Questo manoscritto presenta un protocollo per indurre l'encefalomielite autoimmune sperimentale attiva (EAE) nei topi. Viene inoltre presentato un metodo per l'isolamento e la caratterizzazione dei linfociti infiltrati nel sistema nervoso centrale (CNS) per mostrare come i linfociti siano coinvolti nello sviluppo della malattia autoimmune del SNC.
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Articolo metodologico
Analisi citometrica del flusso dell'infiltrazione di linfociti nel sistema nervoso centrale durante l'encefalomielite autoimmune sperimentale
In questo articolo
Sommario
Abstract
La sclerosi multipla (MS) è una malattia autoimmune del sistema nervoso centrale (SNC) causata dalla combinazione di fattori ambientali e background genetico suscettibile. L'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) è un modello tipico di malattia della SM ampiamente utilizzato per studiare la patogenesi in cui i linfociti T specifici per gli antigeni della mielina avviano una reazione infiammatoria nel SNC. È molto importante valutare come i linfociti nel SNC regolano lo sviluppo della malattia. Tuttavia, l'approccio per misurare la quantità e la qualità dei linfociti infiltrati nel SNC è molto limitato a causa delle difficoltà nell'isolare e rilevare i linfociti infiltrati dal cervello. Questo manoscritto presenta un protocollo per che è utile per l'isolamento, l'identificazione e la caratterizzazione dei linfociti infiltrati dal SNC e sarà utile per la nostra comprensione di come i linfociti sono coinvolti nello sviluppo della malattia autoimmune del SNC.
Introduzione
Come una malattia cronica demistelinating del SNC, MS colpisce circa 2,5 milioni di persone in tutto il mondo e manca di trattamenti curativi1. È anche considerata una malattia autoimmune, in cui i linfociti T specifici dell'antigene mielina avviano una reazione infiammatoria e portano alla demelinazione e alle lesioni assonali nel SNC2. L'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) è stata ampiamente utilizzata per studiare i meccanismi patogeni della SM come un classico modello di malattia di demyelination autoimmune in CNS3. Ci sono due modi per indurre EAE: uno è quello di indurre EAE attiva....
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Protocollo
Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dal comitato animali della Scuola di Scienze Mediche Di Base, Shanghai Jiao Tong University.
1. Preparazione dei materiali
- Utilizzare la sequenza MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK di MOG35–55 per ottenere il peptide liofilizzato da fonti commerciali. Assicurarsi che la purezza del peptide sia >95%. Preparare la soluzione di stock MOG da 10 mg/mL in una salina tamponata di fosfati (PBS) e conservarla a -20 gradi centigradi.
- Preparare una soluzione di stock di 4 mg/mL di M. tuberculosis H37 Ra mettendo un tubo da 100 mg di M. tuberculosis H37 Ra in 25 mL di Complete F....
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Risultati
Dopo l'immunizzazione dei topi C57BL/6, tutti i topi sono stati pesati, esaminati e classificati quotidianamente per segni neurologici. Il corso clinico rappresentativo di EAE dovrebbe provocare una curva della malattia come presentato nella Figura 2A e un cambiamento del peso corporeo nel topo come presentato nella figura 2B. I topi C57BL/6 immunizzati con MOG35-55 di solito hanno iniziato a sviluppare sintomi di malattia intorno al giorno 10-12 e hanno raggiun.......
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Discussione
Questo studio presenta un protocollo per indurre e monitorare l'EAE utilizzando MOG35-55 nei topi C57BL/6, che sono considerati un tipico modello animale sperimentale neuroimmunico della MS. Ad esempio, l'uso di peptidi PLP139–151 nei topi SJL può indurre un corso di malattia EAE recidivante che è particolarmente adatto per valutare gli effetti terapeutici sulle ricadute15. La procedura sperimentale qui descritta può essere applicata anche ad altri protocolli EAE7. In quest.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata sostenuta dalla sovvenzione della National Natural Science Foundation of China (31570921 a ,J, 81571533 a LS), dalla Commissione Municipale di Pianificazione Della Salute di Shanghai e dalla Pianificazione Familiare (201540206 a J), dalla sovvenzione per la ricerca del Ruijin Hospital North (dal 2017 alla J).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor700 anti-topo CD45.2 | eBioscience | 56-0454-82 | |
| Anti-topo CD16/CD32 Blocco Fc | BioLegend | 101302 | |
| APC anti-topo IFN-g | eBioscience | 17-7311-82 | |
| BD LSRFortessa X-20 | BD | ||
| Omogeneizzatore a balze | Wheaton | 353107542 | |
| eBioscience Cocktail di stimolazione cellulare (più inibitori del trasporto delle proteine) (500X) | eBioscience | 00-4975-03 | |
| eBioscience Fissazione intracellulare e Set di tamponi per permeabilizzazione | eBioscience | 88-8824-00 | |
| FITC anti-topo CD3 | BioLegend | 100203 | |
| FITC Rat IgG2b, κ Isotipo Ctrl Anticorpo | BioLegend | 400605 | |
| Adiuvante di Freund completo (CFA) | Sigma-Aldrich | F5881 | |
| Mouse IgG2a kappa Isotype Control (eBM2a), Alexa Fluor 700, eBioscience | eBioscience | 56-4724-80 | |
| Mycobacterium tuberculosis H37 Ra | Difco Laboratories | 231141 | |
| PE anti-topo IL-17A | eBioscience | 12-7177-81 | |
| PE/Cy7 anti-topo CD4 | BioLegend | 100422 | |
| PE/Cy7 Rat IgG2b, κ Isotipo Ctrl Anticorpo | BioLegend | 400617 | |
| Percoll | GE | 17-0891-01 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-topo CD11b | BioLegend | 101228 | |
| PerCP/Cy5.5 Rat IgG2b, κ Isotipo Ctrl Anticorpo | BioLegend | 400631 | |
| tossina della pertosse (PTX) | Sigma-Aldrich | P-2980 | |
| Rat IgG1 kappa Isotype Control (eBRG1), APC, eBioscience | eBioscience | 17-4301-82 | |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control (eBR2a), PE, eBioscience | eBioscience | 12-4321-80 | |
| Rat MOG35– 55 peptidi | Biosynth International | MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK |
Riferimenti
- Milo, R., Kahana, E. Multiple sclerosis: geoepidemiology, genetics and the environment. Autoimmunity Reviews. 9, 387-394 (2010).
- Gold, R., Linington, C., Lassmann, H.
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Ristampe e permessi
