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Articolo metodologico

Un'analisi planaria di Motility per misurare le proprietà biomodulanti dei prodotti naturali

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DOI:

10.3791/61070

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30 maggio 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State University of New York (SUNY) at Morrisville

In questo articolo

Sommario

La motilità planaria viene utilizzata per misurare le proprietà stimolanti e di ritiro dei prodotti naturali rispetto al movimento degli animali solo nell'acqua di sorgente.

Abstract

Viene descritto un mezzo semplice e controllabile per utilizzare il planariano non parassita, Dugesia tigrina, un verme piatto acquatico vivente, per studiare le proprietà stimolanti e di ritiro dei prodotti naturali. I saggi sperimentali che beneficiano di aspetti unici della fisiologia planaria sono stati applicati agli studi sulla guarigione delle ferite, la rigenerazione e la tumorigenesi. Inoltre, poiché i planari mostrano sensibilità a una varietà di stimoli ambientali e sono in grado di apprendere e sviluppare risposte condizionate, possono essere utilizzati in studi comportamentali che esaminano l'apprendimento e la memoria. I planari possiedono una simmetria bilaterale di base e un sistema nervoso centrale che utilizza sistemi di neurotrasmettitori su cui è possibile studi che esaminano gli effetti dei biomodulatori neuromuscolari. Di conseguenza, sono stati sviluppati sistemi sperimentali che monitorano il movimento planaria e la motilità per esaminare la dipendenza da sostanze e il ritiro. Poiché la motilità planaria offre il potenziale per un sistema di analisi della motilità sensibile e facilmente standardizzato per monitorare l'effetto degli stimoli, il test di velocità del locomotore planaria (pLmV) è stato adattato per monitorare sia i comportamenti di stimolazione che di ritiro da parte dei planari attraverso la determinazione del numero di linee di griglia attraversate dagli animali con il tempo. Qui, la tecnica e la sua applicazione sono dimostrati e spiegati.

Introduzione

Il protocollo descritto utilizza la motilità planaria per fornire un mezzo per valutare gli effetti biomodulanti delle sostanze naturali. È stato specificamente adattato per determinare se queste sostanze funzionano come stimolanti, e se poi sono stati associati con un comportamento di astinenza misurabile1. Questo saggio, noto come il test di velocità locomotore planaria (pLmV), è stato utilizzato per testare noti agenti farmacologici2,3. L'applicazione di questo saggio planaria basato sulla motilità è da allora cresciuta in popolarità ed è stato adottato da diversi laboratori interessati a sostanze diverse dai prodottinaturali 4,5. Per questo esempio, un planariario viene posto in un piatto Petri contenente acqua di sorgente o acqua di sorgente contenente un biomodulatore disciolto. Poiché il piatto stesso è posto su carta millimetrata, il numero di linee della griglia attraversate dall'animale con il tempo mentre si muove sul contenitore può essere utilizzato per determinare la velocità di movimento in ogni condizione. Il test chiaro/scuro, altrimenti indicato come il test di preferenza posto condizionato (CPP), è un'altra variazione sul tema del monitoraggio della motilità planaria, e valuta quanto velocemente gli animali rispondono e migrano in un ambiente oscurato6,7. Il tracciamento video dei movimenti planari può anche essere analizzato utilizzando programmi informatici e il monitoraggio del centro di massa (COM)8,9,10,11.

L'utilizzo del planariano come modello animale per tali studi offre diversi vantaggi rispetto ad altri animali in quanto lo sperimentatore può facilmente controllare l'ambiente di analisi. In particolare, morire di fame i planariani prima della sperimentazione può impedire la loro esposizione ad altri agenti nutrizionali o farmacologici che potrebbero altrimenti confondere i risultati, e il biomodulatore specifico in esame può essere introdotto ai planari semplicemente aggiungendolo direttamente all'acqua di coltura, standardizzando così l'esposizione. Dal momento che i planari hanno un sistema nervoso e neurotrasmettitori che ricordano gli animali di ordine superiore, la fisiologia e le risposte sperimentali di questi animali agli stimoli neuromuscolari sono considerati biologicamente rilevanti per altri organismi12,13,14,15,16. Inoltre, poiché i planari sono relativamente economici e semplici da mantenere in laboratorio, offrono un modello biologico accessibile per molti ricercatori.

Come animale sperimentale, i planari sono adatti a una vasta gamma di studi. Ad esempio, il nostro gruppo, così come altri ricercatori utilizzano planariani per studiare la tumorigenesi17,18,19. I planariani presentano anche una serie di comportamenti di risposta agli stimoli chimici, termici, gravitazionali, elettrici, fotografici e magnetici che hanno costituito la base di altri sistemi di analisi. Alcuni di questi effetti sono stati utilizzati per studiare l'apprendimento e la memoria in questianimali 20,21,22,23,24,25,26,27. L'uso primario del modello planaria nella letteratura attualmente si concentra sull'attività delle cellule staminali pluripotenti planariari, chiamate neoblasti, e sul loro ruolo nellarigenerazione 28,29,30. Così, l'adozione del modello qui descritto consente un ulteriore studio utilizzando altri saggi a base planaria per fornire una comprensione più ampia di come i prodotti naturali e altri biomodulatori influenzano l'organismo.

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Protocollo

1. Allevamento planaria

  1. Utilizzare planarini acquistati da una società di fornitura biologica o selvatici catturati se necessario. I planari utilizzati in questo protocollo sono Dugesia tigrina, come elencato nella lista di fornitura. Questa specie è anche indicata come Girardia tigrina31. Altre specie planariari acquatiche sono accettabilianche 2,3.
    NOTA: Il protocollo descritto è orientato agli animali acquistati da una società di approvvigionamento biologico. Questo sistema di analisi non è stato testato con planari selvatici catturati. Tuttavia, se vengono utilizzati planarini catturati allo stato selvatico, si raccomanda che siano abituati all'acqua utilizzata negli esperimenti, così come all'ambiente di laboratorio per almeno 1 settimana prima dell'uso.
  2. All'arrivo, trasferire i planari in contenitori di stoccaggio di alimenti in plastica contenenti acqua di sorgente pulita e mantenere i coperchi socchiusa.
  3. Mantenere i planari in un ambiente buio.
  4. Nutrire i planari appena consegnati dopo 24-36 h nel loro nuovo ambiente.
  5. Consentire ai planari di acclimatarsi al laboratorio almeno 1 settimana prima della sperimentazione.
  6. Nutrire i planarini con un programma regolare di due volte a settimana.
    1. Lasciare che i planari di nutrire il libitum su uova sode biologiche tritate o fegato di manzo biologico miscelato per 1-2 h.
    2. Mettere i planarini nutriti in un contenitore pulito dopo l'alimentazione.
      1. Togliere l'acqua sporca dai planari.
      2. Utilizzare un piccolo pennello ad acquerello piatto (numero 3-6) per trasferire i detriti alimentari e la melma aderente al contenitore da circa planari a un tovagliolo di carta.
      3. Con acqua di sorgente fresca e vorticoso dolce vorticoso o agitazione, spostare planarini e versarli in un contenitore pulito.
      4. Tutti i planari che rimangono aderenti al contenitore possono essere trasferiti utilizzando un pennello ad acquerello rotondo (numero 3-6) o pipette di trasferimento con un foro largo.
      5. Decantare l'acqua di trasferimento.
      6. Coprire i planari con acqua di sorgente pulita.
      7. Dopo 24 h, togliere i planari da eventuali rifiuti alimentari espulsi trasferendoli in un contenitore pulito come descritto sopra (punti 1.6.2.1–1.6.2.6).
  7. Per pulire i contenitori e gli utensili utilizzati per l'allevamento planaria, non utilizzare sapone o detergente. Pulire questi oggetti risciacquandoli bene con acqua pulita (l'acqua del rubinetto è accettabile) e asciugandoli con un panno pulito o un tovagliolo di carta.

2. Preparazione dei planari per esperimenti

  1. Consentire ai planari appena consegnati di acclimatarsi al loro ambiente almeno 1 settimana prima della sperimentazione.
  2. Affamezzare i planari per 5-10 giorni prima della sperimentazione.
  3. Cambiare l'acqua della cultura almeno 1x durante il periodo di fame.

3. Test di velocità del locomotore planaria (pLmV): comportamenti stimolanti

  1. Prima della sperimentazione, assicurarsi che i planarini affamati siano completamente formati, con una testa e una coda complete e pigmentate.
  2. Preparare un piatto Petri in vetro o plastica da 10 cm e un contenitore di assuola per il test pLmV prima di iniziare l'esperimento.
    1. Posizionare un piatto Petri pulito di 10 cm di diametro da utilizzare per il test pLmV su carta griglia prelaminata (con quadrati di 0,5 cm).
    2. Aggiungere 20 mL di acqua di sorgente non adulterata per i controlli, o acqua di sorgente contenente l'adeguata concentrazione del prodotto naturale in fase di prova, al piatto Petri di 10 cm di diametro da utilizzare per la prova pLmV.
    3. Posizionare una telecamera (ad esempio, un telefono cellulare o una fotocamera ad alta risoluzione) sopra la piastra Petri di 10 cm di diametro preparata per registrare la motilità planaria sulla carta griglia durante l'esperimento. Un supporto ad anello è un modo conveniente per posizionare la fotocamera a una distanza che può registrare l'intera vista della piastra Petri di 10 cm e delle linee della griglia.
    4. Preparare un contenitore di assuzione con 5-10 mL di acqua di sorgente non adulterata (controlli) o acqua di sorgente contenente l'adeguata concentrazione del prodotto naturale in fase di test. Un contenitore simile a una fiala scintillazione o piccolo piatto Petri di 5 cm è adatto.
  3. Utilizzare un pennello ad acquerello piccolo, pulito, piatto o rotondo per trasferire delicatamente un planariano dal contenitore di stock con acqua di sorgente al contenitore di assuvazione con 5-10 mL di acqua di sorgente non adulterata o acqua di sorgente contenente il prodotto naturale in fase di test.
    NOTA: Quando si manipolano i planari per il test pLmV, utilizzare un pennello ad acquerello piccolo, pulito, piatto o rotondo (numero 3–6). Quando si spostano i planari, il pennello deve essere posizionato sotto l'animale per sollevarlo delicatamente. Per garantire che i planariani non siano danneggiati quando si utilizza il pennello, le setole del pennello non devono essere splayed sotto l'animale. La diffusione dalle setole potrebbe danneggiare il planaria se viene catturato tra le fibre del pennello.
    NOTA: Un'ampia pipetta di trasferimento del foro può essere utilizzata anche per trasferire il planariano in un contenitore di abituazione pulito e asciutto.
    1. Se si utilizza la pipetta, rimuovere l'acqua in eccesso spostata con il planariano dal contenitore di assuntezza utilizzando la pipetta di trasferimento.
    2. Aggiungere con attenzione la soluzione di assunazione (ad esempio, acqua di sorgente per i controlli o acqua di sorgente contenente la concentrazione di prodotto naturale in fase di prova) al contenitore di assunazione contenente il planariano.
  4. I periodi di assuzia dipenderanno dalla dinamica di stimolazione valutata per il prodotto naturale in fase di test. Un tempo di assuefazione di 2 min si è rivelato accettabile per rilevare la stimolazione in questolavoro 1.
  5. Dopo il periodo di assufizione di 2 minuti utilizzare un pennello ad acquerello per trasferire delicatamente il planariano al centro del piatto Petri preparato 10 cm per l'esperimento di stimolazione pLmV.
  6. Avviare la fotocamera per registrare il movimento del planariano. Registra 10-11 min di video.
  7. Preparare il contenitore di assuola e il piatto Petri da 10 cm per l'esperimento pLmV con soluzioni fresche per ogni planariano.
  8. Utilizzare pipette, piatti, contenitori e pennelli dedicati per ogni concentrazione sperimentale del prodotto naturale testato per evitare di esporre inavvertitamente i planari alla soluzione sbagliata durante la sperimentazione.
  9. Poiché i planari presentano comportamenti appresi, ogni planaria (controllo o test) deve essere utilizzato solouna volta 21,22.

4. Test di velocità del locomotore planaria (pLmV): comportamenti di ritiro

  1. Prima della sperimentazione, assicurarsi che i planarini affamati siano completamente formati, con una testa e una coda complete e pigmentate.
  2. Preparare un piatto Petri di 10 cm (vetro o plastica) per l'esperimento pLmV, un piatto Petri di 5 cm (vetro o plastica) per il risciacquo del planario dopo l'assuozione e un contenitore di assuola prima di iniziare l'esperimento.
    1. Posizionare un piatto Petri pulito di 10 cm di diametro da utilizzare per l'esperimento pLmV su carta griglia preminata con quadrati di 0,5 cm).
    2. Aggiungere 20 mL di acqua di sorgente non adulterata al piatto Petri di 10 cm di diametro da utilizzare per l'esperimento pLmV.
    3. Posizionare una telecamera sopra la piastra Petri di 10 cm di diametro preparata come nel punto 3.2.3 per registrare la motilità planaria sulla carta griglia durante l'esperimento.
    4. Preparare il contenitore di risciacquo planaria aggiungendo 5 mL di acqua di sorgente da solo al piatto Petri da 5 cm.
    5. Preparare un contenitore di assuzione con 5-10 mL di acqua di sorgente (controlli) non adulterati o acqua di sorgente contenente il prodotto naturale in fase di test. Un contenitore simile a una fiala scintillazione o piccolo piatto Petri 5 cm (vetro o plastica) è adatto.
  3. Utilizzare un pennello ad acquerello piccolo, pulito, piatto o rotondo per trasferire un planariario dall'acqua di sorgente al contenitore di assuntezza preparato con 5-10 mL di acqua di sorgente non adulterata (controlli) o acqua di sorgente contenente il prodotto naturale in fase di test. Spostare delicatamente l'animale dal contenitore di stoccaggio al contenitore di assuvazione. Assicurarsi che il planariano non sia danneggiato dal pennello.
    NOTA: Quando si manipolano i planari per il test pLmV, utilizzare un pennello ad acquerello piccolo, pulito, piatto o rotondo (numero 3–6). Quando si spostano i planari, il pennello deve essere posizionato sotto l'animale per sollevarlo delicatamente. Per garantire che i planariani non siano danneggiati quando si utilizza il pennello, le setole del pennello non devono essere splayed sotto l'animale. La diffusione dalle setole potrebbe danneggiare il planaria se viene catturato tra le fibre del pennello.
    NOTA: Una pipetta di trasferimento di fori ampia può essere utilizzata anche per trasferire il planariano in un contenitore di assunamento pulito e asciutto.
    1. Se si utilizza la pipetta, l'acqua in eccesso spostata con il planariano deve essere rimossa dal contenitore di assuntezza utilizzando la pipetta di trasferimento.
    2. Aggiungere con attenzione la soluzione di assunazione (ad esempio, acqua di sorgente non adulterata per i controlli o acqua di sorgente contenente il prodotto naturale in fase di prova) al contenitore di assunamento contenente il planariano.
  4. I periodi di assulazione per il ritiro dipenderanno dalla dinamica di stimolazione valutata per il prodotto naturale in fase di sperimentazione; 2-5 min si sono dimostrati sufficienti.
  5. Dopo il periodo di assufizione utilizzare un pennello ad acquerello per trasferire delicatamente il planariano al piatto Petri preparato da 5 cm contenente acqua di sorgente per risciacquare qualsiasi prodotto naturale dal contenitore di assuola. Assicurarsi che il planariano non sia danneggiato dal pennello.
  6. Trasferire immediatamente il planariario al centro del piatto Petri preparato da 10 cm contenente acqua di sorgente per l'esperimento di ritiro del pLmV. Assicurarsi che il planariano non sia danneggiato dal pennello.
  7. Avviare la fotocamera per registrare il movimento del planariano. Registra 10-11 min di video.
  8. Preparare il contenitore di assuzia, il contenitore di risciacquo e il piatto Petri da 10 cm per l'esperimento pLmV con soluzioni fresche per ogni planariano.
  9. Utilizzare pipette, piatti, contenitori e pennelli dedicati per ogni concentrazione sperimentale del prodotto naturale testato per evitare di esporre inavvertitamente i planari alla soluzione sbagliata durante la sperimentazione.
  10. Poiché i planari presentano comportamenti appresi, utilizzare ogni planaria (controllo o test) solo unavolta 26,27.

5. Analisi dei dati

  1. Preparare una tabella di raccolta dati per documentare il comportamento e la motilità dei planari come il numero di linee della griglia attraversate per ogni minuto durante l'esecuzione di pLmV. La tabella dovrebbe consentire di documentare anche il numero accumulato di righe al minuto attraversate dal planariano. Includere righe per le note e una tabella di definizioni per contarla l'osservazione dei comportamenti durante il periodo sperimentale, ad esempio "wander" e "stop" (vedi Discussione).
  2. Utilizzando il video, contare il numero di linee della griglia completa attraversate dal planariano al minuto per 10 min e registrare tale numero nella tabella dati. Il tipico comportamento planaria è costituito da velocità continua, movimento orizzontale diretto in avanti, con curve periodiche e senza fermate.
    1. Iniziare a tempo l'esperimento nel punto che il planariano si è spostato dal pennello utilizzato per trasferirlo al piatto Petri 10 cm. Registrare l'ora di inizio.
    2. Per determinare quando l'animale attraversa un quadrato della griglia completa, concentrarsi sulla testa e segnare una linea quando la testa attraversa completamente un quadrato.
    3. Per segnare una griglia completa quando il verme si muove intorno al bordo del piatto, visualizzare una distanza di 0,5 cm facendo riferimento alle linee che si estendono dai margini del piatto. Se il planariano attraversa l'angolo di una casella, fare riferimento alla seconda linea attraversata per segnare una linea della griglia. Ancora una volta, concentrarsi sulla testa per fare queste determinazioni.
    4. Interrompere il video dopo ogni minuto per registrare i dati.
    5. Quando si riavvia il video per contare il minuto successivo, se la testa del worm era tra le linee della griglia quando il video è stato interrotto, registrare la prima linea attraversata come una scatola completa.
    6. Segna il numero di linee della griglia attraversate per 10 min.
  3. Se l'animale smette di muoversi durante un test pLmV e non attraversa più le linee della griglia durante il tempo di registrazione di 10 minuti, documenta il comportamento del planaria nella tabella comportamentale (ad esempio, 'wander' o 'stop'). Gli animali che cessano la loro pista in avanti durante il test del pLmV dovrebbero invece essere presi in considerazione e i dati presentati come frequenza del numero totale di animali esposti a tale concentrazione di reagente. Comportamento coiling o convulso (noto come un comportamento C) impedendo qualsiasi movimento in avanti durante il periodo di assuvazione indica che la concentrazione del prodotto naturale non è appropriato per l'uso in un saggio pLmV perché il saggio pLmV è motilità-based. I comportamenti di tipo C possono essere analizzati utilizzando un diverso tipo di analisi (vedere Discussione).
  4. Se possibile, testare più concentrazioni sperimentali del prodotto naturale utilizzando almeno 9-12 vermi in giorni diversi e in diversi momenti della giornata se si determina l'effetto complessivo del reagente sulla fisiologia planaria. Tuttavia, se i ricercatori si sforzino di ridurre la variabilità indotta dal ritmo circadiano, gli esperimenti possono essere condotti con un'illuminazione costante in un'ora impostata del giorno utilizzando vermi che vengono colturati con cicli di luce/scuro a tempo e orari di alimentazione impostati. Disporre di almeno due sperimentatori coinvolti nel progetto per consentire la possibilità di avere un singolo record di dati, mentre il secondo individuo conta le linee della griglia "cieche" alle condizioni utilizzate per la raccolta dei dati. Avere diverse persone coinvolte nella raccolta dei dati, così come i calcoli statistici e l'analisi, riduce anche possibili pregiudizi.
  5. Calcolare i conteggi delle linee della griglia per ogni concentrazione naturale del prodotto ogni giorno in relazione ai conteggi di controllo per ogni minuto in modo che i dati di giorni, orari e sperimentatori diversi possano essere combinati. Questi dati possono essere analizzati in base alla media e quindi analizzati utilizzando i test T di Student. I valori P per ogni prova possono essere valutati al minuto rispetto al controllo e tra le concentrazioni di reagenti. Le valutazioni ANOVA che utilizzano set di dati derivati da diverse concentrazioni sperimentali forniscono un ulteriore metodo di analisi.

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Risultati

Il laboratorio istituito e la preparazione dello spazio di lavoro per l'esecuzione del test pLmV devono essere completati prima dell'inizio della sperimentazione. Ciò include la preparazione del contenitore di assunta, del contenitore di risciacquo se necessario (per gli esperimenti di ritiro), della piastra Petri sulla carta griglia laminata e della telecamera posizionata correttamente (Figura 1). Una volta che tutti i video sono presi, si consiglia di utilizzare un foglio dati comune per s...

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Discussione

Un semplice e accessibile analisi della motilità planaria è descritto per determinare gli effetti stimolanti e di ritiro dei prodotti naturali. Come modello comportamentale è necessario disporre di protocolli rigorosi per il movimento del punteggio e definizioni chiare di eventuali comportamenti per standardizzare le osservazioni tra diversi sperimentatori. Le idee presentate offrono una dimostrazione di come questo può essere raggiunto. Ogni laboratorio che utilizza questo protocollo deve adattare le informazioni presen...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori desiderano riconoscere l'ufficio di promozione istituzionale, e la Morrisville College Foundation per una sovvenzione di pubblicazione a sostegno di questo lavoro, così come il SUNY Morrisville Collegiate Science and Technology Entry Program (CSTEP) per la loro assistenza continua e il sostegno della ricerca universitaria a SUNY Morrisville. Desideriamo anche ringraziare Sophia Hutchens per i commenti utili sulla tecnica descritta.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Acqua in bottiglia - 1 gallone.Poland SpringN/A Acquadi sorgente per la coltura planaria e per preparare soluzioni
Planaria marrone (Dugesia tigrina)Carolina Biological Supply Company132954Planaria marrone vivente (altre specie sono accettabili)
Pennello piattoRoyal Crafter's Choice9159Pennelli piatti ad acquerello per la pulizia dei contenitori di coltura planaria
Piastra di Petri in vetro - 10 cmKimaxN/APiastre di Petri da 10 cm di diametro (vetro) per il test pLmV
Piastra di Petri in vetro - 5 cmKimaxN/A5 cm e piastre di Petri per il risciacquo delle planarie durante gli esperimenti di sospensione e per l'assuefazione agli stimolanti
Carta a grigliaQualsiasiN/Aa griglia standard da 0,5 cm per il test pLmV
iPEVO Visualizer (software)iPEVOhttps://www.ipevo.com/software/visualizerSoftware per la fotocamera per documenti per l'acquisizione e la registrazione di video
Set di oggetti in metallo con supporto di supporto e anello per stortaQualsiasiN/A Supportoad anello standard per laboratorio di chimica per sostenere la fotocamera di un telefono cellulare, se utilizzato
Uovo biologicoQualsiasiN/AUovo biologico o fegato di manzo per l'alimentazione delle planarone
Bottiglia in policarbonato con tappo a vite - 10 mLBeckmanN/AFiale di plastica per contenere volumi da 5 a 10 mL per l'assuefazione agli stimolanti
Contenitore rotondo per la conservazione - 10 cmZiplocN/AContenitori rotondi per la conservazione degli alimenti da 10 cm per circa 90 planarie o meno
Pennello rotondo ad acquaLOEW-CornellN/A Piccolipennelli rotondi per acquerello (numeri da 3 a 6) - morbida
Pipetta di trasferimentoQualsiasiN/APipette di trasferimento in plastica a foro largo (5 mL) per spostare le planarie
Fotocamera per documenti USBiPEVOCDVU-06IPDocument camera (o altra fotocamera o fotocamera del telefono cellulare)
Carta

Riferimenti

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