Saggio basato sul flusso per l'identificazione di modulatori dell'autofagia per l'osteoartrite

Sommario

Questo articolo descrive in dettaglio il monitoraggio del flusso di autofagia per identificare nuove molecole mediante screening di imaging basato su cellule.

Abstract

L'autofagia è un meccanismo centrale per regolare l'omeostasi. Le alterazioni dell'autofagia contribuiscono alle malattie legate all'invecchiamento. Metodi fenotipici per identificare i regolatori dell'autofagia potrebbero essere utilizzati per l'identificazione di nuove terapie. Questo articolo descrive un flusso di lavoro di screening di imaging basato su cellule sviluppato per monitorare il flusso autofagico utilizzando LC3 come reporter del flusso autofagico (mCherry-EGFP-LC3B) nei condrociti umani. L'acquisizione dei dati viene eseguita utilizzando un microscopio automatizzato High Content Imaging Screening System. È stato sviluppato e convalidato un protocollo di analisi automatizzata delle immagini basato su algoritmi per identificare le molecole che attivano il flusso autofagico. Vengono riportati i passaggi critici, le note esplicative e i miglioramenti rispetto agli attuali protocolli di monitoraggio dell'autofagia. Approcci di screening fenotipico fisiologicamente rilevanti per mirare ai segni distintivi dell'invecchiamento possono facilitare strategie di scoperta di farmaci più efficaci per le malattie muscoloscheletriche legate all'età.

Introduzione

Molte malattie croniche sono associate ai segni distintivi dell'invecchiamento, tra cui l'autofagia^{difettosa 1}. L'osteoartrite (OA) è la malattia articolare più diffusa e ha un impatto importante nel limitare le attività quotidiane nella popolazione anziana, ma non sono ancora disponibili né misure preventive né trattamenti modificanti la malattia².

L'invecchiamento articolare e l'OA sono associati a segni distintivi che definiscono la progressione della degenerazione della cartilagine, tra cui autofagia difettosa e senescenza ^3,4. Prendere di mira l'autofagia nei tessuti muscoloscheletrici può aiutare a trovare innovazioni terapeutiche per le malattie reumatologiche ^5,6. La modulazione farmacologica dell'autofagia è un meccanismo promettente e rilevante per l'intervento in modelli preclinici di malattia⁷. Nell'OA, l'attivazione dell'autofagia è stata utilizzata per prevenire la disfunzione articolare⁸. Metodi per monitorare l'autofagia basati su protocolli robusti e riproducibili che consentono l'analisi quantitativa possono essere utilizzati per identificare nuovi agenti e facilitare il targeting farmacologico dei segni distintivi dell'invecchiamento rilevanti per la malattia.

Il flusso di autofagia riflette l'attività di degradazione ed è una misura rilevante per identificare nuove molecole che attivano l'autofagia⁹. Questo studio descrive un metodo sviluppato per determinare il flusso autofagico misurando l'attività di degradazione autofagica utilizzando una linea cellulare reporter autofagica nei condrociti umani (TC28a2). L'espressione transitoria di mCherry-EGFP-LC3- consente il monitoraggio simultaneo degli eventi di formazione e degradazione degli autolisosomi, quantificando le differenze nella sensibilità al pH tra i segnali GFP e mCherry LC3 nei lisosomi delle cellule vive¹⁰.

L'adattamento di questo metodo riportato con citometria a flusso a un sistema di monitoraggio dell'imaging di espressione stabile nei condrociti vivi può consentire l'identificazione di molecole che attivano il flusso autofagico nel contesto della biologia della cartilagine.

Protocollo

1. Generazione di linee cellulari reporter per l'autofagia di condrociti umani immortalizzati

NOTA: La generazione di una linea cellulare reporter di autofagia mediante trasfezione stabile di pBABE-mCherry-GFP-LC3 stabilendo una lettura quantitativa della citometria a flusso è stata descritta in precedenza¹¹. Nella trasfezione retrovirale sono state utilizzate due linee cellulari: HEK 293-T17 durante il processo di cotrasfezione e T/C28a2 nella fase di infezione.

1. Processo di cotrasfezione
   1. Preparare il terreno di crescita per le cellule HEK 293-T17: 500 ml di terreno essenziale minimo di Eagle (EMEM), 10% di siero fetale bovino (FBS) e 1% di penicillina-streptomicina (P/S). Conservare il terreno di coltura a 4 °C e riscaldarlo a 37 °C prima di ogni utilizzo.
   2. Seminare 1 x 10⁶ cellule HEK 293-T17 per pozzetto in piastre di coltura cellulare da 100 mm, incubare a 37 °C e 5% di CO₂ e assicurarsi che siano a ~75% di confluenza prima di iniziare il processo di cotrasfezione.
   3. Rimuovere il terreno di coltura, sciacquare con la soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) e aggiungere 8 ml di EMEM con il 2% di FBS e l'1% di P/S.
   4. In una provetta conica, aggiungere 10 μg, 3 μg e 7 μg di pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3B, VSV. G e pCL-Eco, rispettivamente. Quindi aggiungere 200 μl di terreno sierico ridotto 1x (Tabella dei materiali). Aggiungere il reagente di trasfezione (Tabella dei materiali) come miscela non liposomiale di lipidi per avere un rapporto 1:3 (1 μg di DNA: 3 μg di reagente di trasfezione; volume finale = 60 μL).
      NOTA: Per ogni piastra cellulare da trasfettare da trasfettare viene preparato un totale di 20 μg di miscela.
   5. Incubare la miscela per 20 minuti a temperatura ambiente. Trasferire con cautela la miscela di trasfezione goccia a goccia nelle celle di confezionamento HEK 293-T17. Incubare le cellule a 37 °C e al 5% di CO₂ per almeno 48 ore prima di verificare l'espressione delle proteine verdi e rosse mediante microscopia a fluorescenza.
      NOTA: In queste condizioni, più del 75% delle cellule dovrebbe essere positivo alla fluorescenza. Assicurarsi che l'efficienza di trasfezione sia elevata (ad esempio, più del 75% delle celle è positivo). Utilizzare DNA plasmidico di alta qualità (ad esempio, prevalentemente superavvolto e privo di DNA, RNA e proteine genomiche, altamente concentrato, privo di endotossine e sali) e colture cellulari di alta qualità (ad esempio, omogenee, a basso passaggio, monostrato, trasfettate nella fase di crescita esponenziale, prive di micoplasma).
2. Lo stesso giorno della cotrasfezione, preparare i condrociti T/C28a2.
   1. Preparare il terreno di crescita cellulare T/C28a2: 500 ml di terreno Eagle modificato di Dulbecco (DMEM), 10% di siero fetale di vitello (FCS) e 1% di P/S. Conservare il terreno di crescita a 4 °C e riscaldare a 37 °C prima di ogni utilizzo.
   2. Seminare 2 condrociti x 10⁵ T/C28a2 in due piastre multiple a 6 pozzetti e incubare per 48 ore a 37 °C e 5% CO₂.
3. Processo di infezione retrovirale
   1. Terreno di coltura aspirato da cellule di imballaggio retrovirale HEK 293-T17 ottenute dalla fase 1.1.5. Sciacquare 1 volta con 4 ml di HBSS e aspirare HBSS.
   2. Aggiungere 2 mL di tripsina e attendere 2 minuti a 37 °C. Neutralizzare la tripsina aggiungendo 6 mL di terreno di coltura HEK 293-T17 e trasferire le cellule e il terreno in provette coniche da 15 mL.
   3. Centrifugare le celle a 400 x g per 5 min. Trasferire il surnatante in un filtro sterile attraverso una membrana da 0,45 μm.
   4. Aspirare il terreno di coltura dei condrociti T/C28a2 dalle piastre multiple a 6 pozzetti. Infettare le cellule T/C28a2 aggiungendo 2 mL di sospensione virale (passaggio 1.3.3) per pozzetto in piastre multiple a 6 pozzetti. Utilizzare un pozzetto per il controllo (cioè cellule non trasfettate), aggiungendo 2 ml di terreno di crescita cellulare T/C28a2 invece della sospensione virale.
   5. Incubare per 48 ore a 37 °C e 5% di CO₂.
4. Per eseguire il processo di selezione, utilizzare una selezione antibiotica su cellule trasfettate per eliminare le cellule non trasfettate e ottenere una popolazione cellulare omogenea.
   NOTA: Il vettore retrovirale pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3B fornisce resistenza agli antibiotici nei mammiferi alla puromicina, che consente la selezione di una coltura cellulare stabile dopo la trasfezione virale. Le curve di uccisione per la concentrazione ottimale di puromicina dei condrociti T/C28a2 devono essere impostate in anticipo per stabilire le condizioni appropriate per selezionare i cloni cellulari portatori del transgene con alti livelli di espressione.
   1. Preparare il terreno di crescita stabile della linea cellulare T/C28a2-pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3B: 500 mL di DMEM, 10% di FCS, 1% P/S e 2,5 μL/mL di puromicina. Conservare a 4 °C e scaldare a 37 °C prima di ogni utilizzo.
   2. Cambia il mezzo. Per ogni 6 pozzetti multiplati, aspirare il terreno di coltura, sciacquare 1 volta con 2 mL di HBSS e aspirarlo. Aggiungere 2 mL di terreno e incubare a 37 °C e 5% di CO₂. Questo è l'inizio del processo di selezione.
   3. Sostituire il terreno ogni 2 giorni e osservare le cellule morte e le popolazioni cellulari resistenti alla puromicina. Confronta i risultati con le cellule di controllo non trasfettate, che non sono resistenti alla puromicina e muoiono.
5. Per avviare la selezione clonale, assicurarsi che le popolazioni monoclonali siano cresciute. Per ogni 6 pozzetti multiplato:
   1. Aggiungere 200 μl di terreno per pozzetto in un multistrato a 96 pozzetti.
      NOTA: Ogni singola cella selezionata dalla multipiastra a 6 pozzetti sarà placcata in pozzetti individuali del multistrato a 96 pozzetti.
   2. Utilizzare un microscopio per identificare ogni popolazione monoclonale nelle piastre multiple a 6 pozzetti. Si possono osservare colonie formate da singole cellule.
   3. Aspirare il terreno di coltura da 6 piastre multipozzetto, sciacquare 1 volta con 2 mL di HBSS e aspirare HBSS.
   4. Aggiungere 10 μL di tripsina a ciascuna popolazione monoclonale per trasferire singole cellule in ciascun pozzetto delle piastre multiple a 96 pozzetti. Incubare per 48 ore a 37 °C e 5% di CO₂.
6. Dopo 48 ore, sostituire il terreno con 100 μL di terreno fresco per pozzetto. Ripetere questa procedura fino a quando non si formano colonie a causa dell'espansione di singole cellule.
7. Una volta che una singola cellula si è espansa bene, piastrellate ogni popolazione monoclonale in pozzetti individuali di piastre di coltura cellulare da 24 pozzetti, 6 pozzetti e 100 mm.
8. Generare una linea cellulare monoclonale stabile utilizzando un metodo di selezione di singole cellule.
   1. Aspirare il terreno di coltura da piastre di coltura cellulare da 100 mm. Risciacquare 1 volta con 8 ml di HBSS e aspirare.
   2. Aggiungere 2 mL di tripsina su ciascuna piastra e incubare per 2 minuti a 37 °C. Neutralizzare la tripsina aggiungendo 8 mL di terreno di coltura.
   3. Centrifugare le celle a 252 x g per 5 minuti e scartare il surnatante. Aggiungere 4 mL di HBSS a ciascun pellet cellulare, risospenderlo con cura e trasferirlo in provette per citometria.
   4. Iniettare ogni campione di cellule in un citometro a flusso (Tabella dei materiali) con tecnologia di selezione cellulare e separare le cellule con un'elevata fluorescenza verde e rossa.
   5. Trasferire le cellule selezionate in provette coniche da 15 mL e centrifugare le celle a 252 x g per 5 minuti. Aggiungere il pellet cellulare a un pallone T-25 con 9 mL di terreno di crescita stabile della linea cellulare. Incubare a 37 °C e 5% CO₂.
      NOTA: Dopo la selezione cellulare, si dovrebbero ottenere tre popolazioni monoclonali (Tabella 1).
9. Dopo 24 ore, rimuovere il terreno e aggiungere 8 ml di terreno fresco. Ripetere questa procedura ogni 2 giorni fino a quando le cellule non raggiungono la confluenza.
   NOTA: Per studiare il flusso autofagico, è possibile utilizzare due controlli: la rapamicina come riferimento del segnale ad alto flusso autofagico e la clorochina come riferimento del segnale a basso flusso autofagico. Preparare una soluzione madre di rapamicina 10 mM in dimetilsolfossido (DMSO) e una soluzione madre di clorochina 30 mM in H₂O e conservare a -20 °C. Per selezionare la migliore popolazione monoclonale testando l'espressione mCherry e GFP, si possono utilizzare due metodi: la citometria a flusso (passaggio 1.10) o l'analisi di immagini fluorescenti ad alto contenuto (passaggio 1.11).
10. Citometria a flusso
    1. Seminare 2,5 x 10⁵ cellule per pozzetto di ciascuna popolazione monoclonale in piastre a 12 pozzetti almeno 24 ore prima del trattamento in 1 mL di terreno di crescita stabile della linea cellulare e incubare a 37 °C e 5% di CO₂.
    2. Il giorno del trattamento, rimuovere il terreno, aggiungere 1 mL di terreno di crescita stabile della linea cellulare integrato con il 2% di FCS per pozzetto. Aggiungere 10 μM di rapamicina e 30 μM di clorochina al terreno di crescita stabile della linea cellulare con il 2% di FCS e incubare per 16 ore a 37 °C e 5% di CO₂.
    3. Rimuovere il terreno, sciacquare con 1 ml di HBSS per pozzetto e aspirarlo.
    4. Aggiungere 500 μL di tripsina in ogni pozzetto, incubare per 1 minuto a 37 °C e neutralizzare la reazione aggiungendo 500 μL di terreno di coltura. Raschiare le cellule e trasferirle in tubi conici.
    5. Centrifugare le cellule a 252 x g per 5 minuti e aspirare il surnatante. Sciacquare i pellet cellulari con 500 μl di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Centrifugare a 252 x g per 5 minuti ed eliminare il surnatante.
    6. Aggiungere 500 μl di PBS, trasferire le cellule alle provette per citometria e iniettare ogni campione nell'apparecchiatura per citometria. Per ogni condizione, raccogli 10.000 eventi.
    7. Per selezionare la popolazione monoclonale mediante citometria a flusso, utilizzare un laser a 488 nm per eccitare l'EGFP e un laser a 633 nm per mCherry. Quindi, stabilire un rapporto tra la fluorescenza di mCherry e EGFP per selezionare la popolazione cellulare con flusso autofagico alto e basso.
11. Analisi di immagini fluorescenti ad alto contenuto
    1. Seminare 4 x 10³ cellule di ciascuna popolazione monoclonale per pozzetto in piastre da 384 pozzetti (parete nera/fondo trasparente) in terreno di crescita integrato con il 10% di FCS, l'1% di P/S e 2,5 μL/mL di puromicina. Incubare a 37 °C e 5% di CO₂ per 24 ore prima del trattamento.
    2. Rimuovere il terreno e aggiungere 10 μM di rapamicina e 30 μM di clorochina in 50 μL di terreno di crescita stabile della linea cellulare integrato con il 2% di FCS per pozzetto. Incubare per 16 ore a 37 °C e 5% CO₂.
    3. Rimuovere il terreno, sciacquare con 50 μL di HBSS per pozzetto e aspirarlo. Fissare le cellule con paraformaldeide (PFA) al 4% per 10 minuti a 37 °C. Rimuovere il PFA e risciacquare con 50 μl di HBSS per pozzetto.
    4. Per identificare i nuclei cellulari, colorare con Hoechst 33342 (2,5 μg/mL) per 10 minuti a 37 °C. Aspirare il colorante Hoechst 33342, risciacquare con 50 μl di HBSS per pozzetto e aggiungere 50 μl di PBS per pozzetto.
    5. Eseguire l'acquisizione e l'analisi dei dati del flusso autofagico ottenuto dalla piattaforma HTS come descritto nella sezione 3.
       NOTA: I criteri per selezionare la popolazione monoclonale si basano sull'aumento o la diminuzione del flusso autofagico rispettivamente con rapamicina o clorochina (Tabella 1). I cloni con alti livelli di espressione di mCherry e GFP sono più adatti per l'analisi accurata di immagini fluorescenti ad alto contenuto per la quantificazione del flusso di autofagia.

2. Saggio del flusso autofagico basato su immagini in condrociti vivi

NOTA: Dopo aver selezionato un clone, avviare il test per quantificare il flusso autofagico.

1. Utilizzando una pipetta elettronica portatile a 384 canali, seminare 4 x 10³ cellule del clone selezionato (fase 1.11) per pozzetto in piastre da 384 pozzetti (parete nera/fondo trasparente) in 50 μL di terreno di crescita stabile per linee cellulari integrato con il 10% di FCS, l'1% di P/S e 2,5 μL/mL di puromicina per pozzetto. Incubare a 37 °C e 5% di CO₂ per 24 ore prima del trattamento.
2. Il giorno dell'esperimento, preparare una piastra di intervallo per l'aggiunta del composto.
   1. Aggiungere un volume di ciascun composto/controllo e un terreno di crescita stabile della linea cellulare alla piastra dell'intervallo utilizzando la tecnologia di manipolazione acustica dei liquidi e una pipetta elettronica a 384 canali, rispettivamente, per ottenere una concentrazione dell'intervallo.
      NOTA: I controlli in questo test includevano un terreno di crescita stabile della linea cellulare integrato con FCS al 2%, clorochina 30 μM e rapamicina 10 μM. Le concentrazioni intervallate dipenderanno dalla concentrazione finale desiderata. Ad esempio, in questo saggio, la clorochina e la rapamicina sono state aggiunte in 50 μL di terreno di crescita stabile della linea cellulare per pozzetto per ottenere una concentrazione di intervallo rispettivamente di 300 μM e 100 μM.
   2. Utilizzando un robot lavamicropiastre, aspirare il terreno dalla piastra cellulare in modo automatizzato e aggiungere 45 μl di terreno di crescita stabile su linee cellulari integrato con il 2% di FCS per pozzetto.
   3. Quindi trasferire 5 μl per pozzetto dalla piastra di intervallo alla piastra di analisi per ottenere una concentrazione finale utilizzando un'altra stazione di lavoro automatizzata per la movimentazione dei liquidi.
3. Incubare a 37 °C e 5% CO₂ per 16 ore. Utilizzando un robot lavamicropiastre, aspirare il fluido.
4. Fissare le celle con 50 μl di PFA al 4% per pozzetto per 10 minuti a 37 °C. Lavare con 50 μl di HBSS per pozzetto.
5. Colorare i nuclei con Hoechst 33342 (2,5 μg/mL) per 10 minuti a 37 °C. Aspirare Hoechst 33342 e risciacquare con 50 μL di HBSS per pozzetto.
6. Aggiungere 50 μl di PBS per pozzetto. La lastra è ora pronta per la lettura, la raccolta dei dati e la successiva analisi.
   NOTA: Questo protocollo è descritto per lo screening ad alto rendimento (HTS). Tuttavia, se si utilizzano pochi composti, questi possono essere aggiunti manualmente, senza strumenti automatici. La manipolazione minima delle cellule e del surnatante mediante strumenti calibrati per la manipolazione dei liquidi e/o pipette elettroniche facilita la preparazione di successo dei monostrati di colture cellulari per la quantificazione del flusso di autofagia mediante analisi di immagini fluorescenti ad alto contenuto.

3. Acquisizione dati e analisi del flusso autofagico

1. Per l'acquisizione dei dati, utilizzare un sistema di screening ad alto contenuto (HCS) e un microscopio automatizzato, che consente l'acquisizione e l'analisi automatizzate delle immagini mediante l'algoritmo di elaborazione delle immagini.
2. Per sviluppare un protocollo di acquisizione, selezionare diversi canali e tempi di esposizione (Tabella 2) per identificare i nuclei e la formazione di autofagosomi e autolisosomi durante eventi di flusso autofagico.
3. Per ogni pozzetto, raccogli immagini da quattro campi che coprono la superficie del pozzo e in quattro pile a partire da 8 μm separate da una distanza di lavoro di 0,2 μm. Acquisisci le immagini utilizzando un obiettivo 60x per un imaging cellulare dettagliato.
4. Analizza i dati utilizzando il software di analisi delle immagini fornito dal microscopio HCS. Per sviluppare un robusto algoritmo di protocollo di analisi per il monitoraggio del flusso di autofagia, selezionare il metodo più appropriato per la segmentazione automatizzata dell'immagine cellulare e per rilevare in modo specifico le macchie corrispondenti all'attivazione di LC3. Eseguire la sequenza di analisi finale aggiungendo metodi, passaggi di segmentazione cellulare e istruzioni di quantificazione come descritto di seguito:
   1. Fare clic sul blocco di costruzione Trova nuclei e scegliere il canale di colorante nucleare Hoechst 33342. Selezionare Metodo e scegliere i nuclei della popolazione in uscita.
   2. Fare clic sul blocco di costruzione Trova citoplasma e scegliere il canale del colorante citoplasmatico Fluoresceina. Seleziona il metodo | Soglia individuale.
   3. Fare clic sul blocco predefinito Trova citoplasma (2) e scegliere la RFP del canale del colorante citoplasmatico. Seleziona il metodo | Soglia individuale.
   4. Fare clic sul blocco Popolazione e selezionare i nuclei della popolazione in studio. Seleziona il metodo Filtri comuni (Rimuovi oggetti bordo) e scegli la popolazione di output Nuclei Inside Borders.
   5. Fare clic sul blocco di costruzione Trova macchie e scegliere il canale del marcatore specifico Fluoresceina. Seleziona la popolazione in studio Nuclei all'interno dei bordi e seleziona la regione di studio Citoplasma. Seleziona Metodo e scegli la popolazione di output Macchie all'interno dei bordi.
   6. Fare clic sul blocco di costruzione Trova punti (2) e scegliere la RFP specifica per il canale del marcatore. Selezionare la popolazione in studio Nuclei all'interno dei bordi e selezionare la regione di studio Citoplasma (2). Seleziona Metodo e scegli la popolazione di output Macchie (2) all'interno dei bordi.
   7. Fare clic sul blocco di costruzione Calcola proprietà di intensità e scegliere il canale di marcatura specifico Fluoresceina. Seleziona la popolazione di studio Nuclei Inside Borders e seleziona la regione di studio Spot. Seleziona Metodo e scegli le proprietà di output : Intensità, Spot, Fluoresceina all'interno dei bordi.
   8. Fare clic sul blocco predefinito Calcola proprietà intensità e scegliere la RFP specifica del canale marker. Seleziona la popolazione di studio Nuclei Inside Borders e seleziona la regione di studio Spot (2). Selezionare Metodo e scegliere le proprietà di output Intensità Spot (2) RFP Bordi interni.
   9. Fare clic sul blocco predefinito Definisci risultati , selezionare Nuclei della popolazione all'interno dei bordi, selezionare Numero di oggetti di nuclei (media), selezionare Spot di intensità relativa Fluoresceina - media per pozzetto e selezionare Spot di intensità relativa (2) - RFP - media per pozzetto.
5. Per quantificare il flusso autofagico, utilizzare lo stesso metodo descritto in precedenza per l'analisi della citometria a flusso¹¹. Stabilire il rapporto mCherry/EGFP degli spot di intensità relativa.
   NOTA: Le celle con flusso più elevato sono meno verdi, il che aumenta il rapporto mCherry/EGFP nella cellula. Identificare e quantificare con precisione un numero significativo di segnali rilevanti provenienti dagli eventi di flusso autofagico nelle cellule è molto importante per stabilire differenze statisticamente significative.

Risultati

Il flusso autofagico può essere monitorato nelle cellule mediante modulazione farmacologica o risposta cellulare allo stress. I condrociti umani non mortalizzati (T/C28a2) sono stati impiegati per sviluppare una linea cellulare reporter per l'autofagia utilizzando LC3 come reporter fluorescente (mCherry-EGFP-LC3B) per l'autofagia. La Figura 1 mostra il flusso di lavoro schematico del test di screening a partire dallo sviluppo della linea cellulare reporter dell'autofagia nei condrociti umani...

Discussione

L'autofagia difettosa è un importante segno distintivo della degenerazione articolare correlata all'invecchiamento, ma non sono ancora disponibili trattamenti preventivi o modificanti la malattia mirati all'autofagia per la degenerazione della cartilagine². Data la sua rilevanza e le sue implicazioni cliniche, l'autofagia è diventata un obiettivo di interesse per la scoperta e lo sviluppo di farmaci, sebbene i metodi per monitorare direttamente i cambiamenti in qu...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastra per colture cellulari da 100 mm	Corning	430167	Piastra per colture cellulari
Multipiastra a 12 pozzetti	Corning	353043	Piastra per colture cellulari
Tubo conico per centrifuga da 15 mL	Falcon-Corning	352095	Tubo conico per centrifuga
Multipiastra a 24 pozzetti	Corning	351147	Piastra per colture cellulari
Pallone	da 25 cm2Falcon-Corning	353014	Pallone per colture cellulari
Multipiastra a 384 pozzetti	Perkin Elmer	6007550	Piastra per colture cellulari
Multipiastra	351146	Piastra per colture cellulari	Multipiastra Corning
96 pozzetti		353077	Piastra per colture cellulari
Tecnologia di manipolazione acustica	dei liquidi Labcyte	−	https://www.labcyte.com
Clorochina	Sigma-Aldrich	C6628	inibitore del flusso autofagico
Dimetilsolfossido (DMSO)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	D2650	Disolvente
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Lonza, Basel, Switzerland	BE-604F	T/C28a2 terreno
di crescita Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)	ATCC	30– 2003	HEK 293-T17 mezzo di crescita
FACScalibur citometro	Becton Dickinson, CA&	minus;	https://www.bdbiosciences.com/en-eu
Siero fetale bovino (FBS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	F9665	HEK 293-T17 siero
fetale di vitello (FCS)	Gibco di Life Technologies, CA	26010... 074	Serum
FuGene	Promega	E2691	Una miscela non liposomiale di lipidi come metodo di somministrazione di plasmidi per creare una linea cellulare riportata dall'autofagia
Pipetta elettronica portatile a 384 canali	Integra	−	https://www.integra-biosciences.com/united-states/en/electronic-pipettes/viaflo-96384#downloads
Soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS)	Sigma-Aldrich	H6648	Buffer
HEK 293-T17	ATCC	CRL-11268	Linea cellulare renale. Le cellule sono state utilizzate per facilitare l'imballaggio retrovirale
Sistema di screening ad alto contenuto	Perkin Elmer	−	https://www.perkinelmer.com/es/product/operetta-cls-system-hh16000000
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	62249	per l'analisi delle immagini per la colorazione del DNA
	Perkin Elmer	−	https://www.perkinelmer.com/es/product/harmony-4-9-office-license-hh17000010
Stazione di lavoro per la movimentazione di liquidi	Perkin Elmer	−	https://www.perkinelmer.com/es/category/janus-liquid-handler-workstations
Robot lavamicropiastre	Biotek	−	https://go.biotek.com/405tradein
Opti-MEM® (1x)	Thermo Fisher Scientific	11058	Mezzo di trasfezione
Paraformaldeide (PFA)	Sigma-Aldrich	158127	Fixer
pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3B	Addgene, Cambridge, MA	22418	Plasmide
pCL-Eco	Addgene, Cambridge, MA	12371	Plasmide
Penicillina-Streptomicina (P/S)	Sigma-Aldrich	P0781	Antibiotico
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	MP Biomedicals	2810305	tampone
Puromicina	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	P8833	Antibiotico
rapamicina	Calbiochem, Germania	5053210	attivatore del flusso autofagico
Software CellQuestPro	Becton Dickinson	−	https://www.bdbiosciences.com/en-eu
Filtri per siringhe 0,45 μ m	Corning	CLS431220	Filtro sterile
T/C28a2	−	&meno;	linea cellulare di condrociti umani
Tripsina	Gibco di Life Technologies, CA	15400054	Tripsina utilizzata con le cellule T/C28a2
Tripsina	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	SM-2002-C	Tripsina utilizzata con le cellule HEK 293-T17
VSV. G	Addgene, Cambridge, MA	14888	Plasmide