Articolo metodologico

Quantificare le particelle umane simili al virus Norovirus legandosi ai batteri commensali utilizzando la citometria di flusso

DOI:

10.3791/61048

⸱

29 aprile 2020

 , 
1Microbiology and Cell Science Department, University of Florida

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'obiettivo di questo protocollo è quantificare il legame del patogeno eucatotico norovirus umano ai batteri. Dopo aver eseguito un primo saggio di attaccamento virus-batterio, la citometria di flusso viene utilizzata per rilevare batteri viralmente legati all'interno della popolazione.

Abstract

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I batteri commensale sono ben consolidati per influenzare l'infezione dei virus eucarioti. Il legame diretto tra l'agente patogeno e il microbioma ospite è responsabile dell'alterazione dell'infezione per molti di questi virus. Pertanto, caratterizzare la natura del legame virusbatterico è un passo fondamentale necessario per chiarire i meccanismi con cui i batteri alterano l'infezione virale. Per il norovirus umano, i batteri commensale migliorano l'infezione delle cellule B. Il virus si lega direttamente a questi batteri, indicando che questa interazione diretta è coinvolto nel meccanismo di miglioramento dell'infezione. Una varietà di tecniche può essere utilizzata per quantificare le interazioni tra batteri e virus, tra cui il conteggio scintillio dei virus radioetichettati e la reazione a catena della polimerasi (PCR). Entrambi i metodi richiedono l'uso di virus dal vivo, che potrebbe essere necessario generare in laboratorio. Attualmente, nessuno dei sistemi di coltura in vitro già stabiliti per il norovirus umano è abbastanza robusto da consentire la generazione di scorte virali altamente concentrate. Al posto del virus vivo, particelle simili a virus (VLP) sono state utilizzate per caratterizzare le interazioni tra norovirus e batteri. Qui viene descritto un metodo di citometria a flusso con anticorpi specifici del virus per quantificare il legame VLP ai batteri gram-negativi e gram-positivi. L'inclusione solo dei batteri e i controlli dell'isotipo hanno permesso l'ottimizzazione del saggio per ridurre il legame degli anticorpi di fondo e la quantificazione accurata dell'attaccamento VLP ai batteri testati. Alti rapporti VLP:batterio si traducono in VLP che si legano a grandi percentuali della popolazione batterica. Tuttavia, quando le quantità di VLP sono diminuite, diminuisce anche la percentuale di batteri legati. In definitiva, questo metodo può essere impiegato in esperimenti futuri che chiariscono le condizioni specifiche e i componenti strutturali che regolano il norovirus: le interazioni batteriche.

Introduzione

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I norovirus umani (HuNoVs) sono la principale causa di malattie gastrointestinali in tutto il mondo, responsabili di 685 milioni di infezioni e oltre 200.000 decessi ogni anno1. Come con altri virus enterici, la presenza di batteri commensale è stato indicato per migliorare l'infezione di questo agente patogeno così come il suo virus surrogato, murine norovirus2,3. Ci sono anche rapporti contrastanti che i batteri possono inibire l'infezione da norovirus umano4,5,6. Per diversi virus, l'interazione diretta tra il virus e i batteri sembra essere alla base dei meccanismi che influiscono sull'infezione virale2,,7,8,9,10, ed è stata dimostrata attraverso la microscopia elettronica che i norovirus umani legano direttamente alle superfici dei batteri11,12. Pertanto, caratterizzare queste interazioni è diventato fondamentale per determinare i meccanismi con cui i batteri influenzano l'infezione virale. Questa caratterizzazione è classicamente iniziata con la quantificazione del legame virale a una serie di specie batteriche che sono componenti del microbioma ospite7,12,13. Questi test di attaccamento non solo rivelano la quantità di virus legato ai batteri, ma aiutano anche a determinare l'impatto di questa interazione sulla forma fisica e sulla sopravvivenza virali.

Per quantificare l'attaccamento virale, i metodi tradizionalmente impiegati includono saggi basati su PCR che quantificano i genomi virali12 o la generazione di virus radioetichettato e l'uso del conteggio scintillio per quantificare le particelle virali7,8,9,13. L'uso di questi metodi richiede generalmente l'accesso alle scorte di virus ad alto tè e alle tecniche di coltivazione in vitro con cui generarle. Mentre diversi sistemi di coltura per il norovirus umano esistono attualmente2,14,15, nessuno supporta la replica robusta necessaria per generare questi stock altamente concentrati che limita o elimina l'uso di PCR scintill e conteggio per quantificare le interazioni uomo norovirus/ batteriche.

Per aggirare questo problema, le particelle simili a virus (VLP) possono essere utilizzate come surrogato per vivere il virus per studiare le interazioni tra norovirus umano e batteri16,17. I VLP sono particelle non infettive che assomigliano molto al virus da cui sono derivate. Nel caso del norovirus umano, queste particelle sono generate dall'espressione della proteina VP1 (e a volte VP2), che si auto-assemblano per creare capsidi virali intatti privi di materiale genetico (cioè RNA per norovirus). Questi VLP sono stati ben caratterizzati, sono strutturalmente e antigenicamente simili ai virus wild-type da cui sono derivati18,19,20,21,22,23. Pertanto, i VLP fungono da surrogato ideale per studiare le interazioni superficiali tra norovirus umano e batteri commensale. Dato che i VLP non dispongono di materiale genetico, i saggi basati su PCR non possono essere utilizzati per quantificare il legame virale. Un metodo di citometria di flusso basato su anticorpi è stato descritto in precedenza e in grado di rilevare bassi livelli di legame VLP ai batteri in modo semi-quantitativo16. Questo metodo è stato ottimizzato per consentire una quantificazione accurata del legame VLP del norovirus umano sia ai batteri commensale gram-negativi che gram-positivi16.

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Protocollo

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NOTA: Le condizioni di crescita batterica delineate nel protocollo sono condizioni di coltura standard per Enterobacter cloacae e Lactobacillus gasseri. Per eseguire il virus: i batteri attaccano il saggio con altre specie batteriche, i batteri scelti devono essere coltivati in condizioni standard appropriate per il batterio.

1. Preparazione di mezzo di crescita batterica

  1. Enterobacter cloacae crescita media
    1. Preparare il mezzo liquido sciogliendo 10 g di tryptone, 5 g di estratto di lievito e 10 g di cloruro di sodio (NaCl) in 1 L di acqua deionizzata (DI) (vedi Tabella dei materiali). Mescolare accuratamente tutti i media e sterilizzare autoclaving per 30 min.
    2. Preparare il mezzo solido sciogliendo 10 g di tryptone, 5 g di estratto di lievito, 10 g di NaCl e 15 g di agar in 1 L di acqua DI. Mescolare accuratamente tutti i media e sterilizzare autoclaving per 30 min.
  2. Lactobacillus gasseri media di crescita
    1. Preparare il mezzo liquido sciogliendo 55 g di De Man, Rogosa e Sharpe (MRS; vedi Tabella dei materiali) polvere in 1 L di acqua DI. Utilizzare il supporto entro un mese dalla preparazione. Per sterilizzare, riscaldare il mezzo per 15 minuti fino a ebollizione seguita da autoclaving per 15 min.
    2. Preparare il mezzo solido sciogliendo 55 g di polvere MRS e 15 g di agar in 1 L di acqua DI. Per sterilizzare, riscaldare il mezzo per 15 minuti fino a ebollizione seguita da autoclaving per 15 min.

2. Stabilire una curva standard di correlazione ottica (OD) e la concentrazione batterica

  1. Inoculare 5 mL di mezzo liquido appropriato con una singola colonia isolata da una piastra di agar (E. cloacae) o direttamente da brodo di glicerolo congelato (L. gasseri).
  2. Coltivare il batterio durante la notte, in condizioni atmosferiche adeguate (Enterobacter cloacae: 37 gradi centigradi con agitazione aerobica a 200 giri/min; L. gasseri: bagno d'acqua di 37 gradi centigradi senza agitazione in un contenitore ermetico).
  3. Trasferire 2 x 1,3 mL di coltura durante la notte in due tubi di centrifuga di 1,5 ml separati e batteri centrifugati a 10.000 x g per 5 min.
  4. Rimuovere i campioni supernatali e lavati con 1 mL di sterile 1x fosfato tampinato salina (PBS). Ripetere questo passaggio di lavaggio per un totale di 2 lavaggi.
  5. Centrifugare nuovamente i campioni a 10.000 x g per 5 min, rimuovere il supernatante e risospendere in 1,3 mL di sterile 1x PBS.
  6. A partire da 0,5 mL di coltura lavata, diluire serialmente i batteri in 1x PBS da 10-1 a 10-4.
  7. Utilizzando uno spettrofotometro, misurare la densità ottica della coltura lavata e non diluita e ciascuna delle quattro diluizioni a 600 nm (OD600).
  8. Eseguire diluizioni seriali di 10 volte in 1x PBS per ogni diluizione dal passaggio 2.6. Stendere la piastra 100 -L delle ultime 3 diluizioni per ogni serie su un mezzo solido appropriato per determinare il numero di unità di formazione colonia per millilifurer (CFU/mL) di ciascun campione. Piastra ogni diluizione in triplice copia.
  9. Lasciare asciugare le piastre a temperatura ambiente per 5 min. Invertire le piastre e incubare le condizioni atmosferiche appropriate (E. cloacae: aerobica a 37 gradi centigradi, incubare le piastre durante la notte; L. gasseri: anaerobica a 37 gradi centigradi, incubare piastre per 48 h in un contenitore ermetico con banchine d'aria aneroiche (vedi Tabella dei materiali)).
    NOTA: Utilizzare 1 sacca d'aria anaerobica per un barattolo da 2,5 L o una sacca da 7,0 L (vedere Tabella dei materiali).
  10. Utilizzare i conteggi delle placche per determinare CFU/mL per ciascuno dei 5 campioni (ad esempio, non diluiti, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4). Generare una curva standard confrontando OD600 e CFU/mL. L'equazione per questa linea verrà utilizzata nei saggi di attaccamento VLP-batteri per determinare CFU/mL in base all'OD600.

3. VLP-batteri Attacco Saggio

AVVISO: i VLP per il norovirus umano sono un pericolo per il livello di biosicurezza (BSL)-2 e tutto il lavoro che coinvolge i VLP deve essere eseguito in un armadietto della biosicurezza. La preparazione delle colture batteriche, prima del test di attaccamento, deve essere eseguita utilizzando condizioni di sicurezza appropriate per l'organismo.

  1. Preparazione del reagente
    1. 1x salina tampone da fosfato (PBS)
      1. Preparare 1 L di 10x PBS sciogliendo un intero pacchetto in 1 L di acqua DI.
      2. Soluzione autoclave per 30 min.
      3. Preparare una soluzione 1x diluindo la soluzione 1:10 di cui sopra in acqua DI.
      4. Filtrare sterilizzare la soluzione passando attraverso un filtro da 0,22 m e conservarlo a temperatura ambiente.
    2. 5% BSA
      1. Aggiungere 5 g di polvere di siero bovino (BSA) a 100 mL di PBS per generare una soluzione del 5% (w/v).
      2. Mescolare la soluzione vortice o su una piastra di mescolare utilizzando una barra di stiring di metallo fino a quando i grumi si sono sciolti.
      3. Filtrare sterilizzare utilizzando un filtro da 0,22 m.
      4. Conservare la soluzione a 4 gradi centigradi.
    3. Buffer di macchie di citometria di flusso (FCSB)
      1. Filtro acquistato FCSB (vedi Tabella dei materiali)tramite un filtro da 0,22 m.
      2. Conservare la soluzione rimanente a 4 gradi centigradi.
    4. Buffer di blocco 5% (BB)
      NOTA: Preparare fresco ogni volta.
      1. Aggiungere 0,5 g di BSA a 10 mL di FCSB sterile.
      2. Vortice per mescolare completamente il campione e lasciare sul ghiaccio fino all'uso.
  2. Coniugazione anticorpale
    1. Concatenare l'anticorpo GII norovirus umano (vedi Tabella dei materiali) con r-phycoerythrin (PE) utilizzando un kit di etichettatura anticorpo R-PE per le istruzioni del produttore (vedere Tabella dei materiali).
    2. Conservare l'anticorpo coniugato al buio a 4 gradi centigradi per un uso futuro nell'analisi del saggio di attaccamento VLP-batterio.
      NOTA: L'anticorpo primario deve essere titolato prima dell'uso nel saggio di attaccamento VLP-batteri per determinare la giusta concentrazione necessaria per l'analisi della citometria del flusso. La titolazione degli anticorpi deve essere eseguita ogni volta che viene eseguita la reazione di coniugazione e per ogni batterio utilizzato nel saggio di attaccamento.
  3. Titorazione anticorpale
    1. Diluire l'anticorpo GII anti-umano coniugato norovirus 100 volte, con una diluizione iniziale di 1:100 e una diluizione finale di 1:600 (sei diluizioni in totale).
    2. Eseguire un saggio di allegato antivirus come descritto di seguito con la seguente eccezione: al passaggio 3.5.7 resospendere il pellet batterico in 350 : L del 5% BB.
    3. Dividere il campione in sette aliquote da 50 l.l.
    4. Aggiungere 50 l di ogni diluizione dell'anticorpo a un tubo.
    5. Aggiungere 50 -L di 5% BB al settimo tubo come controllo incontaminato.
    6. Eseguire la citometria di flusso su tutti i campioni come descritto di seguito.
    7. Confrontare i campioni di anticorpi diluiti con i controlli non macchiati e gli uni agli altri. La più bassa concentrazione di anticorpi che non comporta una diminuzione o perdita di segnale positivo deve essere scelta per l'uso nei saggi successivi.
  4. Preparazione di batteri
    1. Far crescere i batteri in 40 mL di mezzo liquido appropriato in condizioni atmosferiche appropriate fino a quando i batteri sono in fase stazionaria.
      1. Coltiva le colture E. cloacae in modo aerobico durante la notte a Luria Broth a 37 gradi centigradi, tremando a 200 giri/min per raggiungere una fase stazionaria.
      2. Coltiva le colture L. gasseri nel brodo MRS in tubi neri a vite senza agitare in un bagno d'acqua impostato a 37 gradi centigradi per raggiungere la fase stazionaria.
    2. Trasferire colture di fase stazionarie per pulire tubi conici da 50 mL e centrifugare a 2.288 x g per 10 min a pellet i batteri.
    3. Rimuovere il supernatante e risospendere in 13 mL di sterile 1x PBS. Ripetere questo passaggio di lavaggio per un totale di due lavaggi.
    4. Centrifugare nuovamente i campioni, rimuovere il supernatante e sospendere i campioni in 20 mL di 1x PBS.
      NOTA: Se il pellet cellulare è piccolo, il volume di sospensione può essere ridotto.
    5. Misurare l'OD600 della coltura.
    6. Utilizzando la curva standard precedentemente preparata, determinare la CFU per mL della coltura lavata.
    7. Diluire i batteri in base alle esigenze con 1x PBS per regolare la concentrazione di coltura a 1 x 108 CFU/mL.
    8. Trasferire 1 mL della coltura batterica 1 x 108 CFU/mL al numero richiesto di tubi di centrifuga di 1,5 mL.
    9. Centrifugare i tubi a 10.000 x g per 5 min.
    10. Risospendere il pellet batterico in 1 mL di sterile 5% BSA.
    11. Incubare i tubi per 1 h a 37 gradi centigradi con rotazione costante.
  5. Allegato di virus
    1. Lavorando all'interno di un armadio di biosicurezza BSL-2, aggiungere 10 g di VLP HuNoV (vedi Tabella dei materiali) ad ogni tubo contenente batteri risospesi in PBS e mescolare accuratamente con il pipettaggio.
      NOTA: la concentrazione di VLP varia a seconda della preparazione VLP. Pertanto, il volume aggiunto ai batteri varierà tra i lotti di preparazione e deve essere regolato di conseguenza in modo che 10 g viene aggiunto a ogni tubo nell'esperimento. Per i controlli solo per i batteri (ad esempio, campioni senza VLP), aggiungere un volume di PBS che corrisponde al volume di VLP aggiunto ai campioni sperimentali.
    2. Incubare i tubi per 1 h a 37 gradi centigradi con rotazione costante.
      NOTA: Durante l'incubazione viene utilizzato un revolver a tubo (vedere Tabella dei materiali)impostato su 40 giri/min.
    3. Dopo l'incubazione, centrifugare i campioni a 10.000 x g per 5 min.
    4. Scartare il pellet batterico supernatante e resospende in 1 mL di PBS.
    5. Ripetere i passaggi di lavaggio 3.5.3 e 3.5.4.
    6. Centrifugare i campioni a 10.000 x g per 5 min.
    7. Scartare il pellet batterico supernatante e resospende il pellet batterico in 150 .
  6. Colorazione anticorpale
    1. Preparare fresco 5% BB.
      NOTA: Tutto il lavoro che utilizza l'anticorpo fluorescente etichettato deve essere eseguito al buio e l'anticorpo, BB e FCSB devono essere tenuti sul ghiaccio.
    2. Diluire l'anticorpo GII di norovirus umano 1:125 per i campioni di E. cloacae e 1:150 per campioni di L. gasseri nel 5% DI BB, preparando 50 l.l di anticorpi diluiti per ogni campione.
    3. Diluire l'anticorpo isotipo nello stesso modo in cui l'anticorpo GII norovirus umano è stato diluito per ogni batterio nel 5% BB, preparando 50 l di controllo isotipo diluito per campione.
    4. Dividere ogni campione di prova di fissaggio dal passo 3.3.7 in tre 50 ll trasferendoli in tubi di centrifuga puliti da 1,5 mL.
    5. Al primo set di campioni, aggiungere 50 l di BB. Questo set sarà il controllo unstained (Uns).
    6. Al secondo set, aggiungere 50 L della diluizione dell'anticorpo GII. Ciò si traduce in una concentrazione finale di anticorpi di 1:250 per E. cloacae e 1:300 per L. gasseri. Questo set di campioni sarà il campione colorato (AB).
    7. Al terzo set, aggiungere 50 l ofotipo diluito. Questo set sarà i controlli isotipi (IC). Mescolare bene pipettando. Incubare i campioni sul ghiaccio e al buio per 30 min.
    8. Centrifuga tutti i campioni a 10.000 x g per 5 min.
    9. Scartare il supernatante e risospendere nuovamente i campioni in 100 gradi L di FCSB.
    10. Centrifugare tutti i campioni a 10.000 x g per 5 min. Scartare il supernatante e risospendere nuovamente i campioni in 100 .
    11. Centrifuga tutti i campioni a 10.000 x g per 5 min.
    12. Scartare il supernatante e risospendere nuovamente i campioni in 150 gradi l di FCSB.
    13. Trasferire ogni campione su un tubo FCSB contenente 400 l di tampone FCSB per un volume totale di 550 .
    14. Conservare i campioni a 4 gradi centigradi fino a quando non vengono analizzati dalla citometria di flusso.
      NOTA: La citometria di flusso viene eseguita entro 4 h dalla colorazione degli anticorpi.

4. Citometria di flusso

NOTA: le impostazioni di tensione descritte di seguito si basano sul citometro di flusso e sul software elencato nella Tabella dei materiali e probabilmente variano a seconda dei citometri di flusso. Le impostazioni devono essere ottimizzate per ogni batterio. Assicurarsi che gli assi per tutti i grafici siano in fase biesponenziale.

  1. Configurazione dell'area di lavoro
    NOTA: la configurazione per i grafici utilizzati per stabilire l'area di lavoro è diversa da quella utilizzata per l'analisi e l'analisi dei dati. Lo scopo della configurazione dell'area di lavoro è quello di visualizzare la popolazione cellulare, garantire che non vi sia un agglomeramento eccessivo delle cellule batteriche che potrebbero influire sull'analisi a valle e distinguere tra cellule macchiate e non colorate durante la raccolta dei dati.
    1. Al fine di garantire che i batteri non si aggregano insieme, impostare una serie di appezzamenti di densità.
      1. Generare un'area di dispersione in avanti (FSC-A) e un'area di dispersione laterale (SSC-A) per visualizzare la popolazione totale.
      2. Impostare i grafici per valutare le singole celle rispetto ai grumi di celle creando due grafici che confrontano sia la larghezza della dispersione in avanti (FSC-W) che la larghezza della dispersione laterale (SSC-W) con l'avanti (FSC-H) e l'altezza della dispersione laterale (SSC-H).
      3. Creare un grafico che mostri solo la popolazione PE positiva (PE-A e SSC-A).
    2. Impostare la tensione di base su 500 per E. cloacae e 340 per L. gasseri. Questi saranno ulteriormente regolati in seguito.
    3. Impostare il numero totale di eventi conteggiati su 10.000 eventi.
  2. Esecuzione di esempi
    1. Creare tre grafici dell'istogramma separati che mostrano il conteggio tracciato rispetto a SSC-A, FSC-A o PE-A.
    2. Posizionare un campione non colorato sul citometro di flusso e acquisire gli eventi del campione, assicurando che il picco massimo sull'istogramma per SSC-A sia compreso tra 102 e 103 e che il picco massimo sull'istogramma per FSC-A sia compreso tra 104 e 105 sull'asse x. In caso contrario, i picchi non rientrano negli intervalli specificati, regolare di conseguenza le tensioni FSC e SSC.
    3. Posizionare un campione macchiato (AB) sul citometro di flusso e regolare la tensione PE per rendere il picco massimo oltre 103 sull'asse x.
    4. Sulla base di queste misurazioni, impostare il cancello PE positivo e impostare il cancello sul grafico di densità PE-A rispetto A SSC-A.
    5. Eseguire tutti i campioni con le impostazioni determinate a bassa o media velocità.

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Risultati

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Le strategie di gating utilizzate per quantificare il legame VLP del norovirus umano ai batteri commensale sono mostrate nella Figura 1. Il punto di densità rappresentativo fornisce una panoramica di come i campioni sono stati recintati per eliminare i detriti cellulari e gli ammassamenti di cellule in modo che l'attacco VLP sia stato determinato su popolazioni singlet(Figura 1A). Gli istogrammi rappresentativi d...

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Discussione

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La capacità di quantificare il legame dei virus enterici ai batteri è un primo passo fondamentale per chiarire i meccanismi con cui questi batteri alterano l'infezione virale. I metodi qui descritti sono stati ottimizzati per misurare le interazioni VLP del norovirus umano sia con E. cloacae (batterio gram-negativo) che con L. gasseri (un batterio gram-positivo), ma possono essere adattati per l'uso con qualsiasi virus dei mammiferi e batterio di interesse. Mentre i VLP ...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti di interesse.

Ringraziamenti

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Vorremmo ringraziare Sutonuka Bhar e Chanel Mosby-Haundrup per la loro revisione critica del manoscritto scritto, così come Alfonso Carrillo per l'assistenza nella generazione di curve standard batteriche. Questo lavoro è finanziato in parte da una sovvenzione del National Institute of Health (R21AI140012) e da una sovvenzione di seme dell'Università della Florida, Istituto di Scienze dell'Alimentazione e dell'Agricoltura.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Provette a fondo tondo in polistrene da 5 ml con tappo a filtro cellulare Corning352235Dopo la colorazione degli anticorpi, il campione viene trasferito in provette per l'analisi della citometria a flusso.
AgarSigmaA7002Utilizzato per la preparazione dei terreni
AnaeroPackThermo ScientificR681001Pacchetto di gas anaerobico utilizzato per la coltura di Lactobacillus gasseri
BD Software FacsDiva
BD LSR Citometro
Siero bovino AlbuminaFisher BioreagentiBP1605Utilizzato per la citometria a flusso
Tampone colorante per citometria a flusso (FCSB)BD Biosciences554657Utilizzato per la citometria a flusso
Controllo dell'isotipo kappa IgG2b di topo (eBMG2b), PE, eBioscienceThermo Fisher Scientific12473281Controllo dell'isotipo. Questo anticorpo viene acquistato in forma coniugata dal produttore.
MRS PowderBD Biosciences288130Utilizzato per la preparazione di terreni e per la coltura di Lactobacillus gasseri.
Anticorpo monoclonale Norovirus capside G2 (L34D)Thermo Fisher ScientificMA5-18241Anticorpo Norovirus GII. Questo anticorpo è disponibile solo nella forma non coniugata e quindi deve essere coniugato in fluorescenza prima di essere utilizzato nei saggi di citometria a flusso descritti. In questo protocollo, il PE è stato il fluorismo scelto, tuttavia, altre molecole fluorescenti possono essere scelte come meglio si adattano al citometro a flusso utilizzato dal ricercatore.
Norovirus GII.4 VLPCreative BiostructureCBS-V700norovirus umano come particella, le VLP sono state generate utilizzando il sistema baculovirus e risospese in soluzione salina tamponata con fosfato con glicerolo al 10%. Gli autori hanno eseguito un'analisi indipendente di tracciamento nanosight per determinare la concentrazione di particelle delle VLP. La concentrazione è di circa 1011 VLP per millilitro. Sulla base della concentrazione proteica delle VLP, nei saggi di attacco VLP vengono aggiunte circa 200 particelle per batterio.
PBS 10XFisher BioreagentsBP665Diluire a 1X prima dell'uso.
Kit di marcatura degli anticorpi SiteClick R-PEThermo Fisher ScientificS10467utilizzato per la luccicante di anticorpi non coniugati.
Cloruro di sodioFisher ScientificS271Utilizzato per la preparazione dei terreni
TriptoneOssoideLP0042Utilizzato per la preparazione dei terreni
Revolver a tuboThermoFisher Scientific88881001Utilizzato nel test di attacco virus:batterio. Impostare la velocità massima (40 giri/min).
Estratto di lievitoBD Biosciences212750Utilizzato per la preparazione dei terreni
a flusso Fortessa Kit di coniugazione

Riferimenti

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