenziare varie caratteristiche dei tessuti come il contenuto di acqua per indicare danni da ustione e guarigione⁴, cirrosi epatica⁵e cancro nei tessuti ascisi^6,7. La valutazione del cancro copre in particolare una vasta gamma di potenziali applicazioni cliniche e chirurgiche, ed è stata studiata per i tumori del cervello⁸, fegato⁹, ovaie¹⁰, tratto gastrointestinale¹¹, e seno^{7,12,13,14,15,16,17,18,19}.

Le applicazioni THz per il cancro al seno si concentrano principalmente sul supporto della chirurgia conservativa del seno, o lumpectomia, tramite la valutazione del margine. L'obiettivo di una lumpectomia è quello di rimuovere il tumore e un piccolo strato di tessuto sano circostante, in contrasto con la mastectomia completa, che rimuove l'intero seno. Il margine chirurgico del tessuto asciso viene quindi valutato tramite patologia una volta che il campione è stato fissato in formalina, sezionato, incorporato in paraffina, e montato in 4 fette di m-5 su vetrini al microscopio. Questo processo può richiedere molto tempo e richiede una procedura chirurgica secondaria in un secondo momento se si osserva un margine positivo²⁰. Le attuali linee guida dell'American Society of Radiation Oncology definiscono questo margine positivo come avere cellule tumorali che contattano l'inchiostro margine a livello superficiale²¹. L'imaging THz per tessuto idratato ad alto assorbimento è principalmente limitato all'imaging superficiale con una penetrazione variabile in base al tipo di tessuto, che è sufficiente per soddisfare le esigenze chirurgiche di valutazione rapida del margine. Una rapida analisi delle condizioni di margine durante l'impostazione chirurgica ridurrebbe notevolmente i costi chirurgici e il tasso di procedura di follow-up. Ad oggi, THz si è dimostrato efficace nel differenziare tra il cancro e il tessuto sano nei tessuti fissati in formalina, incorporati in paraffina (FFPE), ma sono necessarie ulteriori indagini per fornire un rilevamento affidabile del cancro nei tessuti appena assordati⁷.

Questo protocollo descrive in dettaglio i passaggi per l'esecuzione di imaging THz e spettroscopia su campioni di tessuto umano appena eccitati ottenuti da una biobanca. Le applicazioni THz basate su tessuti di cancro al seno umano appena eccitati sono stati raramente utilizzati nella ricerca pubblicata^7,18,22,23, soprattutto da gruppi di ricerca non integrati con un ospedale. L'uso di tessuti appena eccitati è altrettanto raro per altre applicazioni tumorali, con la maggior parte degli esempi di cancro umano non-seno essere segnalati per il cancro colonico^24,25. Uno dei motivi è che i blocchi di tessuto FFPE sono molto più facili da raggiungere e gestire rispetto al tessuto appena assornato a meno che il sistema THz utilizzato per lo studio non faccia parte del flusso di lavoro chirurgico. Allo stesso modo, la maggior parte dei sistemi THz di laboratorio commerciale non sono preparati per gestire i tessuti freschi, e quelli che lo fanno sono ancora nelle fasi di utilizzo della crescita della linea cellulare o hanno solo iniziato a guardare il tessuto ascisato da modelli animali. Per applicare tHz a un'impostazione intraoperatoria è necessario sviluppare in anticipo le fasi di imaging e caratterizzazione per i tessuti freschi in modo che l'analisi non interferisca con la capacità di eseguire patologie standard. Per le applicazioni che non sono intrinsecamente destinate ad essere intraoperatorie, la caratterizzazione del tessuto fresco è ancora un passo impegnativo che deve essere affrontato per lavorare verso applicazioni in vivo e differenziazione.

L'obiettivo di questo lavoro è quello di fornire una linea guida per l'applicazione THz per i tessuti appena asbici utilizzando un sistema THz commerciale. Il protocollo è stato sviluppato su un sistema di imaging e spettroscopia THz²⁶ per tumori del cancro al seno murini^13,17,19 ed è stato esteso al tessuto chirurgico umano ottenuto dalle biobanche^7,18. Mentre il protocollo è stato generato per il cancro al seno, gli stessi concetti possono essere applicati a sistemi di imaging THz simili e ad altri tipi di tumori del tumore solido che vengono trattati con chirurgia dove il successo dipende dalla valutazione del margine²⁷. A causa di una quantità piuttosto piccola di risultati THz pubblicati sui tessuti appena eccitati, questo è il primo lavoro alle conoscenze degli autori per concentrarsi sul protocollo di movimentazione dei tessuti freschi per l'imaging e la caratterizzazione THz.

Questo protocollo segue tutti i requisiti stabiliti dal dipartimento per la salute e la sicurezza ambientale dell'Università dell'Arkansas.

1. Impostare l'area di movimentazione dei tessuti

1. Prendere un vassoio metallico in acciaio inossidabile e coprirlo con il sacchetto di rischio biologico come mostrato nella Figura 1. Qualsiasi manipolazione dei tessuti biologici verrà eseguita all'interno dell'area del vassoio (ad esempio, l'area di movimentazione dei tessuti).
2. Preparare pinzette da laboratorio, salviette tissutali, asciugamani di carta, pacchetto di carta filtrante, bottiglie di tintura di tessuto, bottiglia di candeggina e bottiglia di etanolo intorno al vassoio per un facile accesso quando necessario. Mantenere i tessuti usati, le salviette e i guanti sulla superficie del materiale di pericolo biologico da smaltire alla fine del protocollo.
3. Riempire un tubo di centrifugatura da 50 mL con fino a 45 mL di formalina tampone neutra del 10% e inserirla nel vassoio di stoccaggio della centrifuga vicino al vassoio di movimentazione dei tessuti.

Figura 1: Configurazione dell'area di movimentazione dei tessuti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Gestione del tumore al cancro al seno fresco per la spettroscopia di trasmissione THz

ATTENZIONE: Prima di maneggiare qualsiasi tessuti vivi, indossare guanti nitrile mano, occhiali di protezione degli occhi, una maschera per il viso, e un cappotto da laboratorio. Utilizzare sempre pinzette da laboratorio per maneggiare i tessuti ed evitare di toccarli direttamente con le mani. Tutto il lavoro con tessuto fresco al di fuori di un contenitore sigillato o la fase di scansione devono essere condotti nell'area di movimentazione dei tessuti stabilita al punto 1.1.

NOT: Tutti i tessuti trattati in questo lavoro sono stati spediti nel mezzo di Dulbecco Modified Eagle (DMEM) e nella soluzione antibiotica della biobanca.

1. Rimuovere il tumore sfuso dalla soluzione DMEM e metterlo in un piatto Petri sulla zona di movimentazione dei tessuti (vedere Figura 2A).
2. Dall'ispezione lorda, identificare le regioni tumorali distinte da cui tagliare piccoli pezzi per la caratterizzazione della trasmissione. Tagliare un segmento di tumore spesso 0,5 mm dai punti identificati utilizzando una lama a basso profilo in acciaio inossidabile, come mostrato nella Figura 2B. Posizionare questa sezione tagliata tra due finestre di quarzo con un distanziale di 0,1 mm di spessore in un supporto di campione liquido, come illustrato nella Figura 2C.

Figura 2: Sezionamento del tumore per le misurazioni della spettroscopia di trasmissione THz. (A) Fotografia del tumore alla rinfusa. (B) Fotografia delle piccole sezioni (0,5 mm) del tumore tagliato dal tumore alla rinfusa. (C) La sezione tumorale tagliata nel supporto del campione liquido tra le due finestre al quarzo con un distanziale in politetrafluoroetilene da 0,1 mm per la misurazione della spettroscopia. Figura ripubblicata da T. Bowman et^{al. 18} con il permesso dello SPIE. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Misurazioni spettroscopia di trasmissione THz

1. Impostare il modulo di spettroscopia di trasmissione all'interno della camera di base THz allineando le maniglie del modulo sui pali di montaggio nel sistema principale e facendo scorrere la fase verso il basso nel sistema. Stringere le due viti di montaggio negli angoli superiore destro e inferiore sinistro del modulo, come illustrato nella Figura 3A.
2. Svuotare il sistema con gas di azoto secco a 5 L/min (LPM) durante l'intera procedura di spettroscopia per rimuovere il vapore acqueo dallo spazio campione.
3. Aprire il software di misurazione della spettroscopia di trasmissione THz dal desktop collegato al sistema THz. Si aprirà la finestra principale.
4. Fare clic sulla scheda Scansione nella parte superiore della finestra. Verrà visualizzata una finestra Spectra Scan Setup (Imposta scansione Spectra). Dal menu a discesa della scheda Modalità di misurazione in alto a destra nella finestra, selezionare Trasmissione per impostare la spettroscopia di trasmissione. Se il picco non è visibile automaticamente, selezionare l'opzione Abilita nella scheda Ricerca di picco manuale e passare manualmente il ritardo ottico per visualizzare il picco.
5. Dopo 30 min di spurgo, registrare un segnale di riferimento aereo seguendo i passaggi riportati di seguito.
   1. Nella scheda Impostazioni scansione della finestra di configurazione della scansione degli spetti, immettere un Nome appropriato per il file di riferimento, impostare Num Scans su 1.800 e impostare Ritardo avvio (s) su 0. Lasciare le altre impostazioni come valori predefiniti.
   2. Fare clic su Misura riferimento nella finestra di configurazione della scansione per eseguire la misurazione del riferimento dell'aria. Quindi fare clic su Misura campione per misurare il segnale di trasmissione attraverso l'aria come una media campione di 1.800 segnali su 1 min.

Figura 3: impostazione del modulo di spettroscopia di trasmissione THz. (A) Camera di base THz con il modulo di trasmissione montato su di esso. (B) Una fotografia del supporto del campione liquido. (C) Il supporto del campione posto all'interno della camera centrale per le misurazioni. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

6. Misurare le due finestre di quarzo nel supporto del campione liquido, come illustrato nella figura 3B.
   1. Posizionare le due finestre di quarzo nel supporto del campione liquido senza un distanziale in mezzo.
   2. Aprire la camera di base THz. Montare il supporto del campione liquido sul modulo di spettroscopia di trasmissione, come illustrato nella figura 3C. Chiudi la camera.
   3. Fare clic sulla scheda Scansione nella finestra principale. Ripetere i passaggi da 3.5.1– 3.5.2 per il campione di quarzo, ma aggiornare ritardo di avvio (s) a 900. Ciò consente di eliminare qualsiasi vapore acqueo prima della misurazione.
   4. Se il quarzo è desiderato come riferimento per ulteriori campioni, fare clic sulla scheda Cancella riferimento sotto impostazioni scansione. Questo cancella il riferimento dell'aria. Quindi fare clic sulla scheda Misura riferimento per registrare le misure al quarzo come nuovo riferimento.
7. Posizionare la sezione tumorale a fette tra le due finestre di quarzo all'interno del supporto del campione liquido e posizionare il supporto all'interno della camera per una misurazione della trasmissione a singolo punto del tessuto. Per registrare la misurazione, ripetere il passaggio 3.6.3.
8. Estrarre il supporto del campione liquido dalla camera quando le misurazioni sono state completate e portarlo nell'area designata per la movimentazione dei tessuti. Smontare il supporto del campione liquido, pulire la sezione tumorale dalle finestre di quarzo con le salviette dei tessuti e posizionare le salviette di tessuto usate nello stesso vassoio per smaltire nel sacchetto di rischio biologico insieme agli altri rifiuti di rischio biologico.
9. Ripetere i passaggi 2.2, 3.7 e 3.8 in base alle esigenze per caratterizzare ulteriori sezioni tumorali. Una volta completate le misurazioni, andare alla finestra principale e fare clic sulla scheda File per salvare i dati di misurazione. Chiudere la finestra del software.

4. Gestione del tumore al cancro al seno fresco per l'imaging della modalità Reflection THz

1. Rimuovere il campione di tumore fresco dalla soluzione DMEM e antibiotici e metterlo su un piatto Petri. Utilizzando l'ispezione lorda, selezionare un lato del tumore da immaginare che è sufficientemente piatto e ha poco sangue e pochi vasi sanguigni. Evitare di imaging tessuto con sangue o vasi sanguigni, se possibile.
2. Posizionare il tumore con il lato da immaginare sulla carta filtrante di grado 1 per asciugare il DMEM in eccesso e cancellare il tessuto di liquido o secrezioni dal tumore, come mostrato nella Figura 4A. Riposizionare il tumore sulla carta da filtro in un punto asciutto man mano che la carta si satura. Asciugare il tumore per 5 min.

Figura 4: Preparazione del campione di tumore fresco per l'imaging THz. (A) Tumore posto su carta da filtro per asciugare. ((B)Tumore posto sulla piastra di polistirolo sopra la finestra di imaging con tamponi per pulire i tessuti per assorbire i fluidi in eccesso. (C) Tumore visto dal basso per monitorare l'orientamento e controllare le bolle d'aria. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Smontare il modulo di spettroscopia di trasmissione e impostare la base del modulo di immagine di riflessione (RIM) sul sistema di base THz, come illustrato nella Figura 5A. Al momento dell'impostazione degli specchi, montare la fase di scansione RIM sopra la base dello specchio e avvitarla nel sistema di base (vedere La figura 5B).
4. Spurgo del sistema con gas di azoto secco a 5 LPM per 30 minuti prima della procedura di imaging per rimuovere il vapore acqueo dal vano campione. Dopo 30 min, ridurre la quantità di gas di azoto secco a 3 LPM per il resto del tempo il sistema è in uso.
5. Collocare una piastra di polistirolo di spessore di 1,2 mm sulla finestra di scansione di diametro di 37 mm. Centra la finestra di scansione insieme alla piastra di polistirolo sul palco del campione.

Figura 5: Configurazione del sistema per l'imaging riflesso. (A) Base speculare del modulo di imaging riflesso. (B) Fase di scansione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

NOT: Altri spessori e materiali per lamiere sono adatti per la fase 4.5, ma dovrebbero avere uno spessore uniforme ed essere di assorbimento sufficientemente basso da non ostacolare il segnale THz.

6. Aprire il software di misurazione dell'imaging riflesso THz dal desktop collegato al sistema THz. Apparirà una finestra che mostra diverse icone di finestra di dialogo per funzioni specifiche e due sottofinestre per i grafici di campo THz, (unità arbitrarie a.u.) rispetto al tempo e alla frequenza, rispettivamente.
7. Per impostare i parametri per l'impostazione RIM, fare clic sull'icona Della finestra di dialogo Parametro immagine nella parte superiore della finestra. Apparirà una finestra Parametri di Acquisizione Immagine. Selezionare RIM dal menu a discesa della scheda Modello per la configurazione dell'immagine riflesso. Premere OK e tornare alla finestra principale del software.
8. Nella finestra principale, fare clic sull'icona Scansione a virgola fissa. Questo attiverà le antenne THz per iniziare l'invio del segnale THz incidente e ricevere il segnale THz riflesso da un singolo punto sulla piastra di polistirolo.
9. Fare clic sull'icona Finestra di dialogo dello stage motore nella parte superiore della finestra principale. Si aprirà la finestra di controllo del motore. Regolare l'asse ottico del ritardo facendo clic sulle frecce di direzione avanti/indietro per centrare l'impulso riflesso dal polistirolo nella finestra principale.
   NOT: Dopo aver regolato l'asse di ritardo ottico, sulla finestra dovrebbero essere visualizzati due impulsi, come illustrato nella Figura 6:uno dall'interfaccia inferiore della piastra di polistirolo (riflessione primaria) e uno dall'interfaccia superiore della piastra di polistirolo (riflessione secondaria).
10. Finestra fuori la riflessione primaria dalla piastra di polistirolo e mantenere la riflessione secondaria nella finestra, che contribuirà ai riflessi dal tessuto durante la procedura di imaging. Questa operazione viene eseguita in due passaggi.
    1. Innanzitutto, fare clic sul pulsante Impostazioni DAQ nella parte superiore della finestra principale per aprire la finestra di dialogo Impostazioni DAQ. Modificare il valore di ritardo ottico da 5 V (predefinito) a 4 V.
    2. In secondo luogo, regolare la posizione verticale della fase di scansione con la scala micrometrica sulla fase di scansione fino a quando il minimo dell'impulso secondario è il più forte. Regolare il ritardo ottico dell'asse nella finestra di controllo del motore per posizionare il riflesso primario al di fuori dell'intervallo del segnale riflesso misurato.
       NOT: Per una piastra di polistirolo spessa 1,2 mm, la riflessione primaria viene finestrata quando il picco minimo di riflessione secondario è di circa -0,3 mm sull'asse di ritardo ottico della finestra del dominio temporale.

Figura 6: THz riflette dalle interfacce inferiore e superiore della piastra di polistirolo. (A) Incidente segnale THz da una piastra di polistirolo spessa 1,2 mm. (B) Misurato primario e secondario THz tempo dominio dal polistirolo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

11. Livellare la fase campione e registrare il segnale di riferimento.
    1. Selezionare due punti su ciascun asse (asse A e Asse B) che denotano le posizioni sulla piastra di polistirolo vicino al bordo della finestra campione. Ad esempio, per l'asse A che va da -15 mm–15 mm, i due punti di posizione possono essere -10 mm e 10 mm; e per l'asse B che va da -15 mm-15 mm, i due punti di posizione possono essere -10 mm e 10 mm.
    2. Fare clic sul pulsante Finestra di dialogo di controllo motore per aprire la finestra di controllo del motore. Riposizionare la finestra di controllo del motore e la finestra principale del software in modo che il segnale del dominio temporale sia visibile durante la regolazione delle posizioni del motore. Impostare sia l'asse A che l'asse B su 0 mm.
    3. Livellare l'asse A seguendo i seguenti passaggi. Ad esempio viene utilizzato un intervallo da -10 mm-10 mm.
    4. Nella finestra controllo motore, modificare il valore dell'asse A da 0 a -10 e premere INVIO. Lo stage si sposta alla posizione di -10 mm sull'asse A e si osserva uno spostamento nella posizione del segnale nella finestra principale.
    5. Utilizzare la scala del micrometro regolabile nella fase di scansione illustrata nella Figura 5B per spostare il picco minimo del segnale nella posizione impostata nel passaggio 4.10.2.
    6. Modificare il valore dell'asse A in 10 e premere Invio. Lo stage passerà ora dalla posizione di -10 mm alla posizione di 10 mm sull'asse A e si osserva di nuovo uno spostamento del segnale. Si noti la direzione e la distanza con cui il segnale si è spostato dalla posizione precedente e modificare nuovamente il valore dell'asse A in -10. Il segnale tornerà alla posizione impostata nel passaggio 4.11.5.
    7. Ruotare la vite di livellamento sull'asse A della fase di scansione, come illustrato nella Figura 5B e spostare il segnale per raddoppiare la distanza nella stessa direzione in cui si è spostato dalla posizione originale. Utilizzare il micrometro sulla fase di scansione per riportare il segnale nella posizione originale (-0,3 mm per 1,2 mm di polistirolo).
    8. Ripetere i passaggi da 4.11.6– 4.11.7 fino a quando il segnale a 10 e -10 è uguale e il picco per entrambe le posizioni è focalizzato sulla posizione originale (-0,3 mm sull'asse ottico).
12. Una volta raggiunto il livellamento dell'asse A, modificare il valore dell'asse A su 0 e ripetere la stessa procedura per l'asse B. Iniziare modificando il valore dell'asse B sulla finestra di controllo del motore da 0 al valore più positivo (ad esempio, 10 mm). Inoltre, durante il livellamento, utilizzare la vite di livellamento sull'asse B della fase di scansione, come illustrato nella Figura 5B.
13. Una volta che entrambi gli assi sono livellati, riportare sia l'asse A che l'asse B a 0 mm. Chiudere la finestra di controllo del motore e verificare che il segnale sia nella sua posizione originale nel caso in cui venga spostato un po '.
14. Registrare questo segnale come riferimento.
    1. Passare alla finestra Delle proprietà del gruppo DAQ. Modificare il valore medio su 5 e mantenere tutti gli altri parametri come predefinito.
    2. Fare clic su Nuovo riferimento. Il contatore medio in alto a destra della finestra conterà da 0 a 20. Una volta che il contatore raggiunge 20, modificare il valore medio su 1 e fare clic su OK. Il segnale riflesso dal polistirolo verrà salvato come riferimento per eventuali scansioni eseguite in seguito.
       NOTA: Se deve essere eseguita solo la procedura di imaging THz, è meglio eseguire i passaggi da 4.3 a 4.14 prima di estrarre il tessuto tumorale dalla soluzione DMEM.
15. Montare il tumore sulla piastra di polistirolo che copre la finestra dello stadio di scansione.
    1. Rimuovere la finestra di imaging dalla fase di scansione e portarla nell'area di movimentazione dei tessuti. Posizionare il tumore su una piastra di polistirolo, come illustrato nella figura 4B.
    2. Assicurarsi che non ci siano bolle d'aria significative tra la piastra e il tumore. Se si osservano bolle d'aria, premere il tumore con una pinzetta o sollevare il tumore e rotolare delicatamente sul polistirolo fino a quando le lacune d'aria sono ridotte al minimo.
    3. Posizionare i distanziali assorbenti a intervalli regolari intorno al campione di prova, come illustrato nella figura 4B. Posizionare un'altra piastra di polistirolo sopra il tumore e premere delicatamente per rendere la superficie del tumore il più piatta possibile. Nastro verso il basso questa disposizione polistirolo-tumore-polistirolo sulla finestra del campione.
16. Capovolgere la finestra di esempio come illustrato nella Figura 4Ce scattare foto del tumore per mantenere un record del suo orientamento. Riportare la finestra campione con il tumore alla fase di scansione.
17. Fare clic sul pulsante Finestra di dialogo Parametro immagine per aprire la finestra Parametri acquisizione immagine. Impostare i valori di Axis1min, Axis1max, Axis2mine Axis2max per racchiudere completamente la posizione del tumore nella finestra di imaging
    NOTA: per impostazione predefinita, Axis1 è l'asse A e Axis2 è l'asse B.
18. Impostare Axis1step e Axis2step su 0,2 mm per la scansione di imaging.
    NOTA: l'impostazione di Axis1step e Axis2step imposterà la dimensione del passo dei motori stepper su incrementi di 200 m durante il processo di scansione. Il tempo di scansione totale può essere stimato nella finestra Parametri acquisizione immagine.
19. Fare clic sulla scheda Misura nella finestra principale e selezionare l'opzione Scansione 2D Flyback. Nella finestra che si apre, indicare la directory e il nome del file con cui salvare i dati di scansione.

5. Post-elaborazione del tessuto fresco in preparazione per la procedura istopatologia

1. Al termine del processo di scansione, rimuovere la finestra campione, le piastre di polistirolo e il campione dal sistema THz del nucleo e spostarli nell'area designata per i rifiuti pericolosi. Rimuovere il tumore dalla piastra di polistirolo e posizionarlo su un pezzo piatto di cartone di una dimensione paragonabile a quella del tumore. Assicurarsi che l'orientamento del tumore sia lo stesso di quello del polistirolo, con il viso di imaging che tocca il cartone.
2. Immergere un tampone di cotone in colorante di tessuto rosso e macchiare il lato sinistro del tumore fino a dove il bordo del tumore contatta il cartone. Allo stesso modo, macchiare il lato destro del tumore con colorazione tessuto blu. Macchiare la superficie esposta del tumore con una linea di coloranti tessuto giallo che collega la macchia rossa alla macchia blu per indicare la parte posteriore del campione, come mostrato nella Figura 7A.
   NOT: Per evitare che l'inchiostro colori la soluzione di formalità, applicare solo uno strato sottile al tessuto. Questo può essere realizzato tamponando il tampone di cotone su una superficie diversa prima di macchiare il tessuto o utilizzando un tampone di cotone pulito per pulire eventuali coloranti in eccesso. Evitare di lasciare che il tinri contatti la pelle o i vestiti. Questo processo di colorazione del tumore è condotto come riferimento per fornire informazioni sul lato di imaging del tumore e il suo orientamento al patologo.

Figura 7: Post-elaborazione sul tumore dopo l'imaging THz. (A) Tumore posto a faccia in giù su supporto di cartone e tinturato con tintura di tessuto. (B) Filtrare la carta posta sopra il tumore e registrata per mantenere il contatto. (C) Tumore macchiato fissato sul cartone immerso in soluzione di formalina tampone 10% neutro e sigillato con parafilm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Lasciare asciugare l'inchiostro per circa 3-4 min. Tagliare un pezzo di carta da filtro con le stesse dimensioni approssimative del cartone. Posizionarlo sul tumore e avvolgere completamente un pezzo di nastro adesivo intorno alla carta filtrante e cartone come mostrato nella Figura 7B. Il nastro e la carta filtrante dovrebbero fissare il tumore contro il cartone senza applicare alcuna pressione significativa.
4. Immergere il tessuto macchiato apposto sul cartone in una soluzione di formalina tampone neutra al 10% e sigillare il tubo di centrifuga utilizzando una pellicola di paraffina, come illustrato nella Figura 7C. Indicare il numero di campione, la data, il tipo di tessuto e il numero di tumore per il campione sull'etichetta del tubo. Inviare il tumore al patologo per un'ulteriore elaborazione istopatologica.

6. Smaltimento di rifiuti pericolosi

1. Raccogliere tutti i rifiuti dal vassoio di manipolazione dei tessuti insieme al sacchetto di rischio biologico utilizzato per coprire il vassoio e metterlo in un nuovo sacchetto di rischio biologico, come mostrato nella Figura 8. Portare il sacchetto nell'area di rifiuti biopericolosi designati nell'edificio e fissare un appuntamento con il reparto per la salute e la sicurezza ambientale (EH&S) per il ritiro dei rifiuti. Pulire il vassoio di movimentazione dei tessuti e l'area circostante sul tavolo con la soluzione di candeggina 10% ed etanolo.

Figura 8: Fotografia del sacchetto di rifiuti biopericolosi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Prendi il supporto del campione liquido con i distanziali e le finestre al quarzo, la finestra di campionamento su cui è stato montato il tumore, le piastre di polistirolo e le pinzette da laboratorio nell'area di lavaggio. Risciacquare tutti i materiali con acqua e quindi 10% soluzione di candeggina, asciugandosi con gli asciugamani di carta, se necessario per rimuovere i detriti tissutali. Sciacquare di nuovo con acqua, strofinare con soluzione alconox e risciacquare accuratamente. Per vetro e plastica, risciacquare alcool isopropile al 70% e mettere da parte ad asciugare.
   NOT: Una volta che il tumore è in formalina e lo spazio campione è pulito, l'elaborazione dei dati può essere gestita contemporaneamente all'imaging o in un secondo momento.

7. Elaborazione dei dati per costruire immagini THz

1. Esportare i file di dati .tvl salvati dal sistema THz. I file di dati grezzi ottenuti dal sistema sono scritti in Python e sono meglio letti in Python prima di salvare come file di dati MATLAB.
2. Per costruire l'immagine THz del tessuto fresco scansionato, convertire i dati di imaging di riflessione del dominio temporale grezzo nel dominio di frequenza utilizzando la trasformazione di Fourier sulla terza dimensione della matrice di dati non elaborati (ad esempio, la dimensione temporale). Prendere anche la trasformazione Diessidei dei dati di riferimento.
   NOT: Uno spettro tipico del dominio di frequenza deve fornire dati che vanno da 0,1 THz a 4 THz.
3. Normalizzare i dati di esempio con i dati di riferimento ed eseguire gli spettri di potenza in base all'integrazione dei dati normalizzati nell'intervallo di frequenza da f₁ x 0,5 THz a f₂ x 1,0 THz utilizzando la seguente equazione¹⁹:
   
   NOT: Qui E_campione è il dominio di frequenza dati di imaging di riflessione del campione di tessuto e _riferimento E è il dominio di frequenza di un singolo punto dati di riflessione del segnale di riferimento.
4. Costruire l'immagine bidimensionale tracciando i dati calcolati degli spettri di potenza in ogni punto della matrice definita dall'asse A e dall'asse B. Questa immagine è nota come Power spectra THz.
   NOT: Il metodo per ottenere un'immagine THz tomografica invece è descritto nei passaggi da 7.5 a 7,7.
5. Per la caratterizzazione, calcolare la riflessione teorica dipendente dalla frequenza per una serie di potenziali proprietà del tessuto utilizzando la seguente equazione¹⁸:
   
   N.B.: In questo _caso, il complesso coefficiente di riflessione di Fresnel tra la regione i e la regione j;d_j è lo spessore della regione j; e _j è l'angolo di propagazione nella regione j correlato all'angolo di incidenza da parte della Legge di Snell. è il coefficiente di propagazione complessa nella regione j, dove è la frequenza angolare, c è la velocità della luce nel vuoto, n_j è la parte reale dell'indice di rifrazione, e _s,j è il coefficiente di assorbimento¹⁸. La regione 1 è l'aria, la Regione 2 è la piastra di polistirolo e la Regione 3 è il tessuto.
6. Calcolare la riflessione nell'equazione (2) per un intervallo di indici di rifrazione definiti dall'utente e coefficienti di assorbimento per la Regione 3 (n₃ e z_abs,3) e confrontare con il segnale misurato in ogni punto per calcolare l'errore al quadrato medio combinato per la grandezza e la fase.
   NOT: La soluzione per l'indice di rifrazione e il coefficiente di assorbimento è la coppia di valori che danno l'errore più basso.
7. Costruire l'immagine THz tomografica dall'indice di rifrazione estratto e dai dati del coefficiente di assorbimento (n₃ e z_abs,3) a ogni pixel. Analizzare le regioni tumorali confrontando con l'immagine della diapositiva di patologia ottenuta dal patologo. I risultati rappresentativi sono illustrati nella figura 9, con esempi di aderenza insufficiente al protocollo nella figura 10 e nella figura 11.

8. Estrazione delle proprietà elettriche del tessuto utilizzando i dati di spettroscopia di trasmissione

1. Nella finestra principale del software di misurazione della spettroscopia di trasmissione THz, andare alla scheda File e fare clic sull'opzione Esporta. Verrà visualizzata una finestra per selezionare il tipo di dati e l'esempio da esportare. Scegliere i tipi di dati Transmittance and Transmittance Phase per le misurazioni del quarzo e del campione di tessuto.
2. Calcolare la trasmissione teorica dipendente dalla frequenza per una serie di potenziali proprietà dei tessuti utilizzando la seguente equazione¹⁵:
   
   NOT: Ecco il rapporto tra i coefficienti di trasmissione Disnel per le configurazioni del campione e di riferimento; le₁ costanti ₃ di propagazione complesse dell'aria e dei tessuti, rispettivamente; e d è lo spessore del tessuto. La costante di propagazione in generale è definita come . è l'indice di rifrazione complesso definito come , dove n è la parte reale dell'indice di rifrazione; c è la velocità della luce; è la frequenza angolare; e -_abs è il coefficiente di assorbimento¹⁵.
3. Calcolare l'errore al quadrato medio combinato tra la grandezza e la fase della trasmissione nell'equazione (3) e i dati di misurazione dal sistema per un intervallo di valori n e z_abs definiti dall'utente.
   NOT: La soluzione per l'indice di rifrazione e il coefficiente di assorbimento è la coppia di valori che danno l'errore più basso.
4. Tracciare l'indice di rifrazione estratto e i dati del coefficiente di assorbimento rispetto all'intervallo di Figure 12frequenza compreso tra 0,15 e 3,5 THz.

I risultati di imaging THz18 ottenuti seguendo il protocollo di cui sopra del campione di tumore al seno umano #ND14139 ricevuti dalla biobanca sono presentati nella Figura 9. Secondo il rapporto di patologia, il #ND14139 tumore era un carcinoma duttale infiltrante di grado I/II ottenuto da una donna di 49 anni tramite una procedura di chirurgia della lumpectomia mammaria sinistra. La fotografia del tumore è illustrata nella figura 9A, l'immagine patologica nella figura 9Be l'immagine degli spettri di potenza THz ottenuta utilizzando l'equazione (1) nel protocollo è illustrata nella figura 9C. La valutazione dell'immagine della patologia è stata fatta dal nostro patologo di consulenza presso l'Oklahoma State University. Dopo aver correlato l'immagine THz con l'immagine patologica, era chiaro che la regione del cancro (cioè la regione di colore rosso nella figura 9C) mostrava una riflessione maggiore rispetto alla regione grassa (cioè la regione di colore blu nella Figura 9C). Il cerchio blu vicino al centro della regione tumorale nella figura 9C era dovuto alla presenza di una bolla d'aria sotto il tumore durante il processo di imaging.

Vengono presentate anche immagini tomografiche basate sulle proprietà elettriche del tumore ottenute utilizzando il modello sopra discusso per ogni pixel (2.477 pixel in totale). Le immagini tomografiche basate sui dati del coefficiente di assorbimento (cm-1)e sull'indice di rifrazione(n- immagine) del tumore ottenuti alla frequenza 0,5 THz e 1,0 THz sono mostrati rispettivamente nella Figura 9D, 9E, 9Fe 9G. Con l'aumentare della frequenza, i valori del coefficiente di assorbimento calcolato (cm-1)per i pixel di cancro e grasso aumentarono, con pixel di cancro che mostrano valori più alti rispetto al grasso a entrambe le frequenze. Al contrario, l'indice di rifrazione di entrambi i tessuti è diminuito con l'aumentare della frequenza. Va notato che la fase misurata è diventata soggetta a variazioni di scala di micrometri nel livellamento dello stadio di imaging, nello spessore della piastra di polistirolo e nel jitter del motore stepper con l'aumento della frequenza. Ad esempio, le linee orizzontali osservate nella Figura 9E e 9G erano dovute al piccolo spostamento di fase introdotto dai motori stepper durante il processo di scansione, che non è stato osservato alle frequenze più basse.

Figura 9: Analisi del tumore al cancro al seno #ND14139 utilizzando la tecnica di imaging THz. (A) Fotografia del tumore. (B) Immagine patologica a basso potere del tumore. (C) Immagine di spettro di potenza THz sull'intervallo di frequenza 0,5 THz–1,0 THz. (D) THz THz tramite coefficiente di assorbimento tomografico ottenuta a 0,5 THz. Questa immagine è stata costruita utilizzando i dati estratti del coefficiente di assorbimento ad ogni pixel dai dati grezzi dell'imaging di riflessione del tumore. (E) Immagine coefficiente di assorbimento ottenuta a 1,0 THz. (F) Immagine dell'indice di rifrazione (n- immagine) ottenuta a 0,5 THz. Questa immagine è stata costruita utilizzando i dati estratti dell'indice di rifrazione ad ogni pixel dai dati grezzi dell'imaging di riflessione del tumore. (G) Immagine dell'indice refrattivo (n- immagine) ottenuta a 1,0 THz. Figura ripubblicata da T. Bowman et al.18 con il permesso dello SPIE. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

I risultati THz descritti nella Figura 9 sono stati ottenuti seguendo con successo il protocollo descritto. Una manipolazione insufficiente del tessuto può portare a risultati di imaging fuorvianti. Ad esempio, l'imaging THz risultati nella Figura 10 per il tumore al cancro al seno umano #ND10405 mostrano gli effetti di essiccazione insufficiente. La soluzione DMEM in eccesso nel tessuto ha dominato l'immagine degli spettri di potenza THz del tumore in Figura 10B28 con alta riflessione che non era correlata all'immagine patologica mostrata nella Figura 10A28. Questo ha portato a un risultato falso positivo, suggerendo una maggiore presenza di cancro nel tumore. DMEM ha mostrato un indice di rifrazione altrettanto alto e coefficiente di assorbimento all'acqua, come si vede nella figura 10C19 e 10D19, quindi è altamente raccomandato per asciugare correttamente il tumore prima dell'imaging.

Figura 10: L'effetto sull'imaging tumorale estratto dalla soluzione DMEM senza asciugare utilizzando carta da filtro. (A) Immagine patologica a basso potere del tumore #ND10405. (B) Immagine spettrale di potenza del tumore #ND10405 oltre l'intervallo di frequenza 0,5 THz–1,0 THz. (C) La trama dell'indice di rifrazione della trasmissione per DMEM, PBS e acqua che va da 0,15 THz a 3,5 THz ()Il coefficiente di assorbimento della trasmissione (cm–1)trama per DMEM, PBS, e l'acqua che vanno da 0.15 THz a 3.5 THz. Figura 10A, 10B sono ripubblicati da T. Bowman et al.28 con il permesso da IEEE e Figura 10C, Figura 10D sono ripubblicati da N. Vohra et al.19 con il permesso da IOP Publishing, Ltd. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Un altro esempio di aderenza insufficiente al protocollo è mostrato per il #ND11713 del tumore nella figura 11. In questo caso, le bolle d'aria tra la piastra di polistirolo e il tumore non sono state rimosse quando il tumore è stato posto sulla piastra per la procedura di imaging. Ciò ha portato a diversi punti di bassa riflessione nell'immagine THz nella Figura 11B, che ha impedito un confronto accurato con la patologia in Figura 11A. Quindi, se si osservano bolle d'aria dopo aver posizionato il tumore sulla piastra, premere con le pinzette o sollevare il tumore e rotolare delicatamente sul polistirolo fino a quando non vengono rimossi gli spazi d'aria.

Figura 11: Gli artefatti nell'immagine THz causati dalla presenza di bolle d'aria tra la piastra di polistirolo e il tumore. (A) Immagine patologica a basso potere del #ND11713 del tumore. (B) Immagine di spettri di potenza del tumore #ND11713 oltre l'intervallo di frequenza da 0,5 a 1,0 THz.

I risultati della spettroscopia di trasmissione18 per lo stesso esempio (SEZIONE ND14139) sono presentati nella Figura 12. Le sezioni tumorali sono state prese da punti e nella Figura 12A e caratterizzate secondo il protocollo. Entrambi i punti selezionati sono stati prelevati dalla regione del tessuto tumorale nel tumore secondo l'immagine patologica nella figura 12B. Il coefficiente di assorbimento estratto e l'indice di rifrazione per entrambe le sezioni tumorali sono presentati nella Figura 12C,D. Entrambi i punti hanno mostrato un buon accordo per l'intera gamma di frequenze. La curva nera da 0,15 a 2 THz in Figura 12C e Figura 12D rappresenta i dati ottenuti dalla letteratura23 per confrontare i risultati ottenuti nel nostro lavoro.

Figura 12: La caratterizzazione del tumore al cancro al seno #ND14139 utilizzando la spettroscopia di trasmissione THz. (A) La fotografia del tumore con due punti selezionati segnati e da dove sono state tagliate le sezioni spesse 0,5 mm del tumore per le misurazioni della spettroscopia di trasmissione. (B) Immagine patologica a basso potere del tumore. (C) Il coefficiente di assorbimento della trasmissione (cm–1) compreso tra 0,15-3,5 THz a punti e . (D) Il grafico dell'indice di rifrazione della trasmissione compreso tra 0,15 e 3,5 THz a punti e . Figura ripubblicata da T. Bowman etal. 18 con il permesso dello SPIE. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.