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Summary

Questo manoscritto presenta un protocollo per indurre l’encefalomielite autoimmune sperimentale attiva (EAE) nei topi. Viene inoltre presentato un metodo per l’isolamento e la caratterizzazione dei linfociti infiltrati nel sistema nervoso centrale (CNS) per mostrare come i linfociti siano coinvolti nello sviluppo della malattia autoimmune del SNC.

Abstract

La sclerosi multipla (MS) è una malattia autoimmune del sistema nervoso centrale (SNC) causata dalla combinazione di fattori ambientali e background genetico suscettibile. L’encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) è un modello tipico di malattia della SM ampiamente utilizzato per studiare la patogenesi in cui i linfociti T specifici per gli antigeni della mielina avviano una reazione infiammatoria nel SNC. È molto importante valutare come i linfociti nel SNC regolano lo sviluppo della malattia. Tuttavia, l’approccio per misurare la quantità e la qualità dei linfociti infiltrati nel SNC è molto limitato a causa delle difficoltà nell’isolare e rilevare i linfociti infiltrati dal cervello. Questo manoscritto presenta un protocollo per che è utile per l’isolamento, l’identificazione e la caratterizzazione dei linfociti infiltrati dal SNC e sarà utile per la nostra comprensione di come i linfociti sono coinvolti nello sviluppo della malattia autoimmune del SNC.

Introduction

Come una malattia cronica demistelinating del SNC, MS colpisce circa 2,5 milioni di persone in tutto il mondo e manca di trattamenti curativi¹. È anche considerata una malattia autoimmune, in cui i linfociti T specifici dell’antigene mielina avviano una reazione infiammatoria e portano alla demelinazione e alle lesioni assonali nel SNC². L’encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) è stata ampiamente utilizzata per studiare i meccanismi patogeni della SM come un classico modello di malattia di demyelination autoimmune in CNS³. Ci sono due modi per indurre EAE: uno è quello di indurre EAE attivamente immunizzando gli animali con componenti mielin, un altro è il trasferimento adottivo trasferendo le cellule T encefalogeniche nel^{recettore 2,4,5}. Le suscettibilità a EAE sono diverse in diversi ceppi animali⁶. Nei topi C57BL/6, la glicoproteina mielina oligodendrocite (MOG) 35-55 induce una malattia monofasica con estatissima demelinazione e infiammazione nel SNC, che viene spesso utilizzata negli esperimenti con topi gene-mirati⁷.

La generazione di cellule T reattive specifiche della mielina è necessaria per l’insorgenza e lo sviluppo della malattia nell’EAE ed è un segno immunologico sia di EAE che di SM. I linfociti T autoreattivi attivati attraversano la barriera ematica del cervello (BBB) nel SNC sano e avviano la malattia EAE. Quando si incontra MOG 35-55 Ag, questi linfociti T inducono infiammazione e il reclutamento di cellule estruse nel SNC, con conseguente demielinazione e distruzione dell’assone^8,9. Nel modello EAE, ci sono ampie prove che le cellule CD4 specifiche del neuroantigeno^possono avviare e sostenere la neuroinfiammazione e la^{patologia 3,10}. A seconda delle principali citochine prodotte, i linfociti^CD4 e T sono stati classificati in diversi sottoinsiemi: Th1 (caratterizzato dalla produzione di interferone-γ), Th2 (caratterizzato dalla produzione di interleuchina 4) e Th17 (caratterizzato dalla produzione di interleuchina 17). Si ritiene che l’attivazione delle cellule Th1 e Th17 contribuisca all’induzione, al mantenimento e alla regolazione della demistelinazione infiammatoria in EAE e MS secernendo le citochine effettore IFN-γ e IL-17, che sono in grado di attivare macrofagi e reclutare neutroni nei siti infiammatori per accelerare le lesioni¹¹.

Poiché le cellule T autoreattive attraversano il BBB nel SNC e inducono lo sviluppo della malattia nella SM e nell’EAE, è molto importante analizzare le cellule T nel SNC. Tuttavia, ci sono pochissimi protocolli stabiliti per l’isolamento dei linfociti dal CNS¹². Pertanto, è stato sviluppato un metodo ottimizzato per isolare le cellule mononucleari dal cervello e analizzare i linfociti T con marcatori CD45, CD11b, CD3, CD4, INF-g e IL-17 per la citometria di flusso. Il metodo utilizza MOG35-55 adiuvante Mycobacterium tuberculosis H37 Ra e Pertussis Toxin Working Solution (PTX) per indurre un modello di immunizzazione attiva di EAE nei topi. Quindi, i metodi di separazione meccanica e di centrifugazione del gradiente di densità vengono utilizzati per l’isolamento delle cellule mononucleari CNS. Infine, viene utilizzata una strategia ottimizzata di gating della citometria del flusso per identificare i linfociti T e i sottoinsiemi dal cervello colorando più marcatori.

Protocol

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dal comitato animali della Scuola di Scienze Mediche Di Base, Shanghai Jiao Tong University. 1. Preparazione dei materiali Utilizzare la sequenza MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK di MOG35–55 per ottenere il peptide liofilizzato da fonti commerciali. Assicurarsi che la purezza del peptide sia >95%. Preparare la soluzione di stock MOG da 10 mg/mL in una salina tamponata di fosfati (PBS) e conservarla a -20 gradi centigradi. Preparare una soluzione di stock di 4 mg/mL di M. tuberculosis H37 Ra mettendo un tubo da 100 mg di M. tuberculosis H37 Ra in 25 mL di Complete Freund’s Adjuvant (CFA) e miscelazione. Conservare la soluzione di magazzino a -20 gradi centigradi. Preparare la soluzione di lavoro ptxin toxin (PTX) di ng/L Pertussis aggiungendo 50 g di PTX in 50 mL di PBS. Conservare la soluzione funzionante a -20 gradi centigradi. Memorizzare tutti gli anticorpi (ad esempio, FITC anti-mouse CD3, PE/Cy7 anti-mouse CD4, PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD11b, Alexa Fluor700 anti-mouse CD45.2, PE anti-mouse IL-17A, e APC anti-mouse IFN-γ) a 4 gradi centigradi. Rendere il Flow Cytometry Staining (FCS) Buffer aggiungendo 2 mM diamine diamine acido tetraacetico (EDTA) e 1% siero bovino fetale (FBS) in 500 mL di PBS. 2. Alloggiamento di topi C57BL/6 Utilizzare topi femmina C57BL/6 a 8-12 settimane di età. Acclimate C57BL/6J topi per almeno 7 giorni prima dell’iniezione. I topi domestici in un impianto animale in condizioni di senza agenti patogeni a temperatura e umidità costanti in un ciclo chiaro/scuro di 12 h e forniscono libero accesso all’acqua e agli alimenti standard per pellet. 3. Immunizzazione dei topi C57BL/6 Lasciare tutte le soluzioni di magazzino per 15 min a temperatura ambiente (RT) per garantire una completa reidratazione. Diluire 300 L della soluzione di stock MOG-peptide con 700 L di PBS per la preparazione di una soluzione di lavoro da 3 mg/mL. Mettere 1 mL di M. tuberculosis H37 Ra soluzione stock e 1 mL di MOG35-55 peptides soluzione di lavoro in siringhe separate 10 mL, quindi utilizzare un cazzo di arresto a quattro modi per emulsionare per almeno 10 min. Garantire l’emulsione completa prima dell’iniezione. Anestesizzare i topi al culmine dell’EAE con un’iniezione intraperitoniale dell’1% di pentobarbital di sodio (50 mg/kg). Con una siringa da 1 mL, iniettare sottocutaneamente i topi con 100 L di un’emulsione MOG 35–55/CFA (300 g/200 l) in due siti, entrambi nella parte posteriore vicino al collo. Iniettare sottocutaneamente topi di controllo con 200 L di PBS. Lo stesso giorno (giorno 0) e il giorno 2 dopo l’immunizzazione (PI), iniettare intraperitonealmente i topi con 200 L di 1 ng/L PTX soluzione di lavoro. Topi di controllo iniettati intraperitonealmente con 200 L di PBS. Trasferire i topi nella loro gabbia di casa con un pad riscaldante. Esaminare e classificare tutti i topi ogni giorno dopo l’iniezione in modo accecato per i segni neurologici mostrati nella tabella 111,13. Eutanasia gli animali se i punteggi sono peggiori di grado 4. Registrare i cambiamenti di peso durante il corso della malattia. Si tratta di una misura aggiuntiva preziosa per l’attività della malattia nel modelloEAE 11,13. Aggiungere il primo giorno di segni clinici per i singoli topi e dividere per il numero di topi nel gruppo; il risultato è l’insorgenza. Aggiungere il primo giorno del punteggio massimo EAE per i singoli topi e dividere per il numero di topi nel gruppo; il risultato è il picco. 4. Preparazione delle sospensioni a uni cellula dal cervello Diluire il gradiente di densità medio nel rapporto 9:1 con PBS in un tubo conico da 15 mL per produrre una soluzione finale al 100%. Anestesizzare i topi al picco dell’EAE con un’iniezione intraperitoniale dell’1% di pentobarbital di sodio (50 mg/kg) e perfuse intracardially con 20 mL di PBS sterile ghiacciato. Raggiungere questo problema iniettando lentamente e costantemente PBS nel ventricolo sinistro del cuore utilizzando una siringa da 20 mL e aprendo l’atrio destro. Tagliare il cranio con attenzione dal naso al collo, quindi rimuovere il cervello dalla scatola cranica in 10 mL di RPMI in tubi conici da 50 mL. Mescolare bene per rimuovere i globuli rossi aderenti. Quindi rimuovere il mezzo per aspirazione e aggiungere 10 mL di RPMI. Mettere il cervello e il mezzo in un piatto da 100 mm. Tritare finemente con una lama di rasoio. Trasferire 6 mL dal piatto a un omogeneizzatore di vetro sintered da 7 mL ghiacciato con una pipetta pulita. Evitare di lasciare grandi quantità di tessuto nella pipetta. Una piccola quantità è inevitabile. Macinare il cervello utilizzando prima lo stantuffo “sciolto” del pestello, quindi utilizzare lo stantuffo “stretto” fino a quando la sospensione è omogenea, e versare in un tubo conico prechilled 15 mL e tenere sul ghiaccio. Dopo che tutti i campioni sono omogeneizzati, stimare il volume. Regolare il volume con RPMI a 7 mL. Quindi mettere 3 mL di matrice di membrana 100% intercarica ghiacciata in un tubo di centrifugazione conica refrigerata di 15 mL e aggiungere 7 mL dell’omogenea cerebrale per produrre un mezzo di pendenza di densità finale del 30%. Mescolare per inversione un paio di volte. Non vortice. Per garantire un’interfaccia nitida, aggiungere con attenzione e lentamente 1 mL del 70% di pendenza di densità di underlay media in RPMI con una pipetta da 3 mL. Centrifuga a 800 x g per soli 20 minuti a 4 gradi centigradi. Impostare l’accelerazione su 1 e decelerazione su 0. Dopo la centrifugazione, aspirare quasi tutta la fase superiore, facendo attenzione a rimuovere completamente la mielina in alto (Figura 1). Rimuovere l’interfaccia in un nuovo tubo di centrifuga 15. Regolare il volume a 10 mL con RPMI. Centrifuga a 500 x g per 10 min. Dopo la centrifugazione, aspirare il supernante. Risuosire il pellet in 200 usd di buffer di colorazione della citometria di flusso (FSC). I pellet sono quindi pronti a macchiare per FACS. 5. Analisi citometrica del flusso di singole cellule dal cervello Utilizzare un emocitometro e un microscopio per contare le cellule. Aggiungete 10 L delle cellule a 10 L di blu di meta, mescolate bene e posizionate 10 L su un emocitometro per contare le cellule. Quindi calcolare il numero di cellule vive per microlitore al microscopio invertito (ad esempio, microscopio invertito Olympus). Aliquot circa 2 x 106 di cellule in RPMI in un singolo pozzo di una piastra di 96 bene. Aggiungere ai pozzi il cocktail di stimolazione cellulare 500x più gli inibitori del trasporto proteico. Incubare la piastra nell’incubatrice a 37 gradi centigradi per 4 h. Centrifugare le cellule a 400 x g per 5 min a RT. Scartare il supernante e rispendere le cellule in 100 lL di FCS Buffer. Preincubare le cellule con blocco CD16/CD32 Fc anti-mouse (1:33) per 10 min a 4 gradi centigradi prima di colorare per bloccare le interazioni non specifiche mediate da Fc. Marcatori di superficie delle cellule macchiate senza lavaggio. Aggiungere gli anticorpi anti-mouse CD45.2 (1:200), anti-mouse CD11b (1:200), anti-mouse CD3 (1:200) e anti-mouse CD4 (1:200).NOTA: Per determinare i cancelli positivi e negativi, una fluorescenza meno uno (FMO) per ogni colore e un anticorpo di controllo isotipo devono essere macchiati. Incubare la piastra per almeno 30 minuti a 4 gradi centigradi o sul ghiaccio. Proteggere dalla luce. Lavare le celle aggiungendo FCS Buffer. Utilizzare 200 l/well per piastre di microtiter. Centrifuga a 400 x g per 5 min a RT. Scartare il supernante. Aggiungere 200 L di buffer di fissazione intracellulare (IC) a ciascuno bene per fissare le celle. Assicurarsi che le celle siano completamente risspettete nella soluzione. Incubare 30-60 min a RT. Proteggere dalla luce. Centrifugare i campioni a 400 x g a RT per 5 min. Scarta il supernatant. Aggiungere 200 L di 1x buffer di permeabilizzazione ad ogni pozzo e centrifugare i campioni a 400 x g a RT per 5 min. Scarta il supernatant. Risundere il pellet in volume residuo e regolare il volume a circa 100 L con 1x buffer di permeabilizzazione. Aggiungere anticorpi anti-mouse IL-17A (1:200) e anti-mouse IFN-g (1:200) per il rilevamento di antigeni intracellulari alle cellule. Incubare per almeno 30 min a 4 gradi centigradi. Proteggere dalla luce. Aggiungere 100 L di 1x buffer di permeabilizzazione ad ogni pozzo e centrifugare i campioni a 400 x g a RT per 5 min. Scarta il supernatant. Riesposo le celle macchiate in 100 L di buffer di colorazione della citometria di flusso. Analizzare per citometria di flusso.NOTA: le impostazioni del laser e della compensazione sul citometro di flusso vengono regolate, i campioni vengono posizionati sul citometro e tutti gli eventi vengono registrati secondo le raccomandazioni del produttore. 6. Analisi dei dati Singlet di gate che utilizzano FSC-A vs FSC-H e SSC-A vs SSC-H. Gate celle vive utilizzando FSC-A e SSC-A in base alle dimensioni. Successivamente, identificare i leucociti, esclusi i monociti, gating su CD45- CD11b- cellule. Quindi, identificare i linfociti T CD4 gating su cellule CD3-CD4. Infine, identificare i sottoinsiemi Th1 e Th17 tramite gating sulle celle IFN-γ e le celle IL-17 e determinare le popolazioni positive e negative utilizzando i controlli isotipi e FMO.

Representative Results

Dopo l’immunizzazione dei topi C57BL/6, tutti i topi sono stati pesati, esaminati e classificati quotidianamente per segni neurologici. Il corso clinico rappresentativo di EAE dovrebbe provocare una curva della malattia come presentato nella Figura 2A e un cambiamento del peso corporeo nel topo come presentato nella figura 2B. I topi C57BL/6 immunizzati con MOG35-55 di solito hanno iniziato a sviluppare sintomi di malattia intorno al giorno 10-12 e hanno raggiun…

Discussion

Questo studio presenta un protocollo per indurre e monitorare l’EAE utilizzando MOG35-55 nei topi C57BL/6, che sono considerati un tipico modello animale sperimentale neuroimmunico della MS. Ad esempio, l’uso di peptidi PLP139–151 nei topi SJL può indurre un corso di malattia EAE recidivante che è particolarmente adatto per valutare gli effetti terapeutici sulle ricadute¹⁵. La procedura sperimentale qui descritta può essere applicata anche ad altri protocolli EAE⁷. In …

Materials

Alexa Fluor700 anti-mouse CD45.2	eBioscience	56-0454-82
Anti-Mouse CD16/CD32 Fc block	BioLegend	101302
APC anti-mouse IFN-g	eBioscience	17-7311-82
BD LSRFortessa X-20	BD
Dounce homogenizer	Wheaton	353107542
eBioscience Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) (500X)	eBioscience	00-4975-03
eBioscience Intracellular Fixation & Permeabilization Buffer Set	eBioscience	88-8824-00
FITC anti-mouse CD3	BioLegend	100203
FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody	BioLegend	400605
Freund's Adjuvant Complete (CFA)	Sigma-Aldrich	F5881
Mouse IgG2a kappa Isotype Control (eBM2a), Alexa Fluor 700, eBioscience	eBioscience	56-4724-80
Mycobacterium tuberculosis H37 Ra	Difco Laboratories	231141
PE anti-mouse IL-17A	eBioscience	12-7177-81
PE/Cy7 anti-mouse CD4	BioLegend	100422
PE/Cy7 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody	BioLegend	400617
Percoll	GE	17-0891-01
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD11b	BioLegend	101228
PerCP/Cy5.5 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody	BioLegend	400631
pertussis toxin (PTX)	Sigma-Aldrich	P-2980
Rat IgG1 kappa Isotype Control (eBRG1), APC, eBioscience	eBioscience	17-4301-82
Rat IgG2a kappa Isotype Control (eBR2a), PE, eBioscience	eBioscience	12-4321-80
Rat MOG35–55 peptides	Biosynth International		MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK