Il declino proteostatico è un segno distintivo dell'invecchiamento, facilitando l'insorgenza di malattie neurodegenerative. Delineiamo un protocollo per misurare in modo quantificabile la proteostasi in due diversi tessuti di Caenorhabditis elegans attraverso l'espressione eterologa di ripetizioni di poliglutamina fuse a un reporter fluorescente. Questo modello consente una rapida analisi genetica in vivo della proteostasi.
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Articolo metodologico
Quantificazione del declino proteostatico tessuto-specifico nella Caenorhabditis elegans
In questo articolo
Sommario
Abstract
La capacità di mantenere il corretto funzionamento e il ripiegamento del proteoma (omeostasi proteica) diminuisce durante il normale invecchiamento, facilitando l'insorgenza di un numero crescente di malattie associate all'età. Ad esempio, le proteine con espansioni di poliglutamina sono inclini all'aggregazione, come esemplificato con la proteina huntingtina e l'insorgenza concomitante della malattia di Huntington. Il deterioramento associato all'età del proteoma è stato ampiamente studiato attraverso l'uso di Caenorhabditis elegans transgenici che esprimono ripetizioni polyQ fuse a una proteina fluorescente gialla (YFP). Questo modello animale transgenico polyQ::YFP facilita la quantificazione diretta del declino del proteoma associato all'età attraverso l'imaging della progressiva formazione di focolai fluorescenti (cioè aggregati proteici) e la successiva insorgenza di difetti di locomozione che si sviluppano a seguito del collasso del proteoma. Inoltre, l'espressione del transgene polyQ::YFP può essere guidata da promotori tessuto-specifici, consentendo la valutazione della proteostasi tra i tessuti nel contesto di un organismo multicellulare intatto. Questo modello è altamente suscettibile di analisi genetica, fornendo così un approccio per quantificare l'invecchiamento che è complementare ai saggi della durata della vita. Descriviamo come misurare con precisione la formazione di focolai polyQ::YFP all'interno dei neuroni o del muscolo della parete corporea durante l'invecchiamento e la successiva insorgenza di difetti comportamentali. Successivamente, evidenziamo come questi approcci possono essere adattati per una maggiore produttività e potenziali applicazioni future utilizzando altre strategie emergenti per l'analisi genetica di C. elegans.
Introduzione
L'omeostasi proteica (proteostasi) è definita come la capacità cellulare di mantenere il corretto funzionamento e il ripiegamento del proteoma. La sfida intrinseca alla proteostasi è garantire che tutte le proteine siano correttamente ripiegate e mantenute in una conformazione nativa, che è ulteriormente amplificata dalla varia natura delle dimensioni delle proteine, dalla composizione degli amminoacidi, dalla conformazione strutturale, dalla stabilità, dal turnover, dall'espressione, dalla compartimentazione subcellulare e dalle modifiche1. La proteostasi viene mantenuta attraverso l'azione coordinata di una grande rete proteostatica, costitui....
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Protocollo
1. Preparazione dei reagenti
- Selezionare i geni di interesse da inattivare tramite RNAi basato sull'alimentazione. Acquisto di azioni di HT115 E. coli contenenti il clone RNAi di interesse20. In alternativa, subclone il cDNA del gene di interesse nel sito multicloning del plasmide L4440.
NOTA: Per prevenire la degradazione del dsRNA all'interno dei batteri, utilizzare il ceppo HT115. Questo è un ceppo di E. coli carente di RNasi III con attività della polimerasi T7 inducibile da IPTG. Per gli studi di proteostasi che non utilizzano RNAi basato sull'alimentazione, è possibile utilizzare HT115 o OP50 E. coli
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Risultati
In C. elegans,il modello di ripetizione della poliglutamina è stato determinante per l'identificazione dei geni che regolano la rete proteostatica. Ad esempio, abbiamo precedentemente dimostrato che l'omeodominio che interagisce con la proteina chinasi (hpk-1), un cofattore trascrizionale, influenza la proteostasi durante l'invecchiamento regolando l'espressione di autofagia e chaperoni molecolari31. Abbiamo scoperto che la perdita di hpk-1,sia per silenziamento RNAi che.......
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Discussione
L'invecchiamento è caratterizzato da un graduale declino della proteostasi. La proteostasi è mantenuta da un sistema complesso, la rete proteostatica, per il controllo coordinato, dinamico e sensibile allo stress del ripiegamento, della degradazione e della traduzione delle proteine. Il motivo per cui la proteostasi fallisce nel corso dell'invecchiamento è poco compreso, ma un epigenoma in decomposizione, una diminuzione dell'inducibilità delle risposte allo stress e la perdita di crosstalk compensatorio coincidono tutti.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare i membri passati e presenti del laboratorio Samuelson per la loro assistenza nel perfezionamento di questo metodo e / o discussione che ha aiutato lo sviluppo di questo manoscritto. La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata supportata dal National Institute on Aging del National Institutes of Health con i numeri di premio RF1AG062593 e R21AG064519. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali del National Institutes of Health. I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell'analisi dei dati, nella decisione di pubblicare....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Piastre di coltura a 24 pozzetti | Greiner Bio-One | #662102 | |
| 2 mL Piastre a 96 pozzetti | Greiner Bio-One | #780286 | |
| 600 µ L Piastre a 96 pozzetti | Greiner Bio-One | #786261 | |
| Replicatore di piastre a 96 pin | Nunc | 250520 | |
| Guarnizione per piastre permeabile all'aria | VWR | 60941-086 | |
| agar batteriologico | Affymetrix/USB | 10906 | |
| bacto-peptone | VWR | 90000-368 | |
| Libreria di cloni RNAi di C. elegans nei batteri HT115- Ahringer | Fonte: Bioscience | C. elegans, Collezione RNAi (Ahringer) | Vedi anche Kamath et. al, Nature 2003. |
| Libreria di cloni RNAi di C. elegans nei batteri HT115- Vidal | Source Bioscience C | . elegans ORF-RNAi Resource (Vidal) | Vedi anche Rual et. al, Genome Research 2004. Questa libreria è disponibile anche da Dharmacon. |
| FuDR (5-Fluoro-2'-deossiuridina) | Alfa Aesar | L16497 | |
| Vetrini coprimicroscopio | in vetro VWR | 48404-455 | |
| Vetrini per microscopio | in vetro VWR | 160004-422 | |
| IPTG (isopropil beta-D-1-tigalattopiranoside) | Gold Bio | 12481C100 | |
| Piastra rettangolare a pozzetto singolo non trattata, 128x86mm | Thermo-Fisher | ||
| Sodium Azide, CAS #26628-22-8 | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Zeiss Axio Imager M2m microscopio con software AxioVision v4.8.2.0 | Zeiss | sconosciuto | |
| Zeiss StemiSV11 M2 Bio Quad microscopio | Zeiss | sconosciuto |
Riferimenti
- Wolff, S., Weissman, J. S., Dillin, A. Differential scales of protein quality control. Cell. 157 (1), 52-64 (2014).
- Labbadia, J., Morimoto, R. I. The biology of proteostasis in aging and disease. Annual Review of Biochemistry. 84, 435-464 (2015).
- Powers, E. T., Morimoto, R. ....
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Ristampe e permessi
