Quantificazione simultanea di kynurenine selezionate analizzate dalla cromatografia liquida-spettrometria di massa in mezzo raccolto da colture cellulari tumorali

Summary

Qui descritto è un protocollo per la determinazione di quattro diversi metaboliti del triptofano generati nella via della cinurenina (cinurenina, 3-idrossichinurenina, acido xanturenico, acido 3-idrossiantranilico) nel mezzo raccolto dalle colture cellulari tumorali analizzate dalla cromatografia liquida accoppiata con una singola spettrometria di massa quadrupolo.

Abstract

La via della cinurenina e i cataboliti di triptofano chiamati kynurenine hanno ricevuto una maggiore attenzione per il loro coinvolgimento nella regolazione immunitaria e nella biologia del cancro. Un saggio di coltura cellulare in vitro viene spesso utilizzato per conoscere il contributo di diversi cataboliti di triptofano in un meccanismo di malattia e per testare strategie terapeutiche. Il mezzo di coltura cellulare ricco di metaboliti secreti e molecole di segnalazione riflette lo stato del metabolismo del triptofano e di altri eventi cellulari. Si desidera nuovi protocolli per la quantificazione affidabile di più cinurenine nel mezzo di coltura cellulare complesso per consentire un'analisi affidabile e rapida di più campioni. Questo può essere realizzato con cromatografia liquida accoppiata con spettrometria di massa. Questa potente tecnica è utilizzata in molti laboratori clinici e di ricerca per la quantificazione dei metaboliti e può essere utilizzata per misurare le cinurenine.

Qui è presentato l'uso della cromatografia liquida accoppiata con una singola spettrometria di massa quadrupolo (LC-SQ) per la determinazione simultanea di quattro cinurenine, cioè cinurenina, 3-idrossichinurenina, acido 3-idrossiantranilico e xantiurenico nel mezzo raccolto da cellule tumorali coltivate in vitro. Il rilevatore SQ è semplice da usare e meno costoso rispetto ad altri spettrometri di massa. Nell'analisi SQ-MS, più ioni del campione vengono generati e separati in base al loro specifico rapporto massa-carica (m/z), seguito dal rilevamento utilizzando una modalità SIM (Single Ion Monitoring).

Questo documento richiama l'attenzione sui vantaggi del metodo riportato e indica alcuni punti deboli. Si concentra su elementi critici dell'analisi LC-SQ, inclusa la preparazione del campione insieme alla cromatografia e all'analisi della spettrometria di massa. Vengono inoltre discussi il controllo di qualità, le condizioni di calibrazione del metodo e i problemi relativi agli effetti della matrice. Abbiamo descritto una semplice applicazione della 3-nitrotirosina come uno standard analogico per tutti gli aaliti bersaglio. Come confermato da esperimenti con ovaie umane e cellule tumorali del seno, il metodo LC-SQ proposto genera risultati affidabili e può essere ulteriormente applicato ad altri modelli cellulari in vitro.

Introduction

La via della kynurenina (KP) è la principale via del catabolismo triptofano (Trp) nelle cellule umane. L'indoloammina-2,3-diossigenasi (IDO-1) nelle cellule extraepatiche è il primo e limitante enzima di KP e converte il Trp in N-formilchinurenina¹. Ulteriori passaggi all'interno di KP generano altri metaboliti secondari, vale a dire le cinurenine che mostrano varie proprietà biologiche. La cinurenina (Kyn) è il primo catabolita Trp stabile che mostra proprietà tossiche e regola gli eventi cellulari dopo il legame con il recettore degli idrocarburi arilici (AhR)². Successivamente, Kyn viene trasformato in diverse molecole spontaneamente o nei processi mediati dall'enzima, generando tali metaboliti come 3-idrossichinurenina (3HKyn), acido antranilico (AA), acido 3-idrossiantranilico (3-HAA), acido cinurenico (Kyna) e acido xanturenico (XA). Un altro metabolita a valle, 2-ammino-3-acido carbossimuconico-6-semialdeide (ACMS), subisce ciclizzazione non enzimatica in acido čolinico (QA) o acido picolinico (PA)¹. Infine, il QA viene ulteriormente trasformato in nicotinammide-adenina dinucleotide (NAD⁺)³, il metabolita del punto finale KP che è un importante cofattore enzimatico. Alcune kynurenine hanno proprietà neuroprotettive come Kyna e PA, mentre le altre, cioè 3HAA e 3HKyn, sono tossiche⁴. L'acido xantinonico, che si forma da 3HKyn, presenta proprietà antiossidanti e vasorelaxation⁵. XA si accumula nelle lenti che invecchiano e porta all'apoptosi delle cellule epiteliali⁶. KP, descritto a metà del XX secolo, ha^guadagnato maggiore attenzione quando è stato dimostrato il suo coinvolgimento in vari disturbi. L'aumento dell'attività di questa via metabolica e l'accumulo di alcune cinurenine modulano la risposta immunitaria e sono associate a diverse condizioni patologiche come depressione, schizofrenia, encefalopatia, HIV, demenza, sclerosi laterale amiotrofica, malaria, Alzheimer, malattia di Huntington e cancro^4,7. Alcuni cambiamenti nel metabolismo Trp si osservano nei microambientati tumorali e nelle^{cellule tumorali 2,8}. Inoltre, le cinurenine sono considerate marcatori di malattia promettenti⁹. Nella ricerca sul cancro, i modelli di coltura cellulare in vitro sono ben consolidati e ampiamente utilizzati per la valutazione preclinica delle risposte ai farmaci anticancro¹⁰. I metaboliti Trp sono secreti dalle cellule nel mezzo di coltura e possono essere misurati per valutare lo stato della via della cinurenina. Pertanto, è necessario sviluppare metodi appropriati per il rilevamento simultaneo del maggior numero possibile di metaboliti KP in una varietà di campioni biologici con un protocollo facile, flessibile e affidabile.

In questo articolo, descriviamo un protocollo per la determinazione simultanea di quattro metaboliti della via della cinurenina: Kyn, 3HKyn, 3HAA e XA da LC-SQ in un mezzo post-coltura raccolto dalle cellule tumorali. In un moderno approccio analitico, la cromatografia^{liquida 13,14,15,16} è preferita per il rilevamento simultaneo e la quantificazione dei singoli cataboliti di triptofano, a differenza dei saggi biochimici non specifici che utilizzano il reagente di Ehrlich^11,12. Attualmente, ci sono molti metodi disponibili per la determinazione delle cinurenine in campioni umani, principalmente basati sulla cromatografia liquida con rivelatori ultravioletti o a fluorescenza^13,17,18,19. La cromatografia liquida accoppiata con un rivelatore di spettrometria di massa (LC-MS) sembra più adatta per questo tipo di analisi, a causa della loro maggiore sensibilità (limiti inferiori di rilevamento), selettività e ripetibilità.

I metaboliti Trp sono già stati determinati nel siero umano, plasma e urina^{13,20,21,22,23}, tuttavia, sono desiderati anche i metodi per altri campioni biologici, come il mezzo di coltura cellulare. In precedenza, l'LC-MS era usato per composti derivati dal Trp in un mezzo raccolto dopo la coltura di cellule di glioma umano, monociti, cellule dendritiche o astrociti trattati con gamma di interferone (IFN-γ)^24,25,26. Attualmente, sono necessari nuovi protocolli convalidati che possono consentire una valutazione di diversi metaboliti in diversi mezzi di coltura, cellule e trattamenti utilizzati nei modelli di cancro.

Lo scopo del metodo sviluppato è quello di quantificare (all'interno di una serie analitica) quattro principali cinurenine che possono indicare anomalie in KP. Ecco le fasi critiche del nostro protocollo recentemente pubblicato per l'analisi quantitativa LC-SQ di alcune cinurenine significative selezionate utilizzando uno standard interno (3-nitrotirosina, 3NT) nel mezzo raccolto da cellule tumorali umane coltivate in vitro ²⁷. Per quanto ne siamo a conoscenza, è il primo protocollo LC-SQ per la quantificazione simultanea di 3HKyn, 3HAA, Kyn e XA in un mezzo di coltura ottenuto dalle cellule coltivate in vitro. Dopo alcune modifiche, il metodo potrebbe essere ulteriormente applicato per studiare i cambiamenti nel metabolismo Trp in una gamma più ampia di modelli di coltura cellulare.

Protocol

1. Preparazione di soluzioni standard standard 3NT, Kyn, 3HKyn, 3HAA, XA standard stock

1. Pesare i reagenti in una fiala con la massima precisione (0,3 mg ciascuno). Per una migliore precisione, scalare i reagenti, regolando il volume del solvente in base al passaggio 1.2.
2. Sciogliere i reagenti in 300 μL del solvente per ottenere una soluzione stock di 1 g/L. Sciogliere 3NT in acido formico 1% (v/v) (FA) in acqua; Kyn, 3HAA e XA in solfossido di dimetile (DMSO); 3HChin in acqua acidificata a pH 2,5 con acido cloridrico (HCl).
   ATTENZIONE: 3HAA irrita occhi, naso, gola e polmoni. È dannoso se inalato, a contatto con la pelle e se ingerito. Indossare una protezione appropriata, ad esempio guanti e maschera.
3. Chiudere saldamente il flaconcino e posizionarlo in un bagno ad ultrasuoni per 1 minuto per accelerare la dissoluzione.
   NOTA: Conservare le soluzioni stock a -20 °C e ridurre al minimo il congelamento/scongelamento (3 cicli al massimo) a causa dell'instabilità delle soluzioni stock.

2. Preparazione del mezzo di coltura trattato a carbone

1. In un tubo pesare 280 mg di carbone attivo e aggiungere 5 ml del mezzo liquido preparato per coltivare le cellule di interesse.
2. Agitare il tubo con il supporto e il carbone su un rocker a sega trasparente per 2 ore, a temperatura ambiente (impostare la velocità su 50 oscillazioni / min). Quindi, centrifugare i tubi a 6000 x g per 15 minuti.
3. Rimuovere il tubo dalla centrifuga e raccogliere con cura il supernatante senza disturbare il sedimento. Ripetere la centrifugazione, se necessario, per rimuovere tutti i residui di carbone.
4. Filtrare il supernatante utilizzando un filtro siringa da 0,45 μm.
5. Assicurarsi che il mezzo di coltura pretrattato a carbone sia privato delle tracce di cinurenine eseguendo un campione pilota su LC-MS come descritto al passaggio 6.3.2. In caso contrario, ripetere i passaggi 2.1-2.4.
   NOTA: Se il mezzo di coltura completo inizialmente non contiene cinurenine, la fase di purificazione con carbone potrebbe essere omessa. In questo caso, preparare standard di calibrazione e campioni di controllo qualità utilizzando il mezzo completo solitamente preparato per la coltivazione cellulare.
6. Conservare il mezzo preparato a 4 °C fino all'analisi.

3. Realizzare le soluzioni di calibrazione e le curve di calibrazione

1. A picco il mezzo di coltura pretrattato a carbone con 0,75 μL di soluzione 0,1 g/L 3NT e aggiungere quattro standard (3HKyn, 3HAA, Kyn, XA) almeno a sei diverse concentrazioni per coprire gli intervalli di calibrazione. Mantenere il volume finale di ciascun campione a 150 μL. Utilizzare tubi di centrifuga da 1,5 ml per la preparazione del campione.
   NOTA: Punti di calibrazione suggeriti per 3HKyn: 0,018, 0,045, 0,22, 1,12, 2,23, 4,46 μmol/L; per Kyn: 0,0096, 0,048, 0,24, 1,20, 2,40, 3,84 μmol/L; per 3HAA: 0,033, 0,16, 0,65, 3,27, 6,53, 13,06 μmol/L; per XA: 0,019, 0,13, 0,49, 1,22, 3,65, 4,87 μmol/L.
2. Aggiungere 150 μL di metanolo freddo (mantenuto a -20 °C) contenente l'1% (v/v) di acido formico in ciascun tubo per la deproteinizzazione del campione. Chiudere saldamente bene i tubi e il vortice.
3. Incubare i campioni a -20 °C per 40 min.
4. Centrifugare i campioni a 14.000 x g per 15 min a 4 °C. Rimuovere i tubi dalla centrifuga. Raccogli i supernatanti nei nuovi tubi. Non disturbare il sedimento.
5. Trasferire 270 μL del supernatante nel flaconcino di vetro utilizzando una pipetta automatica. Mettere le fiale nell'evaporatore ed evaporare delicatamente fino a quando non si asciuga. Utilizzare il programma appropriato per le frazioni acqua/metanolo per evaporare i componenti volatili. Non applicare temperature superiori a 40 °C ed evitare un'asciugatura troppo.
   NOTA: Le fiale di vetro a fondo piano, cioè le fiale cromatografiche facilitano un'evaporazione più rapida e recuperi più elevati rispetto ai tubi conici in plastica.
6. Dopo 30 minuti, controllare lo stato di evaporazione. Se necessario, continuare l'evaporazione (ad esempio, aggiungere altri 10 minuti). Evitare un'asciugatura troppo.
7. Rimuovere le fiale dall'evaporatore. Ricostituire ciascun campione in 60 μL dello 0,1% (v/v) di acido formico in acqua. Aggiungere il solvente nel flaconcino contenente il materiale residuo. Chiudere saldamente le fiale e il pozzo del vortice.
8. Trasferire il campione in un tubo da 1,5 ml e girare a 14.000 x g per 15 minuti a 4 °C per separare la proteina precipitata.
9. Senza disturbare il pellet proteico, trasferire i supernatinanti in flaconcini cromatografici con inserti in vetro conico con pipetta automatica. Chiudere saldamente le fiale.
10. Verificare la presenza di bolle d'aria nel flaconcino inserto e rimuoverle se necessario (ad esempio, mediante vortice).
11. Trasferire i flaconcini cromatografici contenenti campioni nell'autocampionatore LC. Registrare la posizione dei campioni inseriti in un vassoio di campionamento automatico.

4. Preparazione di campioni di controllo qualità (QC)

1. A picco il mezzo di coltura pretrattato a carbone (preparato in un tubo centrifugo da 1,5 ml) con 0,75 μL di soluzione 0,1 g/L 3NT e standard di quattro cinurenine (3HKyn, 3HAA, Kyn, XA) ad una concentrazione selezionata dall'intervallo lineare delle curve di taratura. Mantenere il volume finale del campione a 150 μL.
   NOTA: Se applicabile, preparare più campioni di QC a diverse concentrazioni che rientrano nell'intervallo lineare della curva di calibrazione.
2. Seguire il protocollo descritto nella sezione 3 (passaggi 3.2-3.11).

5. Configurazione del sistema LC-MS

1. Preparare i solventi di fase mobile: Solvente A: formato ammonio da 20 mmol/L in acqua ultrapura (pH 4.3 regolato con acido formico); Solvente B: acetonitrile al 100%.
   NOTA: Utilizzare solo bottiglie di vetro borosilicato. Risciacquare le bottiglie con acqua ultrapura prima di riempirle. Non utilizzare bottiglie pulite con detergenti.
   ATTENZIONE: Acetonitrile provoca gravi effetti sulla salute o morte. È facilmente infiammabile dal calore. Acetonitrile liquido e vapore possono irritare occhi, naso, gola e polmoni.
   1. Preparare 5 mol/L di soluzione stock di formato ammonio sciogliendo un reagente cristallino (15,77 g) in 50 ml di acqua ultrapura in una bottiglia di vetro. Mescolare fino a quando tutti i residui si dissolvono. Filtrare attraverso la membrana di 0,45 μm per rimuovere eventuali detriti residui (ad esempio, utilizzando un filtro per siringhe di nylon). Conservare la soluzione stock a 4 °C.
   2. Preparare il solvente A aggiungendo 4 ml di formato ammonio 5 mol/L in acqua a 980 ml di acqua ultrapura in una bottiglia di vetro ambrato e mescolare bene. Immergere una barra di agitazione e mettere la bottiglia con il solvente su un agitatore magnetico. Immergere un elettrodo di pH nella soluzione e controllare il pH sotto agitazione. Aggiungere la soluzione di stock di acido formico (98%-100%) dropwise utilizzando una pipetta automatica con punta da 0,2 mL per ottenere pH 4.3, regolare il volume fino a 1 L con acqua ultrapura e mescolare bene.
      NOTA: Preparare i solventi almeno una volta alla settimana per prevenire qualsiasi crescita microbica.
      ATTENZIONE: L'acido formico (FA) è tossico se inalato, provoca ustioni cutanee e danni agli occhi. Lavorare sotto la cappa dei fumi; indossare guanti protettivi e cappotto.
   3. Filtrare tutte le soluzioni attraverso la membrana da 0,22 μm (ad esempio, filtro siringa di nylon) per rimuovere eventuali detriti residui. Facoltativamente, utilizzare i filtri di ingresso del solvente dedicati ai serbatoi di solvente LC per proteggere il sistema dalle particelle in arrivo.
2. Avviare il software di controllo e acquisizione dati LC-MS.
3. Eliminare il sistema LC con la fase mobile per rimuovere le bolle e innescare tutti i canali del solvente.
4. Ensemble una colonna di guardia per proteggere la colonna analitica dall'intasamento.
5. Lavare la protezione e la colonna analitica (C18, 2,1 x 100 mm, 1,8 μm) con acetonitrile al 100% per circa 30 minuti, e quindi con solvente al 100% A fino a quando non si osserva una pressione stabile nella colonna. Controllare le prestazioni del sistema utilizzando il software di controllo.
6. Impostare i parametri LC appropriati nel software di acquisizione dati.
   1. Impostare il programma di gradiente: 0-8 min solvente B 0%; 8-17 min solvente B 0-2%; 17-20 min solvente B 2%; 20-32 min solvente B 10-30%; 32-45 min solvente B 0%.
   2. Impostare la portata di fase mobile a 0,15 mL/min, il tempo di esecuzione totale dell'analisi per 45 minuti, la temperatura della colonna a +40 °C e il volume di iniezione a 10 μL.
7. Impostate i parametri di acquisizione del rivelatore di spettrometria di massa.
   1. Applicare parametri di ionizzazione: monitoraggio ionica singola (SIM), ionizzazione positiva, pressione nebulizzatore di 50 psi, +350 °C temperatura del gas di essiccazione, flusso di gas di essiccazione di 12 L /min e tensione capillare di 5500 V.
   2. Selezionare gli ioni di monitoraggio degli aliti: per 3HKyn m/z 225.0 (periodo di scansione: 2-6 min, fragmentor voltage: 100 V); per Kyn m/z 209.0 (periodo di scansione: 6-12 min, tensione frammentaria: 80 V); per 3HAA m/z 154,0 (periodo di scansione: 12-18 min, tensione frammentaria: 80 V); per 3NT m/z 227,0 (periodo di scansione: 18-23 min, tensione frammentaria: 100 V); per XA m/z 206.0 (periodo di scansione: 23-45 min, tensione frammentaria: 100 V).
8. Costruire un worklist ed eseguire esempi nel sistema LC.
9. In un primo momento, prima dell'analisi dei campioni sperimentali, eseguire un campione vuoto (solvente A) almeno in triplicati, seguito da un campione di QC.
10. Aprire il software di analisi dei dati e caricare i risultati ottenuti per il campione qc.
11. Controllare la posizione dei picchi di aliti sul cromatogramma. Quando i segnali si spostano oltre la posizione prevista, regolare i cancelli del tempo per un'adeguata raccolta di segnali di aliti. Consultare il manuale del software per istruzioni sull'integrazione del segnale.

6. Costruire la curva di calibrazione

1. Nel software di acquisizione dati aggiungere standard di calibrazione nell'elenco di lavoro ed eseguire gli standard nei triplicati.
2. Integrare e misurare l'area di picco corrispondente a 3HKyn, Kyn, 3HAA, 3NT e XA al tempo di ritenzione di circa 4,4 min, 10 min, 16 min, 21 min e 30 min, rispettivamente.
3. Costruisci curve di calibrazione individuali per ogni metabolita utilizzando un programma di fogli di calcolo.
   1. Per creare il grafico di calibrazione, tracciare il valore per un rapporto tra l'area di picco dell'aalita sull'area di picco 3NT e la concentrazione dell'a analitico.
   2. Analizzare il campione vuoto (mezzo di coltura pretrattato a carbone puntato solo con 3NT) per assicurarsi che non vi sia traccia degli aliti studiati nel mezzo. In caso contrario, sottrarre il valore ottenuto da ogni punto di calibrazione.
   3. Controllare la linearità di ogni curva di calibrazione.
      1. Individualmente, per ogni a analitico, creare un'equazione lineare di intercetta di pendenza (y = ax +b), dove y corrisponde al rapporto tra l'area di picco dell'a analitico e l'area di picco 3NT, a è la pendenza, x è la concentrazione di a analitici (μmol/L), e b si riferisce all'intercetta della curva. Tracciando il grafico 'y' contro 'x' verrà generato la curva di calibrazione.
      2. Aggiungere una linea di tendenza lineare al grafico, visualizzare l'equazione della curva di calibrazione e il coefficiente di regressione nel grafico. Assicurarsi che il coefficiente di regressione sia > 0,990. In caso di standard di calibrazione non corrispondenti, prepararli e/o analizzarli ancora una volta. Facoltativamente, modificare l'intervallo di concentrazione della curva di calibrazione.
   4. Analizzare i campioni qc per verificare le prestazioni del sistema prima di analizzare i campioni sperimentali. In caso di incompatibilità (± 20% dal valore di riferimento), preparare le nuove curve di calibrazione.

7. Coltura cellulare in vitro e raccolta di campioni per l'analisi

1. Placcare le cellule tumorali studiate (MDA-MB-231 o SK-OV-3) in DMEM (Medium dell'Aquila Modificata di Dulbecco) contenenti 4,5 g/L di ᴅ-glucosio, 10% (v/v) siero bovino fetale (FBS), 2 mmol/L ʟ-glutammina e 1 U penicillina/streptomicina e coltura a 37 °C in un'atmosfera umidificata del 5% di CO₂ per espanderli per l'esperimento. Passare le cellule all'80% della confluenza.
2. Staccare le cellule dal piatto di coltura usando tripina, seme per l'esperimento su piastre a 12 po 'ad una densità di 0,3 × 10^{6 cellule} per pozzo e posto in un'incubatrice durante la notte.
3. Il giorno dopo, aspirare il mezzo di coltura e aggiungere DMEM fresco con o senza l'aggiunta dei composti studiati, a seconda del design sperimentale.
4. Dopo 48 ore, raccogliere il mezzo dall'alto delle cellule (circa 500 μL) in un tubo da 1,5 ml. Centrifuga a 14.000 x g per 5 minuti per rimuovere eventuali detriti cellulari. Raccogliere il supernatante e conservare a -80 °C fino all'analisi.
5. Salvare il pellet cellulare dal passaggio 7.4 per la stima delle proteine. Congelare i campioni a -20 °C.
   NOTA: I risultati ottenuti per un mezzo da pozzi diversi devono essere normalizzati al contenuto proteico totale per tenere conto della variabilità del numero di cellule nei singoli pozzi. La concentrazione proteica può essere valutata come descritto nella fase 9.

8. Preparare campioni per l'analisi LC-MS

1. Scongelare il campione congelato a temperatura ambiente e mescolare bene. Trasferire 149,25 μL del mezzo di coltura in un tubo di centrifugazione (1,5 ml).
2. Aggiungere 0,75 μL di 0,1 g/L di soluzione 3NT (standard interno). Chiudere bene i tubi e il vortice.
3. Aggiungere 150 μL di metanolo refrigerato a -20 °C contenente 1% (v/v) FA per la deproteinizzazione del campione. Chiudere bene i tubi e il vortice.
4. Continuare con la preparazione del campione come descritto nella sezione 3 (passaggi 3.3-3.11).
   NOTA: Alcune cellule tumorali come SK-OV-3 secernono grandi quantità di Kyn in un mezzo di coltura. Per inserire i dati in un intervallo lineare della curva di calibrazione, è necessaria una diluizione di circa 100 volte del campione. In questo caso, diluire una porzione del campione con 0,1% (v/v) FA in acqua e analizzare oltre al campione non diluito. I campioni di riferimento delle norme per la curva di taratura devono essere preparati in un terreno di coltura completo diluito 100 volte. In alternativa, aggiungere più punti nella curva di calibrazione (se si ottengono una corretta solubilità e linearità) per adattarlo al livello di concentrazione di Kyn nel campione sperimentale.
5. Analizzare i campioni per LC-MS come descritto nella sezione 5. Costruire un elenco di lavoro ed eseguire ogni esempio in triplice copia.
6. Una volta completato l'elenco di lavoro, misurare l'area di picco dell'alita.
7. Generare un foglio di calcolo utilizzando il software disponibile e ottenere dati numerici.
8. In una colonna del foglio di calcolo calcolare il rapporto dell'area di picco dell'alyte sull'area di picco 3NT.
9. Utilizzare una singola equazione di calibrazione lineare dedicata per ogni alita (dal passaggio 6.3.) per calcolare le concentrazioni di aliti presenti nei campioni sperimentali.

9. Valutazione del contenuto proteico e normalizzazione dei dati

1. Resopendare il pellet cellulare dal passaggio 7.5 con 100 μL di salina tamponata da fosfati (PBS) in tubo da 1,5 ml.
   NOTA: Preparare la soluzione di PBS sciogliendo 8 g di cloruro di sodio, 0,2 g di cloruro di potassio, 1,44 g di dibasico di fosfato di sodio, fosfato di diidrogeno di potassio in 950 mL di acqua ultrapura. Mescolare bene. Regolare il pH a 7,4 con acido cloridrico (dropwise). Regolare il volume fino a 1 L con acqua ultrapura. Mescolare bene fino a omogeneo.
   ATTENZIONE: L'acido cloridrico è altamente corrosivo e deve essere maneggiato con adeguate precauzioni di sicurezza. Il contatto con la pelle umana può causare arrossamento, dolore, ustioni cutanee. Lavorare sotto la cappa dei fumi; indossare guanti protettivi e cappotto.
2. Congelare i campioni a -20 °C e poi scongelarsi sul ghiaccio. Ripetere questo passaggio 3x.
3. Centrifugare i campioni a 14.000 x g per 15 min a 4 °C. Raccogli i supernatanti nei nuovi tubi. Non disturbare il pellet.
4. Diluire i supernatanti 10x con PBS.
5. Costruire una curva di calibrazione da 0 a 2 μg della proteina per intervallo di pozzi.
   1. Preparare la soluzione standard di albumina di siero bovino (BSA) per la calibrazione. Sciogliere 1,23 μg di BSA in 1 mL di acqua ultrapura e pozzo vortice.
   2. Su una piastra da 96 pozza, caricare diverse quantità di soluzione standard BSA (1,23 μg/mL): 0 μL, 2 μL, 4 μL, 5 μL, 7 μL, 10 μL, 15 μL, 20 μL.
   3. Riempire il pozzo con PBS al volume finale di 50 μL.
6. Caricare 10 - 15 μL di lire cellulare dal passo 9.4 sulla stessa piastra da 96 pozzi. Riempire i pozzi con PBS per raggiungere il volume finale di 50 μL.
   NOTA: Se necessario, regolare il volume dell'aliquota di lysate della cella in ogni pozzo per adattarlo all'intervallo lineare della curva di calibrazione. Mantenere il volume finale a 50 μL del campione per pozzo.
7. Aggiungere 200 μL di un reagente di Bradford (diluito 5 volte con acqua ultrapura) ad ogni pozzo.
8. Incubare il patè da 96 pozzi per almeno 5 minuti a temperatura ambiente. Inserire la piastra in un lettore di micropiastrine. Misurare l'assorbanza a λ = 595 nm.
9. Costruire una curva di calibrazione utilizzando un programma di foglio di calcolo. Tracciare la quantità di BSA (μg) rispetto all'assorbanza. Aggiungere una linea di tendenza lineare, visualizzare l'equazione della curva di calibrazione e il coefficiente di regressione nel grafico.
10. Usa l'equazione lineare (y = ax +b, dove y corrisponde all'assorbanza a λ = 595 nm, a è la pendenza, x è un contenuto proteico (μg), e b si riferisce all'intercetta della curva) per calcolare la quantità proteica nel campione.
    NOTA: si consideri un fattore di diluizione del campione nei calcoli.
11. Utilizzare il contenuto proteico stimato per normalizzare la quantità di cinurenina nel campione per 1 mg di proteine. Per fare questo, dividere la concentrazione di cinurenine determinata nella fase 8.9 con il contenuto proteico totale dal passo 9.10.

Results

LC-MS presenta indiscutibili vantaggi nella quantificazione di molecole biologicamente attive, anche se alcuni componenti di campioni complessi causano i cosiddetti effetti matriciali e compromettono la ionizzazione degli aaliti. Porta alla soppressione degli ioni o al miglioramento degli ioni, diminuendo fortemente l'accuratezza e influenzando un limite di rivelazione /quantificazione della LC-MS, che è considerato un punto "debole" del metodo. Nel nostro protocollo, gli ioni sono generati dalla ionizzazione elettrospra...

Discussion

Questo documento presenta un protocollo dettagliato LC-SQ per la quantificazione simultanea di quattro principali metaboliti Trp (3HKyn, Kyn, 3HAA, XA) che vengono misurati in un mezzo da cellule tumorali umane coltivate in vitro. Particolare attenzione è rivolta alla preparazione del campione, alla procedura cromatografica/spettrometrica di massa e all'interpretazione dei dati, i punti più importanti all'interno dell'analisi.

In generale, l'analisi LC-MS, a causa dell'elevata sensibi...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-idrossi-DL-kynurenina	Sigma-Aldrich	H1771
acido 3-idrossiantranrilico	Sigma-Aldrich	148776	97%
3-nitro-L-tirosina	Sigma-Aldrich	N7389
acetonitrile	Supelco	1.00029	ipergrado per LC-MS LiChrosolv
Carbone attivo	Supelco	05105	polvere
Bilancia analitica	Ohaus
Colonna analitica	Agilent Technologies	959764-902	Zorbax Eclipse Plus C18 a risoluzione rapida HT (2,1 x 100 mm, 1,8 &; m)
Formiato di ammonio	Supelco	7022	additivo eluente per LC-MS, LiChropur, ≥ 99,0%
Siero bovino Albumina	Sigma	1001887398
Tappi per fiale cromatografiche	Agilent Technologies	5185-5820	tappi a vite blu, PTFE/sil sepa rosso
Piatto per colture cellulari	Nido	704004	polistirene, non pirogeno, sterile
Piastra per colture cellulari	Biologix	07-6012	12 pozzetti, non pirogeno, non citotossico, sterille
Incubatore cellulare	Thermo Fisher Scientific		HERAcell 150i Cu
Centrifuga	Eppendorf		modello 5415R
Centrifuga	Eppendorf		modello 5428
Provette da centrifuga	Bionovo	B-2278	Tipo Eppendorf, 1,5 mL
Provette da centrifuga	Bionovo	B-3693	Tipo Falcon, 50 mL, PP
Dati cromatografici software di acquisizione e analisi	Agilent Technologies		LC/MSD ChemStation (B.04.03-S92)
Fiale con inserto cromatografico	Agilent Technologies	9301-1387	100 &;
L Fiale cromatografiche	Agilent Technologies	5182-0714	2 mL, vetro trasparente
Dimetil solfossido	Supelco	1.02950	Uvasol
Dubelcco' s Aquila modificata' s Medium (DMEM)	PAN Biotech	P04-41450
Doppio misuratore di pH/conducibilità	Mettler Toledo		SevenMulti
Evaporator	Genevac		modello EZ-2.3 Elite
Siero fetale bovino	Sigma-Aldrich	F9665
Acido formico	Supelco	5.33002	per LC-MS LiChropur
Flacone di vetro per la conservazione dei	reagentiBionovo	S-2070	50 mL, vetro trasparente
Colonna di protezione	Agilent Technologies	959757-902	Zorbax Eclipse Plus-C18 Colonna di protezione a foro stretto (2,1 x 12,5 mm, 5 &; m)
Acido cloridrico	Merck	1.00317.1000
L-chinurenina	Sigma-Aldrich	K8625	≥ 98% (HPLC)
Agitatore magnetico	Wigo		ES 21 H
Microbilancia	Mettler Toledo		modello XP6
Sistema Milli-Q	Millipore	ZRQSVPO30	Direct-Q 3 UV con pompa
Spettrometro di massa a quadrupolo	Agilent Technologies	G1948B	modello 6120
Penicillina-Streptomicina	Sigma-Adrich	048M4874V
Lettore di piastre	Bio Tek		Synergy 2 gestito da Gen5
Cloruro di potassio	Merck	1.04936.1000
Diidrogeno fosfato di potassio	Merck	1.05108.0500
Dosaggio delle proteine Concentrato di colorante	BioRad	500-0006
Bilanciere altalenante	Stuart	SSL4
Pipetta sierologica	Nest	326001	5 mL, polistirene, apirogeno, sterile
Cloruro di sodio	Sigma-Aldrich	7647-14-5
Fosfato di sodio bibasico	Merck	1.06346.1000
Filtro di ingresso solvente	Agilent Technologies	5041-2168	filtro in vetro, 20 &; m dimensione dei pori
Serbatoio del solvente (per LC-MS)	Agilent Technologies	9301-6524	1 L, vetro trasparente
Serbatoio del solvente (per LC-MS)	Agilent Technologies	9301-6526	1 L, vetro ambrato
Programma per fogli di calcolo	Microsoft Office		Microsoft Office Excel
Agitatore	Bionovo	6-2003	rivestito in teflon
Filtri per siringhe per coltura media filtrazione	Bionovo	7-8803	cellulosa rigenerata, Ø 30 mm, 0,45µ m
Filtri per siringhe per la filtrazione di componenti in fase mobile	Bionovo	6-0018	nylon, Ø 30 mm, 0,22 &; m
Piastre per coltura tissutale	VWR	10062-900	96 pozzetti, soluzione sterille
di tripsina-EDTA	Sigma-Aldrih	T4049-100 mL
Sistema di cromatografia liquida ad altissime prestazioni	Agilent Technologies	G1367D, G1379B, G1312B, G1316C	Il sistema 1200 Infinity era composto da autocampionatore (G1367D), degasatore (G1379B), pompa binaria (G1312B), termostato a colonna (G1316C)
Bagno ad ultrasuoni	Polsonic	104533	modello 6D
Vortex	Biosan		modello V-1 più
acido xanturenico	Sigma-Aldrich	D120804	96%