Doppia elettroporazione in utero per colpire le popolazioni di cellule temporali e separate spazialmente

Isabel Mateos-White; Jaime Fabra-Beser; David de Agustín-Durán; Cristina Gil-Sanz

doi:10.3791/61046

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Articolo metodologico

Doppia elettroporazione in utero per colpire le popolazioni di cellule temporali e separate spazialmente

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DOI:

10.3791/61046

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14 giugno 2020

Isabel Mateos-White¹ , Jaime Fabra-Beser¹ , David de Agustín-Durán¹ , Cristina Gil-Sanz¹

¹Estructura de Recerca Interdisciplinar en Biotecnología y Biomedicina (ERI BIOTECMED), Departamento de Biología Celular, Biología Funcional y Antropología Física, Universidad de Valencia

In questo articolo

Sommario

La doppia elettropozione in utero consente di colpire le popolazioni cellulari separate spazialmente e temporaneamente. Questa tecnica è utile per visualizzare le interazioni tra quelle popolazioni cellulari utilizzando proteine fluorescenti in condizioni normali, ma anche dopo esperimenti funzionali per perturbare i geni di interesse.

Abstract

In utero l'elettroporazione è una tecnica di trasferimento del DNA in vivo ampiamente utilizzata per studiare i meccanismi molecolari e cellulari alla base della corticogenesi dei mammiferi. Questa procedura sfrutta i ventricoli cerebrali per consentire l'introduzione del DNA di interesse e utilizza una coppia di elettrodi per dirigere l'ingresso del materiale genetico nelle cellule che rivestono il ventricolo, le cellule staminali neurali. Questo metodo consente ai ricercatori di etichettare le cellule desiderate e/o di manipolare l'espressione dei geni di interesse in tali cellule. Ha più applicazioni, tra cui saggi mirati migrazione neuronale, tracciamento del lignaggio, e pathfinding assonale. Una caratteristica importante di questo metodo è il suo controllo temporale e regionale, che consente l'elusione di potenziali problemi legati alla letalità embrionale o alla mancanza di topi driver CRE specifici. Un altro aspetto rilevante di questa tecnica è che aiuta a ridurre considerevolmente i limiti economici e temporali che coinvolgono la generazione di nuove linee del mouse, che diventano particolarmente importanti nello studio delle interazioni tra i tipi di cellule che hanno origine in aree lontane del cervello in diverse età dello sviluppo. Qui descriviamo una doppia strategia di elettroporrazione che consente il targeting di popolazioni cellulari separate spazialmente e temporalmente. Con questo approccio possiamo etichettare diversi sottotipi di cellule in luoghi diversi con proteine fluorescenti selezionate per visualizzarle e/o possiamo manipolare i geni di interesse espressi da queste cellule diverse nei momenti appropriati. Questa strategia aumenta il potenziale dell'elettroporazione in utero e fornisce un potente strumento per studiare il comportamento delle popolazioni cellulari separate temporalmente e spazialmente che migrano per stabilire contatti stretti, così come le interazioni a lungo raggio attraverso proiezioni assonali, riducendo i costi temporali ed economici.

Introduzione

La corteccia cerebrale è una struttura molto complessa e finemente organizzata. Per raggiungere un tale grado di organizzazione, i neuroni di proiezione corticale passano attraverso processi di sviluppo complessi che richiedono la loro generazione temporale, la migrazione alla loro destinazione finale nella piastra corticale e la creazione di connessioni a breve e lungo raggio¹^,². Per molto tempo, il modo classico per studiare la corticogenesi si basava sull'uso di modelli murini knockout o knock-in di geni di interesse. Tuttavia, questa strategia, e in particolare l'uso di topi knockout condizionali, richiede....