Articolo metodologico

Quantificare le particelle umane simili al virus Norovirus legandosi ai batteri commensali utilizzando la citometria di flusso

DOI:

10.3791/61048

⸱

29 aprile 2020

 , 
1Microbiology and Cell Science Department, University of Florida

In questo articolo

Sommario

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L'obiettivo di questo protocollo è quantificare il legame del patogeno eucatotico norovirus umano ai batteri. Dopo aver eseguito un primo saggio di attaccamento virus-batterio, la citometria di flusso viene utilizzata per rilevare batteri viralmente legati all'interno della popolazione.

Abstract

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I batteri commensale sono ben consolidati per influenzare l'infezione dei virus eucarioti. Il legame diretto tra l'agente patogeno e il microbioma ospite è responsabile dell'alterazione dell'infezione per molti di questi virus. Pertanto, caratterizzare la natura del legame virusbatterico è un passo fondamentale necessario per chiarire i meccanismi con cui i batteri alterano l'infezione virale. Per il norovirus umano, i batteri commensale migliorano l'infezione delle cellule B. Il virus si lega direttamente a questi batteri, indicando che questa interazione diretta è coinvolto nel meccanismo di miglioramento dell'infezione. Una varietà di tecniche può essere utilizzata per quantificare le interazioni tra batteri e virus, tra cui il conteggio scintillio dei virus radioetichettati e la reazione a catena della polimerasi (PCR). Entrambi i metodi richiedono l'uso di virus dal vivo, che potrebbe essere necessario generare in laboratorio. Attualmente, nessuno dei sistemi di coltura in vitro già stabiliti per il norovirus umano è abbastanza robusto da consentire la generazione di scorte virali altamente concentrate. Al posto del virus vivo, particelle simili a virus (VLP) sono state utilizzate per caratterizzare le interazioni tra norovirus e batteri. Qui viene descritto un metodo di citometria a flusso con anticorpi specifici del virus per quantificare il legame VLP ai batteri gram-negativi e gram-positivi. L'inclusione solo dei batteri e i controlli dell'isotipo hanno permesso l'ottimizzazione del saggio per ridurre il legame degli anticorpi di fondo e la quantificazione accurata dell'attaccamento VLP ai batteri testati. Alti rapporti VLP:batterio si traducono in VLP che si legano a grandi percentuali della popolazione batterica. Tuttavia, quando le quantità di VLP sono diminuite, diminuisce anche la percentuale di batteri legati. In definitiva, questo metodo può essere impiegato in esperimenti futuri che chiariscono le condizioni specifiche e i componenti strutturali che regolano il norovirus: le interazioni batteriche.

Introduzione

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I norovirus umani (HuNoVs) sono la principale causa di malattie gastrointestinali in tutto il mondo, responsabili di 685 milioni di infezioni e oltre 200.000 decessi ogni anno1. Come con altri virus enterici, la presenza di batteri commensale è stato indicato per migliorare l'infezione di questo agente patogeno così come il suo virus surrogato, murine norovirus2,3. Ci sono anche rapporti contrastanti che i batteri possono inibire l'infezione da norovirus umano4,5,6. Per diversi virus, l'interaz....

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Protocollo

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NOTA: Le condizioni di crescita batterica delineate nel protocollo sono condizioni di coltura standard per Enterobacter cloacae e Lactobacillus gasseri. Per eseguire il virus: i batteri attaccano il saggio con altre specie batteriche, i batteri scelti devono essere coltivati in condizioni standard appropriate per il batterio.

1. Preparazione di mezzo di crescita batterica

  1. Enterobacter cloacae crescita media
    1. Preparare il mezzo liquido sciogliendo 10 g di tryptone, 5 g di estratto di lievito e 10 g di cloruro di sodio (NaCl) in 1 L di acqua deionizzata (DI) (vedi Tabella dei materiali

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Risultati

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Le strategie di gating utilizzate per quantificare il legame VLP del norovirus umano ai batteri commensale sono mostrate nella Figura 1. Il punto di densità rappresentativo fornisce una panoramica di come i campioni sono stati recintati per eliminare i detriti cellulari e gli ammassamenti di cellule in modo che l'attacco VLP sia stato determinato su popolazioni singlet(Figura 1A). Gli istogrammi rappresentativi d.......

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Discussione

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La capacità di quantificare il legame dei virus enterici ai batteri è un primo passo fondamentale per chiarire i meccanismi con cui questi batteri alterano l'infezione virale. I metodi qui descritti sono stati ottimizzati per misurare le interazioni VLP del norovirus umano sia con E. cloacae (batterio gram-negativo) che con L. gasseri (un batterio gram-positivo), ma possono essere adattati per l'uso con qualsiasi virus dei mammiferi e batterio di interesse. Mentre i VLP .......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti di interesse.

Ringraziamenti

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Vorremmo ringraziare Sutonuka Bhar e Chanel Mosby-Haundrup per la loro revisione critica del manoscritto scritto, così come Alfonso Carrillo per l'assistenza nella generazione di curve standard batteriche. Questo lavoro è finanziato in parte da una sovvenzione del National Institute of Health (R21AI140012) e da una sovvenzione di seme dell'Università della Florida, Istituto di Scienze dell'Alimentazione e dell'Agricoltura.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Provette a fondo tondo in polistrene da 5 ml con tappo a filtro cellulare Corning352235Dopo la colorazione degli anticorpi, il campione viene trasferito in provette per l'analisi della citometria a flusso.
AgarSigmaA7002Utilizzato per la preparazione dei terreni
AnaeroPackThermo ScientificR681001Pacchetto di gas anaerobico utilizzato per la coltura di Lactobacillus gasseri
BD Software FacsDiva
BD LSR Citometro
Siero bovino AlbuminaFisher BioreagentiBP1605Utilizzato per la citometria a flusso
Tampone colorante per citometria a flusso (FCSB)BD Biosciences554657Utilizzato per la citometria a flusso
Controllo dell'isotipo kappa IgG2b di topo (eBMG2b), PE, eBioscienceThermo Fisher Scientific12473281Controllo dell'isotipo. Questo anticorpo viene acquistato in forma coniugata dal produttore.
MRS PowderBD Biosciences288130Utilizzato per la preparazione di terreni e per la coltura di Lactobacillus gasseri.
Anticorpo monoclonale Norovirus capside G2 (L34D)Thermo Fisher ScientificMA5-18241Anticorpo Norovirus GII. Questo anticorpo è disponibile solo nella forma non coniugata e quindi deve essere coniugato in fluorescenza prima di essere utilizzato nei saggi di citometria a flusso descritti. In questo protocollo, il PE è stato il fluorismo scelto, tuttavia, altre molecole fluorescenti possono essere scelte come meglio si adattano al citometro a flusso utilizzato dal ricercatore.
Norovirus GII.4 VLPCreative BiostructureCBS-V700norovirus umano come particella, le VLP sono state generate utilizzando il sistema baculovirus e risospese in soluzione salina tamponata con fosfato con glicerolo al 10%. Gli autori hanno eseguito un'analisi indipendente di tracciamento nanosight per determinare la concentrazione di particelle delle VLP. La concentrazione è di circa 1011 VLP per millilitro. Sulla base della concentrazione proteica delle VLP, nei saggi di attacco VLP vengono aggiunte circa 200 particelle per batterio.
PBS 10XFisher BioreagentsBP665Diluire a 1X prima dell'uso.
Kit di marcatura degli anticorpi SiteClick R-PEThermo Fisher ScientificS10467utilizzato per la luccicante di anticorpi non coniugati.
Cloruro di sodioFisher ScientificS271Utilizzato per la preparazione dei terreni
TriptoneOssoideLP0042Utilizzato per la preparazione dei terreni
Revolver a tuboThermoFisher Scientific88881001Utilizzato nel test di attacco virus:batterio. Impostare la velocità massima (40 giri/min).
Estratto di lievitoBD Biosciences212750Utilizzato per la preparazione dei terreni
a flusso Fortessa Kit di coniugazione

Riferimenti

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  1. Hall, A. J., Glass, R. I., Parashar, U. D. New insights into the global burden of noroviruses and opportunities for prevention. Expert Review of Vaccines. 15 (8), 949-951 (2016).
  2. Jones, M. K., et al. Enteric bacteria promote human and mouse norov....

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VLP di Noroviruslegame virus batteriostrutture superficiali batterichecolorazione con anticorpidiluizione serialeunit formanti coloniebatteri Gram negativi

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