Articolo metodologico

Utilizzo della citometria a flusso per rilevare e quantificare la formazione di sangue alterato nel pesce zebra in via di sviluppo

DOI:

10.3791/61035

⸱

29 aprile 2021

 , 
1Department of Biological Sciences, California State University, Chico

In questo articolo

Sommario

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Questo saggio è un metodo semplice per quantificare le cellule ematopoietiche nello sviluppo di zebrafish embrionali. Le cellule del sangue di zebrafish dissociate sono sottoposte ad analisi citometriche a flusso. Ciò consente di rilevare difetti del sangue negli animali mutanti e dopo la modificazione genetica.

Abstract

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La diversità dei lignaggi cellulari che comprendono sangue maturo negli animali vertebrati deriva dalla differenziazione delle cellule staminali ematopoietiche e progenitrici (HSPC). Questo è un processo critico che si verifica per tutta la durata della vita degli organismi, e l'interruzione delle vie molecolari coinvolte durante l'embriogenesi può avere conseguenze catastrofiche a lungo termine. Per una moltitudine di motivi, il pesce zebra (Danio rerio) è diventato un organismo modello per studiare l'ematopoiesi. Gli embrioni di zebrafish si sviluppano esternamente e entro 7 giorni la postfertilizzazione (dpf) ha prodotto la maggior parte dei sottotipi di cellule del sangue definitive che persisteranno per tutta la vita. Sono stati sviluppati saggi per valutare il numero di cellule ematopoietiche, utilizzando principalmente specifiche macchie istologiche, tecniche di ibridazione in situ e microscopia di animali transgenici che utilizzano promotori specifici delle cellule del sangue che guidano l'espressione di proteine fluorescenti. Tuttavia, la maggior parte dei saggi di colorazione e delle tecniche di ibridazione in situ non quantificano accuratamente il numero di cellule del sangue presenti; solo grandi differenze nei numeri di cella sono facilmente visualizzabili. È possibile eseguire l'utilizzo di animali transgenici e l'analisi di individui con microscopia fluorescente o confocale, ma la quantificazione di questi test si basa sul conteggio manuale o sull'utilizzo di costosi software di imaging, entrambi in grado di commetti errori. Lo sviluppo di metodi aggiuntivi per valutare il numero di cellule del sangue sarebbe economico, più veloce e potrebbe anche essere automatizzato per valutare rapidamente l'effetto della modificazione genetica mediata dalla CRISPR, la riduzione della trascrizione mediata dal morfolino e l'effetto dei composti farmacologici che influenzano l'ematopoiesi su larga scala. Questo nuovo saggio per quantificare le cellule del sangue viene eseguito dissociando interi embrioni di zebrafish e analizzando la quantità di cellule del sangue etichettate fluorescentmente presenti. Questi test dovrebbero consentire la spiegazione delle vie molecolari responsabili della generazione, dell'espansione e della regolazione delle cellule del sangue durante l'embriogenesi, che consentirà ai ricercatori di scoprire ulteriormente nuovi fattori alterati durante le malattie del sangue, nonché percorsi essenziali durante l'evoluzione dell'ematopoiesi dei vertebrati.

Introduzione

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La produzione di sangue (ematopoiesi) è un processo di sviluppo essenziale che inizia per la prima volta nell'embrione precoce. Questo processo inizia generando globuli rossi primitivi e macrofagi direttamente dal mesoderma, e successivamente si sposta verso la produzione di cellule staminali ematopoietiche e progenitrici (HSPC). Queste cellule staminali, che sono multipotenti, generano tutte le varietà di cellule del sangue mature nell'organismo. In grado di auto-rinnovarsi, il sistema viene continuamente rifornito attraverso questi HSPC. Mentre questo processo inizia all'inizio dello sviluppo, l'ematopoiesi continua per la vita dell'animale, fornendo la capacità di trasportare ossigeno in siti lontani del corpo, di fermare il sanguinamento dopo la lesione e di proteggere il corpo dall'infezione. Lo sviluppo di questo complesso sistema è controllato temporaneamente e spazialmente durante lo sviluppo e qualsiasi perturbazione nella produzione di cellule del sangue può essere catastrofica per l'organismo, con conseguente anemia, trombocitopenia, leucopenia e leucemia.

Un modello animale popolare utilizzato per la ricerca ematopoietica è il pesce zebra (Danio rerio) perché hanno uno sviluppo del sangue simile rispetto all'uomo. Infatti, molti dei geni e delle vie molecolari utilizzate durante l'ematopoiesi sono conservati in tutta l'evoluzione dei vertebrati, permettendoci di conoscere i geni umani studiando il pesce zebra. È importante sottolineare che gli embrioni di zebrafish si sviluppano al di fuori del corpo ed entro 7 giorni hanno generato la maggior parte dei tipi di cellule del sangue mature, consentendo la visualizzazione diretta del sistema ematopoietico in breve tempo. Gli zebrafish sono anche estremamente fecondi, il che consente ai ricercatori di osservare un numero maggiore di campioni in un breve lasso di tempo, che è anche importante per generare dati riproducibili. Il tempo di breve generazione e lo sviluppo esterno del pesce zebra facilitano la manipolazione e l'osservazione durante gli studi di mutagenesi1,2,3,4,5 e lo screeningfarmacologico 6,7,8,9,10. Ciò consente di testare in modo rapido ed efficiente un pannello di composti terapeutici promettenti per i disturbi del sangue umano.

È importante sottolineare che anche i pesci zebra sono geneticamente suscettibili e il genoma viene sequenziato e annotato. Questa trattabilità consente di eseguire tecniche di genetica inversa come la knockdown mediata da morfolino- (MO-) e l'ablazione genetica mediata da CRISPR. Zebrafish ha anche dimostrato la sua utilità come modello per eseguire schermi genetici in avanti; molti geni e percorsi essenziali coinvolti nella formazione del sangue dei vertebrati sono stati scoperti in questo modo. Numerosi metodi di osservazione delle cellule del sangue sono stati sviluppati anche nel pesce zebra. Mentre esistono tecniche di colorazione istologica tradizionali, è anche possibile eseguire l'ibridazione in situ per trascrizioni specifiche del sangue. È importante sottolineare che esistono anche numerose linee transgeniche di pesci in cui le proteine fluorescenti sono espresse da promotori specifici del lignaggio, consentendo l'etichettatura di cellule del sangue specifiche con proteinefluorescenti 11. Ciò consente ai ricercatori di eseguire un'osservazione fino al minuto della genesi, dell'espansione e della regolazione delle cellule del sangue in un organismo vivente nel tempo.

Nel complesso, la conservazione del sistema ematopoietico, la presenza e il facile sviluppo di linee transgeniche, la facile visualizzazione e il tempo di breve generazione hanno reso il pesce zebra un modello economico, veloce e adattabile di ematopoiesi. Per migliorare la cassetta degli attrezzi delle tecniche disponibili per i ricercatori di zebrafish, abbiamo sviluppato questo saggio per quantificare saldamente il numero di cellule del sangue negli embrioni. Il metodo prevede la digestione di animali transgenici e l'esecuzione della citometria a flusso per le cellule del sangue fluorescenti. In questo modo, le cellule del sangue di animali mutanti, l'effetto della modifica MO e CRISPR e l'effetto di piccole molecole possono essere analizzati quantitativamente in modo rapido e riproducibile. Questi test sono modi intuitivi ed economici per enumerare le cellule del sangue, consentendo l'esame della loro generazione, proliferazione e manutenzione nel tempo.

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Protocollo

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Il comitato consultivo institutional animal care and use committee (IACUC) della California State University di Chico ha approvato tutti i metodi descritti di seguito.

NOTA: Si consiglia di trattare embrioni con 1-fenil 2-tiourea (PTU; Tabella 1) La commissione per l' a 24 ore di postfertilizzazione (hpf) per prevenire la pigmentazione che influisce negativamente sulla discriminazione della fluorescenza per citometria del flusso. Tutte le procedure elencate di seguito sono accettabili per la citometria del flusso e lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS). Tuttavia, se il proprio obiettivo è quello di coltura delle cellule ematopoietiche dopo FACS, aderire a pratiche sterili durante l'elaborazione dei campioni. Il protocollo per lo sbiancamento e la preparazione di campioni di embrioni in modo sterile è stato descritto inprecedenza 12.

1. Dechorionation di 48 embrioni di zebrafish hpf

  1. Con embrioni (almeno 5, ma non più di 200 embrioni) in una piastra di Petri di plastica di 10 cm, inclinare la piastra in modo che gli embrioni affondino sul bordo inferiore.
    NOTA: È facile inclinare la piastra rimuovendo il coperchio e posizionando il coperchio sotto un bordo della piastra di Petri.
  2. Rimuovere e scartare il maggior numero possibile di mezzi E3 (tabella1)e aggiungere 500 μL di proteasi di decorrionazione (10 mg/mL). Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti.
  3. Dopo 5 minuti, raccogliere la piastra di Petri (mantenendo tutti gli embrioni sul bordo inferiore del piatto) e toccare delicatamente il lato della piastra di Petri, consentendo agli embrioni di strofinare delicatamente contro il fondo del piatto per rimuovere completamente i coriaci.
  4. Con una bottiglia spremuta, aggiungere ~ 20 ml di mezzo E3 per diluire la proteasi. Consentire agli embrioni di depositare e rimuovere il mezzo E3 decantando.
  5. Ripetere il passaggio 1.4 3x per rimuovere tutte le tracce della proteasi di decorrionazione.
    NOTA: Per ogni singolo campione da analizzare, sono necessari almeno 5 embrioni. Questa procedura di dechorionation può ospitare fino a 200 embrioni per piastra di Petri. I campioni possono essere raggruppati in questa fase e separati in un secondo momento, se lo si desidera. In alternativa, la dechorionation manuale può essere eseguita strappando delicatamente i chorions con le forcep dell'orologiaio. Questo è vantaggioso quando ci sono un piccolo numero di embrioni. Di solito i pesci zebra si schiudono dai loro corioni di 72 hpf. Tuttavia, gli embrioni gravemente malformati potrebbero non essere e richiederanno la dechorionation (manuale o chimica) dopo tale periodo.

2. Preparazione di campioni di embrioni per la dissociazione

  1. Utilizzando una pipetta P1000, posizionare 5−10 embrioni in un singolo tubo di microcentrifugo da 1,5 ml.
  2. Rimuovere il mezzo E3 con una pipetta e scartare.
    ATTENZIONE: Pipetta con cura in quanto gli embrioni possono essere facilmente scartati durante i seguenti passaggi.
  3. Aggiungere 1 mL di 10 mM di ditiothreitol (DTT) nel mezzo E3 per rimuovere il rivestimento muco che circonda il pesce zebra embrionale11,12,13,14. Posare il tubo di microcentrifugo orizzontalmente e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.

3. Dissociazione embrionale

  1. Lavare gli embrioni 3x con 1 mL della salina tamponata al fosfato di Dulbecco (DPBS) con Ca2+ e Mg2+ per rimuovere tracce di DTT. Dopo l'ultimo lavaggio aggiungere 500 μL di DPBS con Ca2+ e Mg2+ e 5 μL di 5 mg/mL (26 U/mL) di proteasi di dissociazione.
    NOTA: Possono essere utilizzate altre soluzioni tamponate isotoniche, ma devono contenere Ca2+ e Mg2+ affinché l'enzima di dissociazione funzioni correttamente.
  2. Incubare campioni a 37 °C su uno shaker orbitale orizzontale a 185 giri/min per 60 min. Embrioni triturati con pipetta P1000 fino a quando i campioni non sono completamente dissociati.
    ATTENZIONE: Fare attenzione a non digerire es oltre gli embrioni; alcuni tessuti solidi dovrebbero essere presenti e non dovrebbero essere completamente omogenei. È possibile digerire e sovradigestire, il che distruggerà le cellule del sangue bersaglio da osservare sul citometro del flusso (Figura supplementare 1).
    NOTA: Questa procedura funziona meglio per 48−72 embrioni hpf. Le fasi successive possono richiedere un'incubazione più lunga con proteasi di dissociazione. I tempi per le diverse fasi devono essere determinati empiricamente. Esistono metodi alternativi più rapidi per dissociare il tessuto embrionale, ma si trova empiricamente che questo metodo, sebbene ci vogliano 60 minuti, è abbastanza delicato e completo da consentire un efficiente isolamento delle cellule ematopoietiche vive.

4. Preparazione di embrioni dissociati per la citometria a flusso

  1. Pipettare i 5 embrioni dissociati sul serbatoio superiore di un tubo inferiore rotondo in polistirolo da 5 ml con un tappo del filtro cellulare da 35 μmM.
  2. Risciacquare le cellule aggiungendo 4 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) senza Ca2+ o Mg2+ al tappo del filtro del tubo di polistirolo da 5 ml contenente le celle filtrate.
    NOTA: Possono essere utilizzate anche altre soluzioni tamponate isotoniche, ma dovrebbero mancare di Ca2+ o Mg2+ per diluire e rendere l'enzima di dissociazione inefficace.
  3. Tubi di centrifuga a 4 °C e 300 x g per 5 minuti per pellettizzare le cellule. Con una pipetta, rimuovere e scartare il supernatante. Resuspend le cellule in 500 μL di PBS (senza Ca2+ o Mg2+).

5. Citometria a flusso

  1. Vortice delicatamente la sospensione cellulare e aggiungere 1:1.000 macchia di globuli morti rossi(Tabella dei materiali).
    NOTA: La macchia di globuli morti rossi è un colorante permeabile alle cellule che consente l'esclusione di cellule morte e detriti dalle cellule bersaglio ed è un'eccellente scelta di colorante per la discriminazione delle cellule morte, perché è eccitato dal laser a 633 nm, che è diverso dal laser a 488 nm utilizzato per eccitare fluorofori comuni come la proteina fluorescente verde (GFP) e il DsRed. In questo modo, non vi è sovrapposizione spettrale da cellule morte e cellule del sangue transgeniche. Lo ioduro di propidio (PI) a 1 mg/mL è un'alternativa economica alla macchia rossa dei globuli morti, ma assicurati di riservare alcuni campioni macchiati solo con PI e campioni solo con il fluorofore di interesse per impostare la compensazione dello strumento. In caso contrario, i segnali di PI e fluorofori come la GFP si sovrapporranno, dando luogo a risultati falsi positivi. Se il citometro a flusso ha anche un laser a 405 nm, anche altri coloranti come la macchia di cellule padre blu sono una scelta eccellente.
    ATTENZIONE: Quando si analizzano i globuli sanguigni, si noti che dopo 30 minuti alcuni tipi di cellule inizieranno a fagocitosi la macchia rossa dei globuli morti. Mantenere le cellule protette dalla luce e sul ghiaccio fino all'analisi ed eseguire la citometria a flusso entro 30 minuti dall'aggiunta del colorante.
  2. Analisi della citometria del flusso
    NOTA: Ogni citometro di flusso è un po 'diverso, ma i seguenti passaggi aiuteranno nella preparazione dei campioni per l'analisi sulla maggior parte delle macchine. Per gli utenti nuovi alla citometria a flusso, chiedi il consiglio di qualcuno che è un esperto del particolare pezzo di attrezzatura. Le seguenti istruzioni riguardano il citometro a flusso BD FACSAria Fusion.
    1. Accendere il citometro e consentire ai laser di riscaldarsi per 20 minuti. Serbatoio di scarico vuoto, serbatoio di fante di riempimento con soluzione appropriata (varia in base al citometro di flusso) e avviare il sistema di fluidic.
      NOTA: Di solito esiste una particolare procedura di avvio per ogni tipo di citometro di flusso; seguire attentamente tale procedura di avvio.
    2. Nel software di analisi, disegnare cinque grafici(figura 1A).
      1. Fare in modo che il primo grafico a punti misuri la dispersione in avanti (FSC) sull'asse x e la dispersione laterale (SSC) sull'asse y. Impostare FSC come lineare e SSC come log.
        NOTA: FSC è una misura delle dimensioni delle celle e SSC è una misura della granularità; ciò consentirà la discriminazione delle cellule dai detriti. Le popolazioni embrionali di cellule del sangue di zebrafish non si separano per dimensioni e granularità allo stesso modo delle cellule del sangue di zebrafish adulte descrittein precedenza 15. Invece appariranno nella stessa popolazione con tutte le altre cellule embrionali digerite.
      2. Impostate il secondo plottaggio per esaminare l'altezza FSC (H) e la larghezza FSC (W). Impostare il terzo plottaggio per misurare SSC (H) rispetto a SSC (W).
        NOTA: Questo passaggio viene utilizzato per escludere i farsa (celle bloccate insieme quando passano attraverso il laser).
      3. Impostare il quarto grafico a punti per misurare la macchia rossa dei globuli morti sull'asse x (a seconda del citometro questo è solitamente equivalente al filtro utilizzato per l'allococianina [APC]) e ssc sull'asse y. Ciò consentirà la discriminazione delle cellule vive dalle cellule morte.
        NOTA: i set di filtri di ogni citometro possono essere diversi. Assicurarsi di utilizzare il filtro di rilevamento corretto per il colorante per la discriminazione delle cellule morte.
      4. La quinta trama misura il fluoroforo preferito. Visualizzarlo come istogramma del fluorofore (Figura 1) o utilizzare un grafico a punti (Figura supplementare 2).
        NOTA: Quando si esaminano più di un fluoroforo nello stesso animale, si consiglia di utilizzare un grafico a punti per visualizzare entrambi i parametri contemporaneamente. Se c'è qualche possibilità che i fluorofori abbiano sovrapposizioni spettrali tra loro (Figura supplementare 2), si raccomanda anche un grafico a punti. Utilizzare le impostazioni area (A) per calcolare l'area sotto la curva generata dall'impulso laser del citometro per tutti i parametri, perché sono più accurate.
    3. Caricare il campione e ridurre la portata in modo che il campione non si esaurisa rapidamente. Regolare le impostazioni FSC e SSC in modo che la maggior parte della popolazione cellulare possa essere chiaramente visibile (Figura 1A).
    4. Disegnare un cancello intorno alla popolazione cellulare ed etichettarlo come celle. Assicurandosi che il secondo tracciato di punti sia gated sulle celle, escludere i doppietti prima gating su FSC e poi su singoletti SSC.
    5. Sulla quarta trama regolare le impostazioni di macchia dei globuli morti rossi in modo che ci sia chiaramente una popolazione negativa. Disegna un cancello intorno a queste celle ed etichettale come cellule vive. Sulla quinta trama, gate sulle cellule vive ed esaminare le cellule negative e positive del fluoroforo. Disegna un cancello intorno alle cellule positive.
      NOTA: Questa strategia gerarchica di gating esamina singolo fluoroforo+ cellule che risiedono nel cancello delle cellule vive, che risiedono anche nel cancello cellulare. Fai attenzione a fissare correttamente i cancelli. Questi cancelli possono essere personalizzati a seconda dell'esperimento.
    6. Esegui ogni campione, raccogliendo almeno 25.000 eventi di cellule vive.
    7. Seguire la procedura di arresto per disattivare la fluidica. Riempire il serbatoio della toere e svuotare il serbatoio dei rifiuti.
      NOTA: È spesso difficile visualizzare il fluoroforo + cellulequando l'espressione proteica è bassa o la popolazione cellulare è rara. Per garantire che i parametri siano impostati correttamente, è necessario preparare fluoroforo- embrioni fratelli per disegnare correttamente i cancelli e regolare le tensioni laser (Figura supplementare 2). Se la popolazione cellulare target è rara, raccogli più di 25.000 eventi. Con 5−10 animali digeriti, si dovrebbe essere in grado di raccogliere milioni di eventi. Il numero totale di fluorofofori+ cellule può anche essere ottenuto con questi dati. Basta contare il numero totale di cellule nel campione con un emocitometro e moltiplicare la percentuale di fluoroforo+ cellule per ottenere il numero assoluto di fluorofore+ cellule per pesce.

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Risultati

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Per enumerare i globuli rossi nel pesce zebra embrionale, lcr:GFP16 embrioni sono stati iniettati in una fase a una cellula con PBS, 7.0 ng/nL ism1 MO, o 7.0 ng/nL ism1 MO con 7.0 ng ism1 mRNA12. A 48 HPF sono stati digeriti e sottoposti ad analisi citometriche di flusso. Dopo aver analizzato la percentuale di GFP+ globuli rossi da ogni campione (ogni campione è 5 embrioni selezionati casualment...

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Discussione

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Gli zebrafish sono un eccellente sistema modello per lo studio dell'ematopoiesi vertebrata primitiva e definitiva. Negli ultimi decenni, sono stati sviluppati e perfezionati diversi test, consentendo al pesce zebra di diventare un modello rapido ed economico per testare farmaci, generare e testare mutanti genetici e, nel complesso, consentire ai ricercatori di analizzare percorsi molecolari essenziali per l'ematopoiesi. Questo protocollo utilizza zebrafish embrionali che consente una rapida raccolta dei dati, l'uso di me...

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Dichiarazioni

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D.L.S. è consulente scientifico e ha ricevuto un compenso da Finless Foods, Inc.

Ringraziamenti

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I finanziamenti sono stati forniti dal National Institutes of Health (NIH: R15 DK114732-01 a D.L.S.), dalla National Science Foundation (NSF: MRI 1626406 to D.L.S.), e dal Honor's Program della California State University Chico (a K.F.R.). Gli autori ringraziano Betsey Tamietti per la gestione del laboratorio e Kathy Johns per l'assistenza amministrativa.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Tubo MCF da 1,5 mlFisherBrand05-408-129
Piastra Petri in polistirene easygrip da 10 mmCorning Falcon351008
Tubo a fondo tondo in polistirene da 5 ml con tappo del filtro cellulareCorning Falcon352235
BD FACSAria Citometro a flusso a fusioneBD Biosciences
Dithiolthreitol (DTT)Sigma-Aldrich
646563 DPBS (10x) con Ca2+ e Mg2+Life Technologies14080-055
FBS 500 mLGemini Bio-Products100-108
HyClone PBS (1x)GE Healthcare Life Sciencessh30256.01
LibreaseRoche Sigma-Aldrich5401119001 proteasi
di dissociazionePronasiRoche Sigma-Aldrich11459643001decorionazione proteasi
SYTOX Red Dead Cell StainInvitrogen S34859

Riferimenti

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