Ottimizzazione per il sequenziamento e l'analisi di campioni FFPE-RNA degradati

Yelena Levin; Keyur Talsania; Bao Tran; Jyoti Shetty; Yongmei Zhao; Monika Mehta

doi:10.3791/61060

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Articolo metodologico

Ottimizzazione per il sequenziamento e l'analisi di campioni FFPE-RNA degradati

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DOI:

10.3791/61060

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8 giugno 2020

Yelena Levin^*¹ , Keyur Talsania^*¹^,² , Bao Tran¹ , Jyoti Shetty¹ , Yongmei Zhao¹^,² , Monika Mehta¹

¹NCI CCR Sequencing Facility, Frederick National Laboratory for Cancer Research, ²Advanced Biomedical and Computational Sciences, Frederick National Laboratory for Cancer Research

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo metodo descrive i passaggi per migliorare la qualità e la quantità dei dati di sequenza che possono essere ottenuti da campioni di RNA incorporati in paraffina fissata alla formalina (FFPE). Descriviamo la metodologia per valutare in modo più accurato la qualità dei campioni di FFPE-RNA, preparare le librerie di sequenziamento e analizzare i dati provenienti da campioni DI FFPE-RNA.

Abstract

L'analisi dell'espressione genica mediante il sequenziamento dell'RNA (RNA-seq) consente informazioni uniche su campioni clinici che possono potenzialmente portare a una comprensione meccanicistica della base di varie malattie, nonché ai meccanismi di resistenza e/o suscettibilità. Tuttavia, i tessuti FFPE, che rappresentano il metodo più comune per preservare la morfologia dei tessuti nei campioni clinici, non sono le migliori fonti per l'analisi della profilazione dell'espressione genica. L'RNA ottenuto da tali campioni è spesso degradato, frammentato e modificato chimicamente, il che porta a librerie di sequenziamento non ottimali. A loro volta, questi generano dati di sequenza di scarsa qualità che potrebbero non essere affidabili per l'analisi dell'espressione genica e la scoperta della mutazione. Al fine di sfruttare al meglio i campioni FFPE e ottenere i migliori dati possibili da campioni di bassa qualità, è importante prendere alcune precauzioni durante la pianificazione della progettazione sperimentale, la preparazione delle librerie di sequenziamento e durante l'analisi dei dati. Ciò include l'uso di metriche appropriate per un controllo qualità di esempio preciso (QC), l'identificazione dei metodi migliori per i vari passaggi durante la generazione della libreria di sequenziamento e un'attenta libreria QC. Inoltre, l'applicazione di strumenti software e parametri corretti per l'analisi dei dati di sequenza è fondamentale per identificare gli artefatti nei dati RNA-seq, filtrare la contaminazione e leggere di bassa qualità, valutare l'uniformità della copertura genica e misurare la riproducibilità dei profili di espressione genica tra le repliche biologiche. Questi passaggi possono garantire un'elevata precisione e riproducibilità per la profilazione di campioni di RNA molto eterogenei. Qui descriviamo i vari passaggi per il QC di esempio, la preparazione della libreria e il QC, il sequenziamento e l'analisi dei dati che possono contribuire ad aumentare la quantità di dati utili ottenuti da RNA di bassa qualità, come quello ottenuto dai tessuti FFPE-RNA.

Introduzione

L'uso di approcci di sequenziamento di nuova generazione ci ha permesso di ottenere una grande quantità di informazioni da vari tipi di campioni. Tuttavia, i campioni vecchi e mal conservati rimangono inutilizzabili per i metodi comunemente utilizzati per generare dati di sequenza e spesso richiedono modifiche a protocolli consolidati. I tessuti FFPE rappresentano un tale tipo di campione che è stato ampiamente utilizzato per i campioni clinici¹^,²^,³. Mentre la conservazione FFPE mantiene la morfologia dei tessuti, gli acidi nucleici nei tessuti FFPE di solito presentano una v....