Presentato qui è il protocollo per un saggio chemiotaxis in situ, un dispositivo microfluidico recentemente sviluppato che consente studi di comportamento microbico direttamente nell'ambiente.
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Articolo metodologico
In Situ Chemotaxis Assay per esaminare il comportamento microbico negli ecosistemi acquatici
In questo articolo
Sommario
Abstract
I comportamenti microbici, come la motilità e la chemiotaxis (la capacità di una cellula di alterare il suo movimento in risposta a un gradiente chimico), sono diffusi nei domini batterici e archeali. La chemitaxis può comportare notevoli vantaggi di acquisizione delle risorse in ambienti eterogenei. Svolge anche un ruolo cruciale nelle interazioni simbiotiche, nelle malattie e nei processi globali, come il ciclo biogeochimico. Tuttavia, le tecniche attuali limitano la ricerca sulla chemiotaxis al laboratorio e non sono facilmente applicabili sul campo. Presentato qui è un protocollo passo-passo per la distribuzione del saggio in situ chemiotaxis (ISCA), un dispositivo che consente un robusto interrogatorio di chemiotaxis microbica direttamente nell'ambiente naturale. L'ISCA è un dispositivo microfluidico costituito da un array di 20 possilui, in cui possono essere caricate sostanze chimiche di interesse. Una volta impiegate in ambienti aque, le sostanze chimiche si diffondono fuori dai pozzi, creando gradienti di concentrazione che i microbi percepiscono e rispondono nuotando nei pozzi tramite chemiotaxis. Il contenuto dei beni può quindi essere campionato e utilizzato per (1) quantificare la forza delle risposte chemiotatiche a composti specifici attraverso la citometria del flusso, (2) i microrganismi reattivi isolati e della coltura e (3) caratterizzare l'identità e il potenziale genomico delle popolazioni che rispondono attraverso tecniche molecolari. L'ISCA è una piattaforma flessibile che può essere impiegata in qualsiasi sistema con una fase molto aque, compresi gli ambienti marini, d'acqua dolce e del suolo.
Introduzione
Diversi microrganismi utilizzano motilità e chemiotaxis per sfruttare ambienti nutritivi patchy, trovare ospiti, o evitare condizioni deleteri1,2,3. Questi comportamenti microbici possono a loro volta influenzare i tassi di trasformazione chimica4 e promuovere partenariati simbiotici tra gli ecosistemi terrestri, d'acqua dolce e marini2,5.
La chemitaxis è stata ampiamente studiata in condizioni di laboratorio negli ultimi 60 anni6. Il primo me....
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Protocollo
Si consiglia di eseguire la sezione 1 prima degli esperimenti sul campo per ottimizzare i risultati.
1. Ottimizzazione di laboratorio
NOTA: i volumi descritti nella procedura di ottimizzazione sono sufficienti per un singolo ISCA (composto da 20 pozzetti).
- Preparazione della sostanza chimica di interesse
NOTA: La concentrazione ottimale per ogni chemioattractant spesso deve essere determinata in condizioni di laboratorio prima delle distribuzioni sul campo. Il campo di concentrazione chimica diminuirà di grandezza con la distanza dalla fonte (pozzo ISCA), il che significa che la concentrazione sperim....
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Risultati
Questa sezione presenta i risultati di laboratorio utilizzando l'ISCA per testare la risposta chemiotattica dei microbi marini a una gamma di concentrazione di glutammina, un aminoacido noto per attirare i batteridel suolo 14. La concentrazione di glutammina che ha suscitato la risposta chemiotatica più forte nei test di laboratorio è stata utilizzata per eseguire un saggio di chemiotaxis nell'ambiente marino.
Per eseguire i test di laboratorio, le comunità di acqua di .......
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Discussione
Alla scala dei microrganismi acquatici, l'ambiente è tutt'altro che omogeneo ed è spesso caratterizzato da gradienti fisici/chimici che strutturano le comunità microbiche1,15. La capacità dei microrganismi motile di utilizzare il comportamento (cioè la chemiotaxis) facilita il foraggiamento all'interno di questi microambimi eterogenei1. Lo studio della chemitaxis direttamente nell'ambiente ha il potenziale per identificare importanti inter.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata finanziata in parte dalla Gordon and Betty Moore Foundation Marine Microbiology Initiative, attraverso la sovvenzione GBMF3801 a J.R.S. e R.S., e un Investigator Award (GBMF3783) a R.S., così come una borsa di studio dell'Australian Research Council (DE160100636) a J.B.R., un premio della Simons Foundation a B.S.L. (5941111), e una sovvenzione dalla Simons Foundation (542395) a R.S. come parte dei Principi di Ecosistema Microbiale (PriME) PriME.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Colla acrilica | Evonik | 1133 | Acrifix 1S 0116 |
| Lastra acrilica | McMaster-Carr | 8505K725 | O altra azienda |
| Nastro adesivo | Scotch | 3M 810 | Scotch Magic tape |
| Autoclave | Systec | D-200 | O altra azienda |
| Centrifuga da banco | Fisher Scientific | 75002451 | O altra azienda |
| Corda elastica | Paracord Planet | 667569184000 | Or different company |
| Provetta da centrifuga - 2 mL | Sigma Aldrich | BR780546-500EA | Provetta Eppendorf Provetta |
| da centrifuga conica - 15 mL | Scientific | 11507411 | Provetta Falcon Provetta |
| da centrifuga conica - 50 mL | Fisher Scientific | 10788561 Provetta Falcon | |
| Braccio di distribuzione | Irwin | 1964719 | O un'altra azienda |
| Spina dell'involucro di distribuzione | Fisher Scientific | 21-236-4 | Vedi le alternative nel manoscritto |
| Tergicristalli usa e getta | Kimtech - Fisher Scientific | 06-666 | Kimwipes |
| Citometro | a flusso Beckman | C09756 | CYTOFlex |
| Glutaraldehyde 25% | Sigma Aldrich | G5882 | O altra azienda |
| Colorante fluorescente verde | Sigma Aldrich | S9430 | SYBR Green I - diluizione finale 1:10.000 |
| Cartuccia filtrante GP idrofila - 0,2 &; m | Merck | C3235 | Filtro Sterivex |
| Saggio di chemiotassi in situ (ISCA) | - | - | Contatta gli autori corrispondenti |
| Taglierina laser | Epilog Laser | Fusion pro 32 | O un'altra azienda |
| Luria Bertani Brodo | Sigma Aldrich | L3022 | O un'altra azienda |
| Marine Brodo 2216 | VWR | 90004-006 | Difco |
| Nylon viti a testa piatta con intaglio | McMaster-Carr | 92929A243 | M 2 &volte; 4 &volte; 8 mm |
| Set di pipette | Fisher Scientific | 05-403-151 | O un'altra azienda |
| Puntali per pipette - 1 mL | Fisher Scientific | 21-236-2A | O un'altra azienda |
| Puntali per pipette - 20 µ L | Fisher Scientific | 21-236-4 | O un'altra azienda |
| Puntali per pipette - 200 µ L | Fisher Scientific | 21-236-1 | O un'altra azienda |
| Sale marino | Sigma Aldrich | S9883 | Per acqua di mare artificiale |
| Pipetta sierologica - 50 mL | Sigma Aldrich | SIAL1490-100EA | O un'altra azienda |
| Filtro per siringa - 0,02 &; m | Whatman | WHA68091002 | Filtro Anatop |
| Filtro per siringa - 0,2 µ m | Fisher Scientific | 10695211 | O altra azienda |
| Ago per siringa 27G | Henke Sass Wolf | 4710004020 | 0,4 &volte; 12 mm |
| Siringhe - 1 mL | Codau | 329650 | Siringhe per insulina Luer U-100 |
| - 10 mL | BD | 303134 | O altra azienda |
| Siringhe - 50 mL | BD | 15899152 | O altra azienda |
| Tubo rack - 15 mL | Thomas Scientific | 1159V80 | O un'altra azienda |
| Rack per provette - 50 mL | Thomas Scientific | 1159V80 | O un'altra azienda |
| Rubinetto per uso generale in acciaio ad alta velocità non rivestito | McMaster-Carr | 8305A77 | O un'altra azienda |
| Filtro per vuoto - 0,2 µ m | Merck | SCGPS05RE | Filtro Steritop |
Riferimenti
- Stocker, R. Marine microbes see a sea of gradients. Science. 338, 628-633 (2012).
- Raina, J. B., Fernandez, V., Lambert, B., Stocker, R., Seymour, J. R. The role of microbial motility and chemotaxis in symbiosis. Nature Reviews Microbiology. 17, 284-294 (2019).
- Chet, I., A....
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Ristampe e permessi
Tag
Chemiotassi microbicaanalisi tramite citometria a flussoconcentrazione del chemoattrattanteterreno di coltura battericaprotocollo di implementazione sul campoarray di dispositivi microfluidiciquantificazione della risposta chemiotatticafiltrazione di soluzioni sterilicampionamento di ecosistemi acquatici
