Ibridazione in situ per Sipunculus nudus Coelomic Fluid

ISH, utilizzando una sonda di acido nucleico etichettata per rilevare il DNA specifico o la sequenza di RNA di interesse, è un metodo utile per descrivere il modello di espressione spaziale dei geni bersaglio nei tessuti morfologicamente conservati^1,2,3. Normalmente, la sequenza bersaglio viene generata dalla reazione a catena della polimerasi (PCR), e quindi utilizzata come modello per sintetizzare la sonda RNA antisense/sense etichettata con digossigenina uridina-5'-triplodiato. I campioni vengono fissati e permeabilizzati prima dell'incubazione con riboprobe. Dopo aver lavato via la sonda in eccesso, l'ibridazione viene visualizzata dall'immunosofochimica utilizzando un anticorpo anti-digoxygenina, che è alcalino fosforo coniugato^3,4,5,6.

Sipunculus nudus (Phylum Sipuncula; ordine Sipunculida: Sipunculidae) è un verme marino non segmentato, coelomate e bilateralmente simmetrico^7,8. Sipunculus nudus è una specie cosmopolita ampiamente distribuita nelle acque costiere tropicali e temperate. È anche un'importante risorsa di pesca marina nel sud della Cina a causa dei suoi alti valori nutrizionali e medicinali^9,10. Tuttavia, Sipunculus nudus in biologia molecolare è ancora agli inizi. Per comprendere appieno il ruolo biologico dei geni, lo studio dei modelli di espressione dei geni a una risoluzione cellulare è di grande interesse. Nell'organismo non modello Sipunculus nudus, il metodo ISH, che è un metodo ideale per rilevare i modelli di espressione dei geni, non è ancora stato stabilito. Il suo fluido coelomico contiene diversi tipi di cellule, tra cui granulociti, cellule dell'urna, cellule vescicolari, cellule germinali, eritrociti, ecc¹¹. Il doppio sesso/mab-3 correlato fattore di trascrizione-1 (dmrt1), utilizzato come gene rappresentativo in questo metodo, è un regolatore trascrizionale altamente conservato di determinazione sessuale e differenziazione nella maggior parte delle specie che vanno dagli invertebrati ai mammiferi^12,13. In una serie di specie (ad es. porgy nero, ecc.) ¹⁴, dmrt1 è stato espresso nelle cellule di Sertoli, che circondano le cellule germinali, la cui funzione è simile alle cellule trofoblaste di Sipunculus nudus. Pertanto, abbiamo ipotizzato che il dmrt1 di Sipunculus nudus sia espresso in cellule trofoblaste di spermatozeugmata, e il risultato del metodo ISH ha chiaramente confermato l'ipotesi.

Questo protocollo descrive per la prima volta ISH, con sonde antisenso/mRNA antisenso etichettate con digossigenina, per determinare i modelli di espressione dell'mRNA nel suo striscio fluido coelomico. Vengono fornite le condizioni di reazione ottimali, che consentono una visualizzazione molto sensibile dell'espressione dell'mRNA ad alta risoluzione. Il metodo ISH sviluppato potrebbe essere potenzialmente applicato in più specie di Sipunculida diverse da Sipunculus nudus.

La procedura animale è stata approvata dal Comitato per la cura e il benessere degli animali dell'Università di Huaqiao.

1. Preparazione Riboprobe

1. Design Primer
   1. Aprire il programma Primer 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/). Copiare la sequenza dmrt1 (GenBank: MK182259) nella finestra della sequenza.
   2. Impostare la lunghezza del primer (23-25 bp), la temperatura di fusione (55-60 gradi centigradi) e il contenuto di G/C (40-60%). Fare clic su Scegli Primer.
      NOTA: la dimensione minima richiesta per la sonda RNA è di circa 500 bp. Le sonde più lunghe normalmente hanno una specificità maggiore.
   3. Aggiungere la sequenza di promotore di polimerasi t7 RNA (5^, -TAATACGACTCACTATAGGG-3^,) a uno dei primer selezionati. Le sequenze di primer dmrt1 per ISH sono mostrate nella Tabella 1.
      NOTA: Per le sonde di rilevamento, il promotore di polimerasi t7 RNA si trova all'estremità 5' dei primer in avanti. Per le sonde antisense, il promotore di polimerasi in RNA T7 si trova all'estremità 5'dei primir invertiti.
2. Amplificazione PCR
   1. Posizionare i tubi di microfuge sul ghiaccio e preparare il seguente mix di reazione (per una reazione di 50 gradi): 1x miscela di polmeria di DNA Taq, 1 g di cDNA (che viene preparato da 100 gradi di liquido coelomico), 1 primer in avanti di 1 M, 1 m inverso e acqua priva di nucleani.
   2. Mescolare brevemente la reazione PCR con pipettaggio e centrifuga.
   3. Posizionare il tubo di reazione in un ciclore termico, e far funzionare la PCR utilizzando le seguenti condizioni: denaturazione iniziale a 95 s per 2 min seguita da 36 cicli di denaturazione a 95 gradi centigradi per 30 s, annealing a 55-60 gradi centigradi per 30 s, estensione a 72 s per 30 s e un'estensione finale a 72 s per 7 min.
      NOTA: La temperatura di annessione deve essere ottimizzata in base ai primer.
3. Purificazione e verifica del prodotto PCR
   1. Caricare il 50 - L di miscela PCR direttamente su un 1% gel di agarose. Eseguire il gel di agarose a 150-180 V per 10 min in 0.5x TBE. Isolare i frammenti di DNA specifici dal gel di agarose dell'1%.
      NOTA: il DNA deve apparire come una singola banda e non come uno striscio.
   2. Purificare i frammenti di DNA utilizzando un kit di estrazione gel secondo il protocollo del produttore. Quantificare i prodotti purificati mediante spettrofotometria a una lunghezza d'onda di 260 nm.
   3. Verificare l'autenticità dei prodotti PCR mediante sequenziamento.
      NOTA: (Punto pausa) I prodotti PCR purificati possono essere conservati a -20 gradi centigradi per diversi mesi.
4. Sintesi di Riboprobe
   1. Posizionare i tubi di microfuge senza RNase sul ghiaccio e aggiungere quanto segue al tubo di microfuge (per una reazione di 10 -L): 1x Digoxygenin RNA Labeling Mix, 1x buffer di trascrizione, 0,5L di inibitori di RNase, 1 l di polimerasi di RNA T7, 1 g di prodotto PCR e acqua senza RENas. Mescolare brevemente la reazione con pipettaggio e centrifuga. Incubare per 2 h a 37 .
   2. Aggiungete 2 -L di DNase I. senza RNase Mix. Mescolare brevemente la reazione con il pipettaggio e la centrifuga. Incubare per 15 min a 37 gradi centigradi.
   3. Aggiungere 2 :2 M EDTA (pH 8.0). Mescolare brevemente la reazione con pipettaggio e centrifuga.
   4. Aggiungere alla reazione di cui sopra 2,5 luna di 4 M liCl e 75 l di etanolo prefreddo. Mescolare bene. Lasciare agire per 30 min a -70 gradi centigradi.
   5. Centrifuga a 12.000 x g per 10 min a 4 gradi centigradi. Decant l'etanolo. Aggiungere 1 mL di etanolo prefreddo 70% (v/v) e lavare la precipitazione mescolando delicatamente.
   6. Centrifuga a 12.000 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Decant il 70% di etanolo e asciugare brevemente la precipitazione vicino a una lampada alcolica. Sciogliere la precipitazione aggiungendo 30 l di acqua senza RNase e mescolare delicatamente.
   7. Carico 2 - L di RNA sintetizzato su un 1% gel di agarose. Eseguire il gel di agarose a 180 V per 5-10 min in 0.5x TBE. Misurare la concentrazione dell'RNA etichettato utilizzando uno spettrofotometro ad una lunghezza d'onda di 260 nm.
      1. Utilizzare tubi di microfuge senza RNase e punte di filtro per evitare la contaminazione da RNase.
         NOTA: (Punto di pausa) Le sonde con etichetta digoxygenin possono essere conservate a -70 gradi centigradi per diversi mesi.

2. Raccolta di fluidi coelomici

1. Fissare il S. nudus sul tavolo di dissezione con perni. Aprire il corpo del S. nudus con piccole forbici autoclaved. Isolare il fluido coelomico con una pipetta.
2. Raccogliere e trasferire 1 mL di liquido coelomico con una pipetta a vetrini al microscopio trattati con polid-lysina. Applicare il fluido coelomico in modo uniforme con una punta di pipetta. Asciugare all'aria i vetrini per 1 h a 37 gradi centigradi.

3. Ibridazione in situ

1. Giorno 1
   1. Reidratare i vetrini in un barattolo di colorazione dei vetrini contenente 100 mL di 1x pirocarbonato dietilo trattato fosfato bufferizzato salina (DEPC-PBS). Reidratati 3 volte con 1x DEPC-PBS, 5 min per lavaggio con agitazione delicata.
   2. Permeabilizzare lo striscio del liquido coelomicomico per digestione con proteinasi K di 10 g/mL a temperatura ambiente per 5 min. Incubare i vetrini nel 4% di paraformaldeide (PFA) per 20 min per fermare la digestione. Lavare i vetrini in 1x DEPC-PBS con agitazione delicata per 5 min 3 volte.
   3. Aggiungere 50 -L di mix di ibridazione (HM) contenente il senso/antisense riboprobe sui vetrini e aggiungere uno slip di copertura.
   4. Aggiungere il buffer della scatola bagnata nella scatola bagnata. Mettere i vetrini nella scatola bagnata e sigillare bene con pellicola di paraffina. Ibridare durante la notte (almeno 16 h) a 60 gradi centigradi.
2. Giorno 2
   1. Preriscaldare il tampone di lavaggio a 65 gradi centigradi. Immergere il vetrino nel barattolo di colorazione del vetrino contenente il buffer di lavaggio e lasciarlo riposare fino a quando il coperchio scivola automaticamente. Ci vogliono circa 5 min.
   2. Lavare 2 volte con il cuscinetto di lavaggio a 65 gradi centigradi, 30 min per lavaggio con agitazione delicata. Lavare 2 volte con 0,2x citrato saline-sodio (SSC) a 65 gradi centigradi, 30 min per lavaggio con agitazione delicata. Lavare 2 volte con tampone di acido maleico contenente Tween 20 (MABT) a temperatura ambiente, 30 min per lavaggio con agitazione delicata.
   3. Incubare i vetrini a temperatura ambiente per 3-4 h nel buffer di blocco. Incubare i vetrini in una soluzione di frammenti anti-digossigenina-AP Fab da 1 mL diluita a 1/5000 con il buffer di blocco a 4 gradi durante la notte.
3. Giorno 3
   1. Rimuovere la soluzione anticorpale e lavare brevemente i vetrini in MABT. Lavare 4 volte con MABT a temperatura ambiente, 25 min per lavaggio con agitazione delicata.
   2. Incubare i vetrini con cuscinetto di fosfofoso alcalina a temperatura ambiente 3 volte, 5 min per lavaggio. Rimuovere il buffer di fosfofosi alcalina e aggiungere 1 mL di 5-bromo-4-chloro-3-indolyl fosfato (BCIP)/nitro blue tetrazolium (NBT) soluzione di colorazione. Tenere le diapositive al buio.
   3. Osservare periodicamente la reazione del colore al microscopio ottico. Quando il colore è completamente sviluppato (tempo di reazione nell'intervallo di 1-4 h), lavare i vetrini 2 volte con MABT a temperatura ambiente, 5 min per lavaggio con agitazione delicata.
   4. Lavare 2 volte con soluzione di arresto a temperatura ambiente, 15 min per lavaggio con agitazione delicata. Incubare i vetrini in metanolo per rimuovere la macchia in eccesso, a temperatura ambiente per 30 min. Secondo il colore di sfondo, il lavaggio del metanolo può essere fatto 2 o 3 volte e il tempo di decolorazione può essere esteso.
   5. Lavare 2 volte con MABT a temperatura ambiente, 5 min per lavaggio con agitazione delicata. Trasferire le diapositive su una carta da filtro fresca. Aggiungere 50 - L di glicerolo. Aggiungere i copricopertine e osservare microscopicamente.
      NOTA: la composizione della soluzione è riportata nella tabella 2.

Una sintesi dei passaggi coinvolti in ISH è illustrata nella Figura 1. Antisense e corrispondenti rionde senso per dmrt1 sono stati sintetizzati da prodotti PCR amplificati dai cDNA fluidico coelomici. L'autenticità dei prodotti PCR è stata verificata mediante sequenziamento diretto. I riboprobe sono stati sintetizzati utilizzando polimerasi T7 RNA secondo i protocolli del produttore e un rapporto precedente4 con alcune modifiche minori. I segnali rappresentativi di ISH sono mostrati nella Figura 2. ISH di Sipunculus nudus coelomic fluido con risonda antisenso che mira dmrt1 rivela colorazione viola concentrata in cellule trofoblaste del spermatozeugmata (Figura 2A, B, frecce rosse). Un riboprobe senso è stato utilizzato come un controllo negativo e il riboprobe senso per dmrt1 non ha rilevato alcun segnale di ibridazione (Figura 2C).

come illustrato nella Figura 1. Diagramma di flusso di ISH. Le caselle blu sono i passi per sintetizzare riboprobe. Scatole di colore verde chiaro sono passi per le procedure in situ. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

come illustrato nella Figura 2. L'espressione di dmrt1 nel liquido coelomico sipunculus nudus rilevato da ISH. (A, B) Ibridazione con riboprobe antisenso dmrt1. (C) Ibridazione con riboprobe senso dmrt1. Le frecce rosse rappresentano i segnali di ibridazione nelle celle trofoblaste. sz, spermatozeugmata. Barra della scala: 50 m. Questa cifra è stata modificata da Li etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1. Sequenze di primer dmrt1.

Tabella 2. La composizione delle soluzioni utilizzate nel protocollo ISH.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.