Presentiamo un protocollo dettagliato per il sistema di silenziamento dei microRNA (VbMS) basato sul virus della patata X (PVX) per caratterizzare funzionalmente i microRNA endogeni (miRNA) nella patata. Le molecole mimiche bersaglio (TM) di miRNA di interesse sono integrate nel vettore PVX ed espresse transitoriamente in patata per silenziare il miRNA bersaglio o la famiglia di miRNA.
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Articolo metodologico
Virus della patata Silenziamento del microRNA basato sull'X (VbMS) nella patata.
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il silenziamento di microRNA basato su virus (VbMS) è uno strumento rapido ed efficiente per la caratterizzazione funzionale dei microRNA (miRNA) nelle piante. Il sistema VbMS è stato sviluppato e applicato per varie specie vegetali tra cui Nicotiana benthamiana, pomodoro, Arabidopsis, cotone e piante monocotiledoni come grano e mais. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato che utilizza vettori VbMS basati su PVX per silenziare i miRNA endogeni nella patata. Per abbattere l'espressione di uno specifico miRNA, vengono progettate molecole bersaglio mimico (TM) di miRNA di interesse, integrate in vettori di virus vegetali ed espresse in patate dall'infiltrazione di Agrobacterium per legarsi direttamente al miRNA endogeno di interesse e bloccarne la funzione.
Introduzione
I microRNA vegetali (miRNA) sono caratterizzati da 20-24 RNA regolatori a base di nucleotidi, codificati nucleari1 e svolgono un ruolo fondamentale in quasi tutti gli aspetti dei processi biologici delle piante, tra cui crescita e sviluppo2,3, fotosintesi e metabolismo4,5,6,7, sintesi e segnalazione ormonale8,9, risposte biotiche e abiotiche10,
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Protocollo
1. Coltiva piante di patate.
- Propagare in vitro le piante di patate in tubi di coltura (25 x 150 mm) con mezzi Murashige e Skoog (MS) più la vitamina di Gamborg (miscela di sale basale MS, vitamina di Gamborg, 30 g/L di saccarosio, 3,5 g/L di agar, pH = 5,7). Posizionare i tubi nella stanza di crescita a meno di 20-22 °C, 16 ore di luce/8 ore di fotoperiodo scuro e intensità luminosa 120 μmol/m2∙s1.
NOTA: Nuovi germogli e radici normalmente si sviluppano in 1-2 settimane dalle piante. Propagare le piante con i mezzi vitaminici freschi di MS / Gamborg ogni mese. - Quattro settimane dopo, trapiantare piante in vitro nel terreno....
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Risultati
La Figura 2 mostra le piante di patata PVX-STTM165/166 (Katahdin) con crescita ectopica dei tessuti fogliari dal lato abassiale della lamina fogliare lungo le vene. Sono stati osservati anche fenotipi più gravi come la formazione di foglie a forma di tromba. Al contrario, non è stata osservata alcuna anomalia fenotipica negli impianti di controllo PVX. Questi risultati mostrano che il sistema VbMS era efficace nel sopprimere la funzione endogena dei miRNA nelle piante di patate tetraploidi e.......
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Discussione
Presentiamo un sistema silenziatore di miRNA basato su PVX per caratterizzare la funzione dei miRNA endogeni nella patata integrando il design STTM nel vettore PVX. Il sistema VbMS si è dimostrato efficace nel silenziare il miRNA165/166 nella patata, una famiglia di miRNA altamente conservata in tutte le specie vegetali.
L'approccio TM è stato sviluppato per interferire con l'espressione dei miRNA basati su un miRNA artificiale bersaglio mimico che è progettato per creare un ciclo di mismatch .......
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Ringraziamenti
Ringraziamo il Dr. Yule Liu della Tsinghua University per aver fornito il vettore PVX-LIC. Questo lavoro è stato supportato da un fondo di start-up del Texas A & M AgriLife Research e dal progetto Hatch TEX0-1-9675 dall'USDA National Institute of Food and Agriculture a JS.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 100 µ M dATP e 100 µ M dTTP | Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA | TQAC136 | |
| 3 M Acetato di sodio, pH 4.0. | Teknova, Hollister, CA 95023, USA | ||
| Acetosyringone | TCI America, Portland, OR 97203, USA | D2666-25G | |
| Agrobacterium tumefaciens ceppi: GV3101, GV2260 o EHA105. | |||
| Cloroformio | VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA | VWRV0757-950ML | |
| Dimetil solfossido, DMSO | TCI America, Portland, OR 97203, USA | D0798-25G | |
| DTT | VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA | VWRV0281-25G | |
| E. coli DB3.1 | per il mantenimento di PVX-LIC e pTRV2e contenenti il gene ccdB | ||
| E. coli DH5&alfa; | per i costrutti di destinazione generati dalla clonazione LIC | ||
| Fertilizzante: Peters Peat Lite Special 15-0-15 Dark Weather Feed | ICL Specialty Fertilizers, Summerville, SC 29483, USA | G99260 | |
| Reagenti PCR ad alta fedeltà: KAPA HiFi DNA polimerasi con dNTP | Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems, Wilmington, MA, USA | 7958960001 | |
| Alcool | isoamilicoVWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA | VWRV0944-1L | |
| Koptec Etanolo puro – 200 Proof | Decon Labs, King of Prussia, PA 19406 , USA | V1005M | |
| MES | TCI America, Portland, OR 97203, USA | M0606-250G | |
| MgCl2 | ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA | MFCD00149781 | |
| Trascrittasi | inversa M-MuLVNew England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA | M0253L | |
| Spettrometro a nanogoccia: NanoDrop OneC Spettrofotometro UV-Vis a microvolume con Wi-Fi | ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA Macchina PCR ND-ONEC-W | ||
| : Bio-Rad MyCycler PCR System | Bio-Rad, Hercules, California 94547, USA | 170-9703 | |
| Macchina PCR: Eppendorf Mastercycler pro | Eppendorf, Hauppauge, NY 11788, USA | 950030010 | |
| pHmetro | Sper Scientific, Scottsdale, AZ 85260, USA | Misuratore di pH/mV da banco - 860031 | |
| Fenolo:cloroformio:alcol isoamilico (25:24:1), pH 6,7/8,0. | VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA | VWRV0883-400ML | |
| Phytagel: Gellan Gum | Alfa Aesar, Tewksbury, MA 01876, USA | J63423-A1 | |
| PVX VIGS vector: PVX-LIC | Zhao et al., 2016 | ||
| Macchina per PCR in tempo reale: QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA | 4485697 | |
| Reagente PCR in tempo reale: KAPA SYBR® Kit FAST qPCR Master Mix (2x) | Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems, Wilmington, MA 01887, USA | 7959389001 | |
| Enzima di restrizione: SmaI | New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA | R0141S | |
| Reagenti per trascrizione inversa: qScript cDNA SuperMix | Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD 20877 , USA | 95107-100 | |
| Kit di estrazione dell'RNA: E.Z.N.A. Plant RNA Kit | Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA | SKU: D3485-01 | |
| Inibitore della RNasi Murine | New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA | M0314L | |
| RNAzol RT | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103, USA | R4533 | |
| Suolo: Metro-Mix 360 | Sun Gro Horticulture, Agawam, MA 01001-2907, USA | Metro-Mix 360 | |
| T4 DNA polimerasi e tampone | New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA | M0203S |
Riferimenti
- Axtell, M. J., Meyers, B. C. Revisiting Criteria for Plant MicroRNA Annotation in the Era of Big Data. The Plant Cell. 30 (2), 272-284 (2018).
- Chen, X. Small RNAs and Their Roles in Plant Development. Annual Review of Cell and Developmental Biology....
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Ristampe e permessi
