Immunolocalizzazione fluorescente delle proteine arabinogalactane e delle pectine nella parete cellulare dei tessuti vegetali

Sommario

Questo protocollo descrive in dettaglio come viene fissato il materiale vegetale per l'immunolocalizzazione delle proteine arabinogalactane e delle pectine, incorporato in una resina acrilica idrofila, sezionale e montato su vetrini. Mostriamo che gli epitopi correlati alla parete cellulare verranno rilevati con anticorpi specifici.

Abstract

Lo sviluppo dell'impianto comporta regolazioni costanti della composizione e della struttura della parete cellulare in risposta a stimoli sia interni che esterni. Le pareti cellulari sono composte da cellulosa e polisaccaridi non cellulosici insieme a proteine, composti fenolici e acqua. Il 90% della parete cellulare è composto da polisaccaridi (ad esempio, pectine) e proteine arabinogalactane (ARP). L'immunolocalizzazione fluorescente di specifici epitopi glicani nelle sezioni istologiche vegetali rimane uno strumento chiave per scoprire il rimodellamento delle reti, della struttura e dei componenti del polisaccaride delle pareti.

Qui, segnalamo una procedura di immunolocalizzazione fluorescente ottimizzata per rilevare epitopi glicani da ARP e pectine nei tessuti vegetali. La fissazione della paraformaldeide/glutaraldeide è stata utilizzata insieme all'incorporamento LR-White dei campioni vegetali, consentendo una migliore conservazione della struttura e della composizione dei tessuti. Sezioni sottili dei campioni incorporati ottenuti con un ultra-microtomo sono state utilizzate per l'immunolocalizzazione con anticorpi specifici. Questa tecnica offre grande risoluzione, alta specificità e la possibilità di rilevare più epitopi glicani nello stesso campione. Questa tecnica consente la localizzazione subcellulare dei glicani e rileva il loro livello di accumulo nella parete cellulare. Consente inoltre la determinazione dei modelli spazio-temporali di distribuzione dell'AGP e della pectina durante i processi di sviluppo. L'uso di questo strumento può in ultima analisi guidare le direzioni di ricerca e collegare i glicani a funzioni specifiche nelle piante. Inoltre, le informazioni ottenute possono integrare gli studi biochimici e di espressione genica.

Introduzione

Le pareti delle cellule vegetali sono strutture complesse composte da polisaccaridi e glicoproteine. Le pareti cellulari sono strutture estremamente dinamiche la cui architettura, organizzazione e composizione variano a seconda del tipo di cella, della localizzazione, dello stadio di sviluppo, degli stimoli esterni e interni^1. Le proteine arabinogalactane (ARP) e le pectine sono componenti importanti della parete cellulare della pianta. Gli ARP sono proteine altamente glicosilate e le pectine sono polisaccaridi omogalattivonan la cui composizione, quantità e struttura variano notevolmente durante le diverse fasi di sviluppo delle

Protocollo

1. Preparazione del campione: fissazione, disidratazione e incorporamento LR-White

1. Fissazione e disidratazione
   NOTA: il processo di fissazione è fondamentale per preservare il campione; incrociando le molecole il metabolismo cellulare viene interrotto, garantendo l'integrità cellulare e prevenendo la diffusione molecolare. Gli agenti fissivi e la concentrazione utilizzata devono essere adeguati a tale scopo, lasciando gli antigeni sufficientemente esposti per interagire con gli anticorpi. Il seguente protocollo combina la lieve capacità fissativa della paraformaldeide, con l'effetto più forte della glutaraldeide. Le loro proporzioni sono ....

Risultati

In un esperimento riuscito, l'anticorpo secondario intaserà specificamente la posizione dell'epitopo specifico in verde brillante, in modo coerente, consentendo la caratterizzazione della composizione della parete cellulare in una certa fase di sviluppo della cellula, del tessuto o dell'organo. Ad esempio l'anticorpo LM6 ha un'alta affinità per 1,5-arabinan, un composto con rhamnogalacturonan di tipo I che può essere trovato abbondantemente etichettando la parete cellulare dell'anther Quercus suber in via di svi.......

Discussione

Il metodo di immunolocalizzazione fluorescente nelle piante qui descritto, sebbene perfettamente semplice, si basa sul successo di diversi piccoli passaggi. Il primo dei quali è la preparazione e la fissazione del campione. Durante questo primo passaggio, una miscela di formaldeide e glutaraldeide viene utilizzata per collegare la maggior parte dei componenti cellulari. La formaldeide nella soluzione fornisce una fissazione lieve e reversibile mentre la glutaraldeide fornisce un forte collegamento più permanente; l'equil.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
25% (p/v) Gluteraldeide	Agar Scientific	AGR1010	aq. Soluzione priva di metanolo
8 pozzetti Vetrini di reazione	Marinfeld	MARI1216750	altre marche possono essere utilizzati
Acido acetico	Sigma-Aldrich	A6283
Anti-Rat IgG (molecola di wole)-FITC anticorpo prodotto in GOAT	Sigma-Aldrich	F6258
vetrini coprioggetti, 24 mm x 50 mm	Marinfeld	MARI0100222	Il vetrino coprioggetto deve coprire tutti i pozzetti. Possono essere utilizzate altre marche
ddH2O	na	Etanolo
assoluto	na	na
Brillantante fluorescente 28	Sigma-Aldrich	F-6259
Capsule di gelatina	Agar scientific	AGG29211	La dimensione della capsula deve adattarsi alla dimensione del campione.
Fiale di vetro	possono		essere utilizzate tutte le fiale di vetro semplici ed economiche che possono essere sigillate. Le fiale possono essere pulite con etanolo al 96% dopo l'uso per rimuovere i residui di LR-White e riutilizzate.
La resina incorporante di grado medio LR-white	Agar Scientific	AGR1281	LR-White è disponibile in diverse forme; il grado medio fornisce un supporto di taglio adeguato per la maggior parte dei tessuti, mentre per i tessuti più duri può essere raccomandato un grado più duro di LR-white. Se possibile utilizzare una resina già miscelata con l'attivatore di polimerizzazione (perossido di benzoile), in caso contrario seguire le istruzioni del fornitore per preparare la resina.
Latte in polvere scremato	Nestlé	na	qualsiasi latte in polvere scremato è adeguato
Forno	na	na forno	da laboratorio generico
Piastra di Petri, 10 cm x 10 cm quadrato	na	na
TUBI	Sigma Aldrich	P1851
Rat generato Monoclonale Anti-Body	Plant sonde	na	Diversi anticorpi che riconoscono i componenti della parete cellulare sono disponibili sia presso il Complex Carbohydrate research center (CCRC, Georgia University USA) che presso Plant Probes (Paul Knox Cell Wall Lab, presso l'Università di Leeds UK). Un breve elenco di alcuni MAB comunemente usati e dove possono essere acquistati è presentato nella Tabella supplementare 1
Lamette da barba	e		lamette da barba regolari
SDS	Sigma-Aldrich	L6026
Toluidina Blue-O	Agar Scientific	AGR1727
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416
Ultramicrotome	Leica Microsystems	UC7
Microscopio verticale per epifluorescenza con filtri a fluorescenza UV e FITC	Leica Mycrosistems	DMLb
Camera a vuoto	per
pompa a vuoto	per
Vectashield	vecta Labs	T-1000	Possono essere utilizzati altri anti-sbiadimento. Si prega di verificare la compatibilità con FITC e il brillantante fluorescente 28. (Nota: per un'alternativa non commerciale, (vedi Jonhson et al 198218) Un mezzo anti-sbiadimento può essere prodotto mescolando 25 mg/mL di 1,4-diazobiciclo-(2,2,2)ottano (DABCO) in glicerolo 9:1 (v/v) a 1xPBS. Regolare il pH a 8,6 con HCl diluito.)