Questo protocollo descrive un efficace approccio di ibridazione in situ per rilevare i livelli di espressione dell'mRNA e i modelli spaziali dei geni bersaglio nel fluido coelomico del nudus Sipunculus.
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Articolo metodologico
Ibridazione in situ per Sipunculus nudus Coelomic Fluid
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'ibridazione in situ (ISH) è una tecnica molto informativa per presentare modelli di distribuzione cellulare di geni specifici (ad esempio, mRNA e ncRNA) nei tessuti. Il verme sipunculid Sipunculus nudus è una risorsa di pesca cruciale in quanto ha alti valori nutrizionali e medicinali. Attualmente, la ricerca sulla biologia molecolare di Sipunculus nudus è ancora agli inizi. Lo scopo di questo articolo è quello di sviluppare un metodo sensibile per localizzare mRNA specifico nel liquido coelomico del nucleo sipunculus. Il protocollo include passaggi dettagliati di ISH, tra cui l'antisensesità con etichette di digossigenina e la preparazione del risonante senso, la raccolta e la preparazione della sezione dei fluidi coelomici, l'ibridazione specifica di riboprobe, l'incubazione degli anticorpi, i trattamenti di post-colorazione. Vengono dimostrati i risultati rappresentativi ottenuti da un esperimento riuscito con questo metodo. Il protocollo dovrebbe essere applicabile anche ad altre specie di Sipuncula.
Introduzione
ISH, utilizzando una sonda di acido nucleico etichettata per rilevare il DNA specifico o la sequenza di RNA di interesse, è un metodo utile per descrivere il modello di espressione spaziale dei geni bersaglio nei tessuti morfologicamente conservati1,2,3. Normalmente, la sequenza bersaglio viene generata dalla reazione a catena della polimerasi (PCR), e quindi utilizzata come modello per sintetizzare la sonda RNA antisense/sense etichettata con digossigenina uridina-5'-triplodiato. I campioni vengono fissati e permeabilizzati prima dell'incubazione con riboprobe. Dopo aver lav....
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Protocollo
La procedura animale è stata approvata dal Comitato per la cura e il benessere degli animali dell'Università di Huaqiao.
1. Preparazione Riboprobe
- Design Primer
- Aprire il programma Primer 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/). Copiare la sequenza dmrt1 (GenBank: MK182259) nella finestra della sequenza.
- Impostare la lunghezza del primer (23-25 bp), la temperatura di fusione (55-60 gradi centigradi) e il contenuto di G/C (40-60%). Fare clic su Scegli Primer.
NOTA: la dimensione minima richiesta per la sonda RNA è di circa 500 bp. Le sonde più lunghe normalmente hanno una spec....
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Risultati
Una sintesi dei passaggi coinvolti in ISH è illustrata nella Figura 1. Antisense e corrispondenti rionde senso per dmrt1 sono stati sintetizzati da prodotti PCR amplificati dai cDNA fluidico coelomici. L'autenticità dei prodotti PCR è stata verificata mediante sequenziamento diretto. I riboprobe sono stati sintetizzati utilizzando polimerasi T7 RNA secondo i protocolli del produttore e un rapporto precedente4 con alcune modifiche minori. I segnali rappresenta.......
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Discussione
Studi precedenti hanno dimostrato che ish è adatto per rilevare più RNA bersaglio16,17,18. In questo protocollo, abbiamo descritto un metodo ISH ad alta risoluzione per rilevare l'mRNA nel fluido coelomico e sottolineare le condizioni di ibridazione ottimizzate nel sipunculus nudus. I segnali evidenti di dmrt1 che abbiamo osservato hanno dimostrato la riuscita applicazione di questo protocollo nella rilevazione.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal Young Scientists Fund della National Natural Science Foundation of China (Grant no.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Agarosio | Biowest | 111860 | |
| Anti-digossigenina-AP Fab frammenti Roche | 11093274910 | ||
| Kit per lo sviluppo del colore della fosfatasi alcalina BCIP / NBT | Beyotime | C3206 | |
| Albumina sierica bovina | Sigma | B2064 | |
| Centrifuga | Eppendorf | 5415R | |
| Acido | citricoSinopharm Reagente Chimico Co. | 5949-29-1 | |
| Reagente chimico Sinopharm | trisodico acido citrico | 4/3/6132 | |
| Vetrini coprioggetti | Beyotime | FCGF60 | |
| Formamide deionizzata | Amresco | 12/7/1975 | |
| Dietil pirocarbonato, DEPC | Sigma | D5758 | Sostanza nociva |
| Digossigenina (DIG) RNA Labeling Mix Roche | 11277073910 | ||
| DNasi I, RNasi priva | 18047019 | ||
| EDTA | Sigma | 431788 | |
| Imaging su gel per elettroforesi | Bio-Rad | Universal Hood III | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 64-17-5 | |
| Kit di estrazione del gel | Omega | D2500 | |
| Apparecchio per elettroforesi su gel | Beijing Liuyi Instrument Factory | DYY-6C | |
| Glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 56-81-5 | |
| Glicina | Sigma | G5417 | |
| Eparina | Sigma | 8/1/9041 | |
| KCl | Sinopharm Reagente chimico Co. | 7447-40-7 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Reagente chimico Co. | 7778-77-0 | |
| LiCl | Sigma | 203637 | |
| Acido maleico | Sinopharm Reagente chimico Co. | 110-16-7 | |
| Reagente chimico Sinopharm al | metanolo | 67-56-1 | Sostanza nociva |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7786-30-3 | |
| Na2HPO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7558-79-4 | |
| NaCl | Biofount | JT0001 | |
| NaOH | Sinopharm Reagente chimico Co. | 1310-73-2 | Film corrosivo |
| di paraffina | Bemis Company, Inc. | PM-996 | |
| Paraformaldeide, PFA | Sigma | 158127 | Sostanza nociva |
| PCR Strumento Life | Technology | Proflex | |
| Pins | Deli | 16 | |
| Pipetta | Eppendorf | plus G | |
| Vetrini per microscopio trattati con poli-D-lisina | Liusheng VER_A01 | ||
| Proteinasi K | Sigma | ||
| acqua priva di RNasi | HyClone | SH30538. 02 | |
| Inibitore della RNasi | Roche | 3335399001 | |
| S. nudus | |||
| Siero di pecora | Beyotime | C0265 | |
| Barattolo di colorazione per vetrini | Beyotime | FG010 | |
| Scatola per la conservazione dei vetrini | Beyotime | FBX011 | |
| Piccole forbici autoclavate | Shuanglu | sku_8330 | |
| Spettrofotometri | Thermo Fisher | NanoDrop 2000/2000c | |
| T7 RNA polimerasi | Roche | 10881767001 | |
| Taq DNA polimerasi mix (2X) | Thermo Scientific | K1081 | |
| Tris HCl | Sigma | RES3098T | |
| tRNA | Roche | ||
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Bagno d'acqua | Zhengzhou Grande Muraglia Scientifica Industriale | HH-S2 |
Riferimenti
- Tsai, C. J., Harding, S. A. In situ hybridization. Methods in Cell Biology. 113, 339-359 (2013).
- Koshiba-Takeuchi, K. Whole-mount and section in situ hybridization in mouse embryos for detecting mRNA expression and localization. Methods in Cell Biology....
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Ristampe e permessi
