Quantificazione simultanea di kynurenine selezionate analizzate dalla cromatografia liquida-spettrometria di massa in mezzo raccolto da colture cellulari tumorali

Summary

Qui descritto è un protocollo per la determinazione di quattro diversi metaboliti del triptofano generati nella via della cinurenina (cinurenina, 3-idrossichinurenina, acido xanturenico, acido 3-idrossiantranilico) nel mezzo raccolto dalle colture cellulari tumorali analizzate dalla cromatografia liquida accoppiata con una singola spettrometria di massa quadrupolo.

Abstract

La via della cinurenina e i cataboliti di triptofano chiamati kynurenine hanno ricevuto una maggiore attenzione per il loro coinvolgimento nella regolazione immunitaria e nella biologia del cancro. Un saggio di coltura cellulare in vitro viene spesso utilizzato per conoscere il contributo di diversi cataboliti di triptofano in un meccanismo di malattia e per testare strategie terapeutiche. Il mezzo di coltura cellulare ricco di metaboliti secreti e molecole di segnalazione riflette lo stato del metabolismo del triptofano e di altri eventi cellulari. Si desidera nuovi protocolli per la quantificazione affidabile di più cinurenine nel mezzo di coltura cellulare complesso per consentire un'analisi affidabile e rapida di più campioni. Questo può essere realizzato con cromatografia liquida accoppiata con spettrometria di massa. Questa potente tecnica è utilizzata in molti laboratori clinici e di ricerca per la quantificazione dei metaboliti e può essere utilizzata per misurare le cinurenine.

Qui è presentato l'uso della cromatografia liquida accoppiata con una singola spettrometria di massa quadrupolo (LC-SQ) per la determinazione simultanea di quattro cinurenine, cioè cinurenina, 3-idrossichinurenina, acido 3-idrossiantranilico e xantiurenico nel mezzo raccolto da cellule tumorali coltivate in vitro. Il rilevatore SQ è semplice da usare e meno costoso rispetto ad altri spettrometri di massa. Nell'analisi SQ-MS, più ioni del campione vengono generati e separati in base al loro specifico rapporto massa-carica (m/z), seguito dal rilevamento utilizzando una modalità SIM (Single Ion Monitoring).

Questo documento richiama l'attenzione sui vantaggi del metodo riportato e indica alcuni punti deboli. Si concentra su elementi critici dell'analisi LC-SQ, inclusa la preparazione del campione insieme alla cromatografia e all'analisi della spettrometria di massa. Vengono inoltre discussi il controllo di qualità, le condizioni di calibrazione del metodo e i problemi relativi agli effetti della matrice. Abbiamo descritto una semplice applicazione della 3-nitrotirosina come uno standard analogico per tutti gli aaliti bersaglio. Come confermato da esperimenti con ovaie umane e cellule tumorali del seno, il metodo LC-SQ proposto genera risultati affidabili e può essere ulteriormente applicato ad altri modelli cellulari in vitro.

Introduction

La via della kynurenina (KP) è la principale via del catabolismo triptofano (Trp) nelle cellule umane. L'indoloammina-2,3-diossigenasi (IDO-1) nelle cellule extraepatiche è il primo e limitante enzima di KP e converte il Trp in N-formilchinurenina¹. Ulteriori passaggi all'interno di KP generano altri metaboliti secondari, vale a dire le cinurenine che mostrano varie proprietà biologiche. La cinurenina (Kyn) è il primo catabolita Trp stabile che mostra proprietà tossiche e regola gli eventi cellulari dopo il legame con il recettore degli idrocarburi arilici (AhR)². Successivamente, Kyn viene trasformato in diverse molecol....

Protocol

1. Preparazione di soluzioni standard standard 3NT, Kyn, 3HKyn, 3HAA, XA standard stock

1. Pesare i reagenti in una fiala con la massima precisione (0,3 mg ciascuno). Per una migliore precisione, scalare i reagenti, regolando il volume del solvente in base al passaggio 1.2.
2. Sciogliere i reagenti in 300 μL del solvente per ottenere una soluzione stock di 1 g/L. Sciogliere 3NT in acido formico 1% (v/v) (FA) in acqua; Kyn, 3HAA e XA in solfossido di dimetile (DMSO); 3HChin in acqua acidificata a pH 2,5 con acido cloridrico (HCl).
   ATTENZIONE: 3HAA irrita occhi, naso, gola e polmoni. È dannoso se inalato, a contatto con la pelle e se ingerito. Indossare....

Results

LC-MS presenta indiscutibili vantaggi nella quantificazione di molecole biologicamente attive, anche se alcuni componenti di campioni complessi causano i cosiddetti effetti matriciali e compromettono la ionizzazione degli aaliti. Porta alla soppressione degli ioni o al miglioramento degli ioni, diminuendo fortemente l'accuratezza e influenzando un limite di rivelazione /quantificazione della LC-MS, che è considerato un punto "debole" del metodo. Nel nostro protocollo, gli ioni sono generati dalla ionizzazione elettrospra.......

Discussion

Questo documento presenta un protocollo dettagliato LC-SQ per la quantificazione simultanea di quattro principali metaboliti Trp (3HKyn, Kyn, 3HAA, XA) che vengono misurati in un mezzo da cellule tumorali umane coltivate in vitro. Particolare attenzione è rivolta alla preparazione del campione, alla procedura cromatografica/spettrometrica di massa e all'interpretazione dei dati, i punti più importanti all'interno dell'analisi.

In generale, l'analisi LC-MS, a causa dell'elevata sensibi.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-idrossi-DL-kynurenina	Sigma-Aldrich	H1771
acido 3-idrossiantranrilico	Sigma-Aldrich	148776	97%
3-nitro-L-tirosina	Sigma-Aldrich	N7389
acetonitrile	Supelco	1.00029	ipergrado per LC-MS LiChrosolv
Carbone attivo	Supelco	05105	polvere
Bilancia analitica	Ohaus
Colonna analitica	Agilent Technologies	959764-902	Zorbax Eclipse Plus C18 a risoluzione rapida HT (2,1 x 100 mm, 1,8 &; m)
Formiato di ammonio	Supelco	7022	additivo eluente per LC-MS, LiChropur, ≥ 99,0%
Siero bovino Albumina	Sigma	1001887398
Tappi per fiale cromatografiche	Agilent Technologies	5185-5820	tappi a vite blu, PTFE/sil sepa rosso
Piatto per colture cellulari	Nido	704004	polistirene, non pirogeno, sterile
Piastra per colture cellulari	Biologix	07-6012	12 pozzetti, non pirogeno, non citotossico, sterille
Incubatore cellulare	Thermo Fisher Scientific		HERAcell 150i Cu
Centrifuga	Eppendorf		modello 5415R
Centrifuga	Eppendorf		modello 5428
Provette da centrifuga	Bionovo	B-2278	Tipo Eppendorf, 1,5 mL
Provette da centrifuga	Bionovo	B-3693	Tipo Falcon, 50 mL, PP
Dati cromatografici software di acquisizione e analisi	Agilent Technologies		LC/MSD ChemStation (B.04.03-S92)
Fiale con inserto cromatografico	Agilent Technologies	9301-1387	100 &;
L Fiale cromatografiche	Agilent Technologies	5182-0714	2 mL, vetro trasparente
Dimetil solfossido	Supelco	1.02950	Uvasol
Dubelcco' s Aquila modificata' s Medium (DMEM)	PAN Biotech	P04-41450
Doppio misuratore di pH/conducibilità	Mettler Toledo		SevenMulti
Evaporator	Genevac		modello EZ-2.3 Elite
Siero fetale bovino	Sigma-Aldrich	F9665
Acido formico	Supelco	5.33002	per LC-MS LiChropur
Flacone di vetro per la conservazione dei	reagentiBionovo	S-2070	50 mL, vetro trasparente
Colonna di protezione	Agilent Technologies	959757-902	Zorbax Eclipse Plus-C18 Colonna di protezione a foro stretto (2,1 x 12,5 mm, 5 &; m)
Acido cloridrico	Merck	1.00317.1000
L-chinurenina	Sigma-Aldrich	K8625	≥ 98% (HPLC)
Agitatore magnetico	Wigo		ES 21 H
Microbilancia	Mettler Toledo		modello XP6
Sistema Milli-Q	Millipore	ZRQSVPO30	Direct-Q 3 UV con pompa
Spettrometro di massa a quadrupolo	Agilent Technologies	G1948B	modello 6120
Penicillina-Streptomicina	Sigma-Adrich	048M4874V
Lettore di piastre	Bio Tek		Synergy 2 gestito da Gen5
Cloruro di potassio	Merck	1.04936.1000
Diidrogeno fosfato di potassio	Merck	1.05108.0500
Dosaggio delle proteine Concentrato di colorante	BioRad	500-0006
Bilanciere altalenante	Stuart	SSL4
Pipetta sierologica	Nest	326001	5 mL, polistirene, apirogeno, sterile
Cloruro di sodio	Sigma-Aldrich	7647-14-5
Fosfato di sodio bibasico	Merck	1.06346.1000
Filtro di ingresso solvente	Agilent Technologies	5041-2168	filtro in vetro, 20 &; m dimensione dei pori
Serbatoio del solvente (per LC-MS)	Agilent Technologies	9301-6524	1 L, vetro trasparente
Serbatoio del solvente (per LC-MS)	Agilent Technologies	9301-6526	1 L, vetro ambrato
Programma per fogli di calcolo	Microsoft Office		Microsoft Office Excel
Agitatore	Bionovo	6-2003	rivestito in teflon
Filtri per siringhe per coltura media filtrazione	Bionovo	7-8803	cellulosa rigenerata, Ø 30 mm, 0,45µ m
Filtri per siringhe per la filtrazione di componenti in fase mobile	Bionovo	6-0018	nylon, Ø 30 mm, 0,22 &; m
Piastre per coltura tissutale	VWR	10062-900	96 pozzetti, soluzione sterille
di tripsina-EDTA	Sigma-Aldrih	T4049-100 mL
Sistema di cromatografia liquida ad altissime prestazioni	Agilent Technologies	G1367D, G1379B, G1312B, G1316C	Il sistema 1200 Infinity era composto da autocampionatore (G1367D), degasatore (G1379B), pompa binaria (G1312B), termostato a colonna (G1316C)
Bagno ad ultrasuoni	Polsonic	104533	modello 6D
Vortex	Biosan		modello V-1 più
acido xanturenico	Sigma-Aldrich	D120804	96%