Rilevamento di Protein S-Acylation utilizzando Acyl-Resin Assisted Capture

La S-acylation è una modifica post-traduzionale reversibile che comporta l'aggiunta di una catena di acili grassi a un residuo di cisteina interno su una proteina bersaglio tramite un legame di tioestro labile¹. È stato segnalato per la prima volta come una modifica delle proteine con palmitate, un acido grasso 16-carbonio saturo², e quindi questa modifica è spesso indicata come S-palmitoylation. Oltre al palmitato, le proteine possono essere reversibilmente modificate da una varietà di acidi grassi più lunghi e più brevi saturi (miristata e stearate), monoinsaturi (oleati) e polinsaturi (arachidonate ed eicosapentanoa)^acidigrassi 3^,4,5,6,7. Nelle cellule eucariotiche, la S-acylation è catalizzata da una famiglia di enzimi noti come acyltransferesteraes proteici DHHC e la reazione inversa della deacylazione dei cistein è catalizzata da tiosi proteici, la maggior parte dei quali rimangono ancora enigmatici⁸.

La leggibilità del legame di tioestro rende reversibile questa modifica dei lipidi, permettendogli di regolare dinamicamente il clustering proteico, la localizzazione della membrana plasmatica, il traffico intracellulare, le interazioni proteina-proteina e la stabilità proteica^9,10. Di conseguenza, l'acilazione scisa è stata collegata a diversi disturbi tra cui la Malattia di Huntington, il morbo di Alzheimer e diversi tipi di cancro (prostata, gastrica, vescica, polmone, colorettale), che richiede lo sviluppo di metodi affidabili per rilevare questa modifica delle proteine post-traduzionale¹¹.

L'etichettatura metabolica con palmita radioattiva ([³H], [¹⁴C] o [¹²⁵I]) è stato uno dei primi approcci sviluppati per formulare la proteina S-acylation^12,13,14. Tuttavia, i metodi basati sulla radioetichettatura presentano problemi di salute, non sono molto sensibili, richiedono molto tempo e rilevano solo la lipidazione di proteine altamente abbondanti¹⁵. Un'alternativa più veloce e non radioattiva alla radioetichettatura è l'etichettatura metabolica con sonde di acidi grassi bioortogonali, che viene utilizzata regolarmente per testare la dinamica della proteina S-acylation¹⁶. In questo metodo, un acido grasso con un reporter chimico (gruppo alchine o azide) è incorporato nella proteina S-acilato da un acyltransferase proteico. La reazione di cicloaddition Azide-alkyne Huisgen (chimica del clic) può quindi essere utilizzata per attaccare un gruppo funzionato, come un fluoroforo o biotina, all'acido grasso integrato che consente di rilevare la proteina S-acilata^17,18,19.

Lo scambio di acyl-biotin (ABE) è uno dei metodi biochimici ampiamente utilizzati per la cattura e l'identificazione di proteine S-acylated che bypassa alcune delle carenze dell'etichettatura metabolica come l'inadeguatezza per i campioni di tessuto¹⁵. Questo metodo può essere applicato per l'analisi di S-acylation in una vasta gamma di campioni biologici, tra cui tessuti e campioni di cellule congelate^20,21. Questo metodo si basa sulla scissione selettiva del legame tra il gruppo acileere e il residuo di cisteina da idrossilamina neutra. I gruppi tioli liberati vengono poi catturati con un derivato della biotina thiol-reattiva. Le proteine biotinylate generate vengono quindi purificate dall'affinità con streptavidin agarose e analizzate mediante immunoblotting.

Un approccio alternativo chiamato acyl-resina assistita capture (Acyl-RAC) è stato successivamente introdotto per sostituire la fase di biotinylazione con coniugazione diretta di cistein liberi da una resina thiol-reattiva^22,23. Questo metodo ha meno passaggi rispetto ad ABE e allo stesso modo può essere utilizzato per rilevare proteina S-acylation in una vasta gamma di campioni¹.

Acyl-RAC è costituito da 4 passaggi principali (Figura 1),
1. Blocco dei gruppi di thiol liberi;
2. Scissione selettiva del legame cisteina-acilo con idrossilamina neutra (HAM) per esporre i gruppi di cisteina;
3. Cattura dei cistein lipidati con una resina thiol-reattiva;
4. Arricchimento selettivo delle proteine aclatato da S dopo l'eluizione con riduzione del tampone.

Le proteine catturate possono quindi essere analizzate mediante immunoblotting o sottoposte a proteometria di massa (MS) per valutare il proteoma aclato da S in una vasta gamma di specie e tessuti^22,24,25. I singoli siti di S-acylation possono anche essere identificati mediante la digestione della trypsin acquisizione delle proteine catturate e l'analisi dei peptidi risultanti da LC-MS/MS²². Qui, dimostriamo come acyl-RAC può essere utilizzato per il rilevamento simultaneo di S-acylation di più proteine sia in una linea cellulare che in un campione di tessuto.

I topi utilizzati in questo protocollo sono stati eutanasiati secondo le linee guida NIH. L'Animal Welfare Committee dell'Università del Texas Health Science Center di Houston ha approvato tutto il lavoro sugli animali.

1. Preparazione dei lismi cellulari

1. Preparare il buffer di lisi come descritto nella tabella 1. A 10 mL di PBS, aggiungere 0,1 g di detergente n-dodecyl (DDM) e ruotare per sciogliere. Aggiungete 100 l di fosphatase inhibitor cocktail 2, ML211 (10 m), PMSF (10 mM) e cocktail inibitore della proteasi (1x) e raffreddare il tampone sul ghiaccio prima dell'uso.
2. Trasferire i supporti necessari contenenti le cellule dell'incubatrice in tubi conici da 15 mL o 50 mL e le cellule di spin a 350 x g per 5 min e aspirare per sbarazzarsi di eventuali detriti cellulari.
   NOTA: Abbiamo usato 1 x 10⁷ celle per ogni reazione acilo-RAC da eseguire.
3. Lavare il pellet rispendendolo in 5 mL di PBS e ruotando a 350 x g per 5 min.
   NOTA: Eseguire rapidamente il passaggio 1.3 per evitare la lisi cellulare a causa di un'incubazione prolungata in PBS.
4. Aggiungere 600 lofildi di lisi tampone preparato al punto 1.1 al pellet e lo sileria a 1500 giri/m in uno shaker termico per 30 min a 4 gradi centigradi.
5. Lisati chiari per centrifugazione a 20.000 x g a 4 gradi centigradi per 30 min a pellet detersivo-materiali solubili. Raccogliere il lisato eliminato in tubi di microfuge pre-raffreddati da 1,5 mL e tenerli sul ghiaccio.
6. Eseguire un saggio Bradford/BCA per stimare la concentrazione di proteine. È fondamentale garantire la stessa quantità di proteine tra campioni diversi prima di eseguire l'esperimento. Si consiglia di utilizzare almeno 500 g di proteine per reazione.
   NOTA: Negli esperimenti descritti, abbiamo usato cellule coltivate (Jurkat) e splenociti primari dal tessuto dei topi. Il metodo di lisi descritto sopra può essere adottato anche ad altri tipi di cellule. La concentrazione media di proteine ottenuta per i tipi di cellule di cui sopra è di circa 500 g per 1 x 10⁷ cellule. Le cellule Jurkat sono state mantenute in RPMI-1640 media modificato per contenere 2 mM L-glutamine, 10 m HEPES, 1 mM di pyruvate di sodio, 4.500 mg/l di glucosio e 1.500 mg/L bicarbonato di sodio integrato con 10% FBS a 37 s.C con 5% CO₂. Abbiamo usato 1 x 10⁷ cellule Jurkat per reazione. Gli splenociti primari sono stati isolati dal tessuto della milza del topo come descritto²⁶. In breve, il tessuto della milza è stato macerato sul ghiaccio, seguito da lisi di eritrociti in soluzione ipotonica e separazione dai linfociti dalla centrifugazione. Abbiamo usato 1 x 10⁷ cellule primarie per reazione.

2. Acyl-RAC: Blocco dei gruppi thiol liberi

NOTA: tutti i passaggi successivi possono essere eseguiti a temperatura ambiente (RT).

1. Trasferire il lisato in un nuovo tubo di microfuge da 1,5 ml ed eseguire la precipitazione cloroformio-metanolo (CM) come descritto di seguito.
   1. Aggiungere metanolo (MeOH) e cloroformio (CHCl₃) al lisato ad un rapporto finale di lisato: MeOH: CHCl₃ di 2:2:1 e agitare vigorosamente per creare una sospensione omogenea.
   2. Girare a 10.000 x g per 5 min per formare un pellet ("pancake") all'interfase tra fasi acquose e organiche.
   3. Inclinare il tubo e aspirare il più possibile il solvente utilizzando un ago o una punta di carico gel.
   4. Asciugare l'aria del pellet proteico per alcuni minuti e lavarlo delicatamente aggiungendo 600 lofe di MeOH e mescolando delicatamente per evitare di rompere il pellet
   5. Rimuovere con cura il restante MeOH e asciugare il pellet proteico su un banco per circa 5 minuti.
   6. (Facoltativo) Eseguire un ulteriore passo di centrifugazione per ruotare verso il basso qualsiasi pellet rotto dopo il lavaggio MeOH per evitare la perdita di campione.
      NOTA: l'esperimento può essere interrotto dopo la fase di precipitazione CM. Una volta ottenuto, il pellet può essere conservato in 500 gradi di MeOH in -20 gradi centigradi fino a una settimana.
      1. Sciogliere il pellet proteico in un buffer da 2SHB da 2SHB vortice a 42 s/1500 rpm in uno shaker termico fino a quando il pellet non viene sciolto.
   7. (Facoltativo) Incubare per altri 5-10 min in un bagno d'acqua sonicante per sciogliere il pellet.
      NOTA: La durata della sonicazione varia a seconda della solubilità del materiale. Tuttavia, la sonicazione prolungata può causare la degradazione delle proteine.
2. Preparare lo 0,2% di metano metilethiosulfonate (MMTS) (v/v) in 2SHB aggiungendo 2 L di MMTS a 998 l l di buffer 2SHB.
   NOTA: utilizzare 0,2% MMTS appena preparato per ogni esperimento.
3. Aggiungere 200 L dello 0,2% MMTS in 2SHB ad ogni tubo ad una concentrazione finale dello 0,1% MMTS. Incubare per 15 min a 42 sc con agitazione a 1500 giri/m in uno shaker termico.

3. Acyl-RAC: Scissione dell'idrossilamina (HAM) e cattura delle proteine Aciolate S

1. Ripetere le precipitazioni 3-4x CM come descritto in precedenza per rimuovere MMTS. La rimozione di MMTS può essere stimata dalla mancanza di odore distinto di MMTS. Dopo ogni precipitazione, sciogliere il pellet in un buffer da 100 gradi di 2SHB vorticendo a 42 s/1500 giri/min in uno shaker termico fino a quando il pellet si dissolve, quindi diluire con 300L di buffer A.
2. Dopo la precipitazione finale, sciogliere i campioni in 200 - L di buffer 2SHB come descritto sopra e diluire con 240 L del buffer A.
3. In caso di confronto dei cambiamenti nella S-acylation in risposta a diverse condizioni di trattamento, misurare nuovamente la concentrazione di proteine e procedere con la stessa quantità di proteine per ogni condizione.
4. Conservare 40 l da ogni campione come controllo di input.
5. Suddividere i campioni in due parti uguali di 200 -L e marcare i tubi come "HAM" e "- HAM". Aggiungere 50 L di 2 M HAM neutro appena preparato (pH 7,0-7,5) ad una concentrazione finale di 400 mM a uno dei tubi (HAM) e 50 L di 2 M NaCl neutro al secondo tubo (- HAM), che verrà utilizzato come controllo negativo. Procedere con l'aggiunta di perline tiopropile-sefarose (TS).
   NOTA: l'esperimento può essere interrotto dopo una qualsiasi delle fasi di precipitazione CM. Una volta ottenuto, il pellet può essere conservato in 500 gradi di MeOH in -20 gradi centigradi fino a una settimana. PH neutro di 2 M HAM garantisce la sua selettività per il legame acyl-cysteine thioester e deve essere regolato con attenzione. Prestare attenzione quando si maneggiano campioni nel buffer 2SHB per evitare la perdita di campione a causa di schiuma eccessiva. Tutti i passaggi seguenti sono identici per - campioni di HAM e HAM.
6. Aggiungere 30 lofan di tallone-slurry ad ogni tubo e ruotare i tubi per 1-2 h a RT.
7. Lavare le perline TS 4x con 1% SDS nel buffer A per rimuovere il HAM residuo.
   1. Girare delicatamente verso il basso tutti i campioni di tallone utilizzando un microfugo per 1 min e aspirare con attenzione il supernatante.
   2. Risospendere le perline in 500 -L dell'1% di SDS nel buffer A.
   3. Ripetere il passaggio 3.7.1–3.7.2 tre volte.
      NOTA: il tiopropile-sepharose (TS) attivato viene fornito liofilizzato in presenza di additivi che devono essere lavati via al pH neutro prima dell'accoppiamento. L'acqua distillata è raccomandata per il gonfiore e il lavaggio. Pesare 0,1 g di perline e risospendere in 1 mL di acqua distillata e lasciarla gonfiare mentre ruota per 30 min-1 h a RT. Lavare perline 1x con buffer A e preparare un liquame con buffer A, in un rapporto del 50% stabilizzato medio al 50% tampone. Swollen TS può essere conservato a pH neutro in presenza di 20% etanolo a 4 gradi centigradi fino a una settimana. Non usare azide di sodio come agente batteriostatico poiché gli ioni di azide reagiscono con i gruppi disulfide 2-pyridyl. Per una maggiore efficienza, preparare perline fresche. Durante la manipolazione delle perline, la punta di una punta di pipetta P200 può essere tagliata leggermente in modo da evitare danni.
      NOTA: l'esperimento può essere interrotto in qualsiasi fase dopo la precipitazione CM. Il pellet può essere conservato in 500 gradi L di MeOH in -20 gradi centigradi fino a una settimana.

4. Elusione e rilevamento di proteine acilate A S

1. Dopo l'ultimo lavaggio, girare delicatamente verso il basso le perline come descritto sopra e aspirare quanto più supernatante possibile senza disturbare le perline.
2. Recuperare le proteine da perline con 4x sDS buffer campione con DTT.
   1. Aggiungete 50 l di 4x buffer di campione SDS alle perline e incubate a 80 gradi centigradi, 1500 giri/m per 15 min in uno shaker termico. Lasciare raffreddare i tubi.
   2. Centrifugare le perline a 5.000 x g per 3 min per pellet completamente le perline e trasferire le proteine eluite in un tubo fresco da 1,5 mL utilizzando una punta di carico del gel.
3. Eseguire SDS-PAGE e analizzare S-acylation delle proteine di interesse da gonfiore occidentale.

Seguendo il protocollo descritto sopra, abbiamo usato per la prima volta acyl-RAC per rilevare simultaneamente l'acilazione S di diverse proteine nelle cellule Jurkat, una linea cellulare T immortalata originariamente derivata dal sangue periferico di un paziente con leucemia delle cellule T27. Proteine cellulari T regolatorie precedentemente identificate come S-acylated9,28,29 sono stati scelti per dimostrare l'utilità di questo metodo. Come mostrato nella Figura 2A, la tirosina chinasi Lck può essere rilevata nei lisati trattati con idrossilamina neutra 2 M per fendere il legame di tioestro tra i residui di cisteina e una moiety di acidi grassi (lane HAM). Il campione trattato con 2 M NaCl (- ham lane) rappresenta un importante controllo negativo, che indica la selettività del saggio per il rilevamento dei legami del tioestro. La corsia di ingresso conferma ulteriormente la specificità del segnale e può servire come un controllo positivo se la proteina di interesse non è S-acylated. La membrana è stata poi spogliata e risondata con anticorpi contro le proteine Fyn e LAT per dimostrare che il saggio acyl-RAC può essere utilizzato per analizzare la S-acylation di più proteine contemporaneamente (Figura 2A).

Per dimostrare l'utilità di questo metodo per rilevare la proteina S-acylation in campioni di tessuto, abbiamo applicato il protocollo acyl-RAC alla milza del topo. Come illustrato nella Figura 2B, S-acylation of Lck, Fyn e LAT può essere facilmente rilevato negli splenociti primari del mouse che indicano che questa modifica è conservata tra due specie.

come illustrato nella Figura 1. Rappresentazione schematica di acyl-RAC. Il metodo consiste in 4 passaggi principali: (1) bloccando i gruppi di tiolo libero con metathiosulfonato metilico (MMTS), (2) scissione selettiva del legame cisteine-acyl tioester con idrossilamina neutra (HAM) per esporre i gruppi di cisteinathil, (3) cattura di proteine con cinol appena esposto mediante coniugazione diretta con una resina thiol-reattiva e (4) recupero delle proteine catturate utilizzando un buffer di elizione di riduzione, seguito da immunoblotting o analisi MS. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Rilevamento di proteine acilate S. Un saggio acyl-RAC è stato utilizzato per rilevare l'aclicazione delle cellule S delle proteine di segnalazione delle cellule T nelle cellule T Jurkat (A) e nel tessuto della milza murina (B). L'immunobloificazione con anticorpi specifici di Lck, Fyn- e LAT mostra la S-acylation di queste proteine nel campione trattato con idrossilamina (corsia HAM). Un campione trattato con cloruro di sodio (- corsia HAM) serve come controllo negativo. I lisati non trattati vengono visualizzati nella corsia di input. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: composizione del buffer dei buffer di uso comune necessari nel protocollo. Il buffer 2SHB e il buffer A possono essere preparati in anticipo, ma il loro pH deve essere controllato regolarmente. Il buffer di lisi e HAM devono essere preparati il giorno dell'esperimento.

Nessun conflitto di interessi dichiarato.