Articolo metodologico

Monitoraggio della sopravvivenza del virus influenzale al di fuori dell'ospite utilizzando l'analisi cellulare in tempo reale

DOI:

10.3791/61133

⸱

20 febbraio 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Infection Biology, London School of Hygiene and Tropical Medicine, 2Institut Pasteur, Unité Environnement et Risques Infectieux, Cellule d'Intervention Biologique d'Urgence (CIBU), 3Cellule Pasteur, Université de Paris

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui è riportato un protocollo per la quantificazione di particelle virali infettive utilizzando il monitoraggio in tempo reale dell'impedenza elettrica delle cellule infette. Un'applicazione pratica di questo metodo è presentata quantificando il decadimento del virus dell'influenza A in diversi parametri fisico-chimici che imitano le condizioni ambientali.

Abstract

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I metodi per la quantificazione delle particelle virali rappresentano un aspetto critico di molti studi di virologia. Sebbene esistano diverse tecniche affidabili, richiedono molto tempo o non sono in grado di rilevare piccole variazioni. Qui viene presentato un protocollo per la quantificazione precisa del titolo virale analizzando le variazioni di impedenza elettrica delle cellule infette in tempo reale. L'impedenza cellulare viene misurata attraverso biosensori a microelettrodi d'oro situati sotto le cellule in micropiastre, in cui la grandezza dipende dal numero di cellule, nonché dalle loro dimensioni e forma. Questo protocollo consente l'analisi in tempo reale della proliferazione cellulare, della vitalità, della morfologia e della migrazione con maggiore sensibilità. Viene inoltre fornito un esempio di applicazione pratica quantificando il decadimento del virus dell'influenza A (IAV) sottoposto a vari parametri fisico-chimici che influenzano l'infettività virale nel tempo (cioè temperatura, salinità e pH). Per tali applicazioni, il protocollo riduce il carico di lavoro necessario, generando al contempo dati di quantificazione precisi delle particelle virali infettive. Permette il confronto delle pendenze di inattivazione tra diversi IAV, che riflette la loro capacità di persistere in un determinato ambiente. Questo protocollo è facile da eseguire, è altamente riproducibile e può essere applicato a qualsiasi virus che produce effetti citopatici in coltura cellulare.

Introduzione

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La trasmissione di un virus si basa sulla combinazione di diversi fattori. Per un virus secreto nell'ambiente, la sua trasmissione dipende anche dalla capacità di persistere in condizioni al di fuori dell'ospite. Studiare l'inattivazione virale in generale è, quindi, un passo cruciale per aiutare le autorità sanitarie nazionali e i responsabili politici ad attuare misure di controllo e biosicurezza.

La conoscenza della persistenza del virus in ambienti naturali e di laboratorio è aumentata considerevolmente nell'ultimo decennio. Nel caso dei virus dell'influenza A (IAV), le loro vie di trasmissione sottopongono le particelle virali a una vasta gamma di condizioni ambientali. In particolare, possono essere trasmessi attraverso 1) vie fecali-orali attraverso l'acqua (cioè virus aviari), o 2) contatto diretto o indiretto da fomiti contaminati, nonché aerosol e goccioline respiratorie (cioè virus di pollame e mammiferi)1. In ogni caso, gli IAV sono sottoposti a vari parametri fisico-chimici (pH, salinità, temperatura e umidità), che influenzano più o meno rapidamente la loro infettività2,3,4,5,6,7,8,9. È di grande importanza, soprattutto per quanto riguarda i virus zoonotici e pandemici, valutare il potenziale dei fattori ambientali di influenzare le dinamiche virali e i rischi di esposizione e trasmissione tra specie.

Finora, le tecniche di virologia tradizionali (ad esempio, la determinazione del titolo virale attraverso saggi di placca o la stima della dose infettiva della coltura tissutale al 50%) sono state utilizzate per valutare l'infettività IAV nel tempo; ma queste tecniche richiedono molto tempo e richiedono molte forniture10,11,12. Misurare l'impedenza delle cellule infette nel tempo con microelettrodi serve come strumento utile per monitorare la sopravvivenza dello IAV in diverse condizioni ambientali, così come l'inattivazione virale in generale. Questo metodo fornisce dati oggettivi e in tempo reale che sostituiscono l'osservazione umana soggettiva degli effetti citopatici. Può essere utilizzato per determinare la titolazione del virus, sostituendo così le misurazioni tradizionali con intervalli di confidenza più bassi ed evitando test finali ad alta intensità di lavoro.

Esiste una correlazione lineare tra i risultati della titolazione ottenuti mediante misurazione dell'impedenza cellulare e mediante il saggio classico della placca o i metodi TCID50. Pertanto, i dati ottenuti con il metodo di titolazione basato sull'impedenza possono essere facilmente trasformati in valori TCID50 o pfu creando una curva standard con diluizione seriale del virus13,14,15,16,17. Anche il rilevamento, la quantificazione e l'efficacia degli anticorpi neutralizzanti presenti nei campioni di siero possono essere raggiunti utilizzando questo approccio sperimentale18,19. Più recentemente, sono stati utilizzati saggi cellulari basati sull'impedenza per lo screening e la valutazione di composti antivirali contro gli alfaherpesvirus Equid20.

Questa tecnologia è stata utilizzata per valutare la persistenza degli IAV in acqua salina a diverse temperature e per identificare mutazioni nell'emoagglutinina di IAV che aumentano o diminuiscono la persistenza IAV nell'ambiente21. Tale screening richiederebbe un ampio lavoro se si utilizzano metodi di titolazione tradizionali. Tuttavia, questa metodologia può essere utilizzata per qualsiasi virus che abbia un impatto sulla morfologia cellulare, sul numero di cellule e sulla forza di attaccamento della superficie cellulare. Può anche essere utilizzato per monitorare la persistenza in varie condizioni ambientali (ad esempio, nell'aria, nell'acqua o sulle superfici).

Il protocollo qui descritto applica la sopravvivenza IAV in acqua come esempio. I virus dell'influenza umana sono esposti a diversi parametri fisico-chimici durante periodi prolungati. L'acqua salina (35 g/L NaCl) a 35 °C è stata scelta come modello ambientale sulla base dei risultati precedenti9. L'infettività residua dei virus esposti è quantificata in diversi punti temporali attraverso l'infezione cellulare. Le cellule MDCK, il tipo di cellula di riferimento per l'amplificazione IAV, vengono seminate su piastre di microtitolazione a 16 pozzetti rivestite con sensori a microelettrodi e infettate da virus esposti 24 ore dopo. L'impedenza cellulare viene misurata ogni 15 minuti ed espressa come un'unità arbitraria chiamata indice cellulare (CI). Gli effetti citopatici indotti dal virus dell'influenza, il cui tasso di insorgenza dipende direttamente dal numero di particelle virali infettive inoculate nella coltura cellulare, portano alla diminuzione dell'IC, che viene successivamente quantificata come valore CIT50 . Questo valore corrisponde al tempo necessario per misurare una riduzione del 50% dall'IC iniziale (cioè prima dell'aggiunta del virus). I valori CIT50 calcolati per diversi tempi di esposizione ambientale consentono di dedurre la pendenza di inattivazione di un virus dopo la regressione lineare dei valori CIT50 .

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Protocollo

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Gestire tutti i virus influenzali in base ai requisiti appropriati del livello di biosicurezza (BSL-2 o superiore a seconda del sottotipo). Utilizzare ceppi IAV con una storia di passaggio basso (meno di 5 volte sulle cellule MDCK) per assicurare una bassa variazione tra gli esperimenti.

1. Preparazione dei reagenti e delle materie prime

  1. Preparazione di cellule MDCK e terreno di coltura cellulare sterile
    1. Coltivare cellule del rene canino Madin-Darby (MDCK) in mezzo di Eagle modificato (MEM) integrato con siero fetale inattivato al 10% di calore (FCS) e antibiotici (100 unità / mL di penicillina, 100 mg / mL di streptomicina).
    2. Dopo lo scongelamento, passa le cellule MDCK almeno 2 volte prima di infettarle per garantire il completo recupero (ma meno di 30 passaggi per evitare qualsiasi deriva nei fenotipi cellulari).
    3. Seminare uno o più palloni di coltura tissutale di 75 cm2 contenenti 30 mL di MEM sterile 1x con 7,5 x 106 cellule MDCK e incubare a 37 °C in incubatore a CO2 umidificato al 5%.
  2. Preparazione di apparecchiature di monitoraggio dell'impedenza
    1. Posizionare lo strumento nell'incubatrice a 35 °C e lasciarlo riscaldare per almeno 2 ore.
    2. Collegarlo all'unità di controllo posta all'esterno dell'incubatore.
    3. Procedere alle procedure di pulizia raccomandate dal produttore prima di iniziare il resto dell'esperimento.
  3. Produzione di scorte IAV su celle MDCK
    1. Per propagare e amplificare i virus H1N1, seminare 7,5 x 106 cellule MDCK su due palloni di coltura tissutale da 75 cm2 e incubare per 24 ore a 37 °C per raggiungere il 90%-100% di confluenza.
    2. Decantare il terreno di coltura cellulare dal monostrato cellulare in palloni da 75 cm2 . Lavare le cellule con 5 ml di PBS sterile 1x.
    3. Rimuovere PBS e aggiungere 5 ml di 1x PBS per lavare nuovamente le cellule.
    4. Etichettare un pallone come controllo e rimuovere PBS prima di aggiungere 15 ml di terreno di propagazione del virus (1x MEM con 0% FCS) con attenzione sul monostrato. Incubare questo matraccio in un incubatore mantenuto a 35 °C con il 5% di CO2. Usalo per il confronto dopo 3 giorni di propagazione.
    5. Scongelare un flaconcino di stock IAV a RT. Diluire il virus alla concentrazione appropriata in un tubo da 1,5 ml contenente mezzi di propagazione del virus (1x MEM con 0% FCS).
    6. Rimuovere 1x PBS dal pallone da 75 cm2 e infettare le cellule MDCK a una molteplicità di infezione (MOI) di 1 x 10-3 o 1 x 10-4 unità formanti placche per cellula (pfu / cellula) aggiungendo 1 mL del virus diluito al monostrato cellulare.
    7. Assorbire il virus alle cellule MDCK per 45 minuti a RT mescolando regolarmente il pallone ogni 15 minuti.
    8. Rimuovere delicatamente l'inoculo e aggiungere 15 mL di terreno di propagazione del virus per pallone contenente 1 μg/mL di TPCK-tripsina (tripsina/L-1-tosilamide-2-feniletile clorometilchetone), per scindere l'emoagglutinina virale HA0 nelle subunità HA1 e HA2 (un evento necessario per la fusione dell'HA con la membrana endosomiale e il rilascio del genoma virale)22.
    9. Incubare i palloni a 35 °C e al 5% di CO2 per almeno 3 giorni per replicare il virus.
    10. Osservare le cellule MDCK al microscopio con ingrandimento 40x e cercare effetti citopatici (CPE) sulle cellule (confrontandole con il pallone di controllo cellulare). Se il CPE non è completo (cioè circa l'80% delle cellule viene staccato dal substrato), rimettere i palloni nell'incubatrice per altre 24 ore.
    11. Quando cpe è completo, decantare il surnatante di coltura cellulare e centrifugare a 300 x g per 10 minuti per pellettare i detriti cellulari.
    12. Trasferire il surnatante chiarificato in un tubo da 15 ml e i virus della progenie aliquot in flaconcini criogenici sterili monouso. Posizionare immediatamente i criotubi a -80 °C per congelare e immagazzinare virus.

2. Determinazione della quantità cellulare appropriata per infettare le cellule

NOTA: durante tutti gli esperimenti, tenere le lastre su superfici non elettrostatiche in ogni momento, come gli involucri di carta dalla confezione. Seguire la sezione 2 di seguito per determinare la concentrazione più appropriata di cellule da seminare nella piastra microtitolare elettronica (progettata come E-Plate).

  1. Preparare le cellule MDCK in palloni da 75 cm2 per ottenere cellule appena divise (circa l'80% di confluenza) 24 ore prima dell'esperimento.
  2. Lavare le celle con 5 mL di 1x PBS e staccarle aggiungendo 3 mL di soluzione di tripsina-EDTA allo 0,25%.
  3. Aggiungere 7 mL di terreno di coltura cellulare fresco e contare le cellule utilizzando un contatore cellulare automatizzato con colorazione blu tripano.
  4. Regolare la concentrazione cellulare a 400.000 cellule/mL con terreni di coltura cellulare. Eseguire diluizioni seriali doppie in tubi aggiuntivi per ottenere densità cellulari di 200.000; 100,000; 50,000; 25,000; 12,500; e 6.250 celle/ml. Regolare l'intervallo di diluizione delle cellule in base al tipo di cellula e al loro comportamento di crescita.
  5. Lasciare la piastra E (Table of Materials) a RT per diversi minuti e aggiungere 100 μL di terreno di coltura cellulare a ciascun pozzo utilizzando una pipetta multicanale. Non toccare gli elettrodi della E-Plate.
  6. Sbloccare le culle e inserire il frontale della piastra nella tasca della culla dello strumento di misura dell'impedenza (Tabella dei materiali). Chiudi la porta dell'incubatrice.
  7. Aprire il software.
    1. In "Impostazione predefinita del modello di esperimento", scegli le culle selezionate e fai doppio clic sulla pagina principale, quindi inserisci il nome dell'esperimento. Fare clic su "Layout" e inserire le informazioni di campionamento necessarie per ogni pozzo selezionato della piastra; quindi, fai clic su "Applica" al termine. Fai clic su "Pianifica" | "Passi" | "Aggiungi un passaggio". Il software aggiunge automaticamente un passo di 1 s per misurare l'impedenza di sfondo (CI).
    2. Fare clic su "Start / Continue" nella scheda "Esegui". Fare clic su "Plot", aggiungere tutti i campioni selezionando i pozzetti appropriati e assicurarsi che CI sia compreso tra -0,1 e 0,1 prima di procedere al passaggio successivo.
  8. Rimuovere la piastra dalla base.
  9. Aggiungere 100 μL di ciascuna sospensione cellulare dal punto 2.4 in duplice copia ai pozzetti appropriati e 100 μL di supporti cellulari nei pozzetti utilizzati come controlli. Lasciare la piastra E nella cappa a flusso laminare per 30 minuti a RT per consentire una distribuzione uniforme delle celle sul fondo dei pozzetti.
  10. Inserire la piastra elettronica nella tasca della culla. Fai clic su "Pianifica" | "Aggiungi passo" nel software e inserisci i valori per monitorare le celle ogni 30 minuti per 200 ripetizioni. Quindi, seleziona "Avvia / Continua".
  11. Controlla e traccia i dati CI facendo clic sul pulsante "Plot" nel software. Selezionare la concentrazione di cellule che si trovano poco prima della fase stazionaria 24 ore dopo la semina sul piatto, al fine di ottenere cellule che sono ancora in una fase di crescita durante l'infezione virale. La fase stazionaria viene raggiunta quando l'IC è al massimo.

3. Correlazione tra i valori di CIT50 e la molteplicità dell'infezione

  1. Aggiungere 100 μL di terreno di coltura sterile 1x MEM in ogni pozzetto della piastra E. Inserire la piastra E nella tasca della base dello strumento a 35 °C. Misurare lo sfondo come descritto nel passaggio 2.7.
  2. Rimuovere la piastra elettronica dalla base.
  3. Seminare 3 x 104 di cellule MDCK appena divise su ciascun pozzetto della piastra microtitolatrice elettronica e coltivarle per 24 ore a 35 °C con il 5% di CO2 in modo che siano in una fase replicativa durante l'infezione da IAV.
  4. Infettare le cellule MDCK con diverse diluizioni 10 volte di un titolo noto di 6 log10 TCID50 / mL del virus H1N1, utilizzando il pipettaggio inverso per la riproducibilità seguendo i passaggi seguenti:
    1. Risciacquare le cellule MDCK 2x con 100 μL di MEM senza FCS (mezzi di propagazione del virus). Prestare attenzione alla rimozione di tutti i supporti dopo il secondo lavaggio per evitare un'ulteriore diluizione dell'inoculo.
    2. Aggiungere 100 μL di sospensione virale in ogni pozzetto utilizzando una pipetta monocanale. Per evitare contaminazioni, procedere partendo da sinistra a destra e poi dall'alto verso il basso nella piastra, coprendo i pozzetti rimanenti con il coperchio.
    3. Inserire la piastra nella tasca della culla dello strumento a 35 °C. Sii gentile per evitare movimenti improvvisi che potrebbero portare a contaminazioni.
    4. Iniziare a monitorare l'impedenza cellulare ogni 15 minuti durante almeno 100 ore come descritto nel passaggio 2.10.
    5. Dopo i due cicli di misurazioni (cioè 30 min), mettere in pausa l'apparecchio facendo clic su "Pausa" nella scheda "Esegui" e rimuovere la piastra E dalla base.
    6. Aggiungere 1 μg/mL di TPCK-tripsina al mezzo di propagazione del virus per scindere l'emoagglutinina virale.
    7. Aggiungere 100 μL di mezzo di propagazione del virus contenente TPCK-tripsina in ciascun pozzetto e inserire la piastra E nella tasca della culla.
    8. Fai clic su "Avvia / Continua" nella scheda "Esegui".
      NOTA: Non dimenticare di creare un controllo negativo corrispondente alle cellule infettate da simulazioni sostituendo la sospensione virale con mezzi di propagazione del virus.

4. Cinetica di sopravvivenza IAV

  1. Esporre gli IAV all'acqua distillata salina a 35 °C e testare la loro infettività nel tempo misurando la diminuzione dell'impedenza della cella.
    1. Preparare acqua distillata salina aggiungendo NaCl ad una concentrazione finale di 35 g/L in acqua distillata. Aggiungere 900 μL di acqua salina in 2 mL di criotubi.
    2. Aggiungere 100 μL di brodo virale in acqua salina e posizionare i criotubi in un incubatore (35 °C, 5% CO2) per 1 ora, 24 ore o 48 ore.
    3. Seminare 100 μL (contenenti 3 x 104) di cellule MDCK appena divise su una piastra di microtitolazione a 16 pozzetti e crescere per 24 ore a 37 °C e 5% di CO2.
    4. Infettare le cellule con 100 μL di virus esposti (precedentemente diluiti 10 volte nei terreni di coltura) utilizzando il metodo del pipettaggio inverso per la riproducibilità ripetendo il paragrafo 3.4.
  2. Monitorare l'impedenza della cella ogni 15 minuti per almeno 100 ore.

5. Valutazione della perdita di infettività

  1. Determinazione dei valori di CIT50 per quantificare la diminuzione dell'IC dovuta agli effetti citopatici indotti dal virus con il valore CIT50 .
    1. Fai clic su "Plot" e aggiungi tutti i campioni facendo clic su "Aggiungi tutto". Esporta i risultati in un foglio di calcolo facendo clic su "Esporta informazioni sull'esperimento". Considerare l'IC iniziale come valore di impedenza cellulare misurato 5 ore dopo l'infezione cellulare da virus esposti (cioè 24 ore dopo la semina delle cellule MDCK sulla piastra E del microtitolo).
    2. Calcola il valore CIT50 corrispondente al tempo necessario per misurare una diminuzione del 50% rispetto all'IC iniziale. Per calcolare il valore CIT50 , prendere nota del valore CI a 5 hpi per ogni campione. Quindi, trova il punto temporale in cui il valore CI è uguale alla metà del valore CI a 5 hpi utilizzando le funzioni di indice e corrispondenza nel foglio di calcolo.
  2. Calcolo della pendenza media di inattivazione
    1. Determinare i valori di CIT50 per ogni sospensione virale esposta, in diversi momenti di esposizione (in giorni).
    2. Calcolare una pendenza di regressione lineare dai valori tracciati CIT50, denominati pendenza di inattivazione ed espressi in CIT50.day-1.

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Risultati

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I dati grezzi ottenuti dopo 120 ore con diverse concentrazioni di cellule MDCK, da 15.000 a 120.000 cellule per pozzetto, sono mostrati nella Figura 1. Dopo 24 ore, le misure di IC mostrano che le cellule nei pozzi seminati con 30.000 cellule erano ancora nella fase esponenziale di crescita, e questa concentrazione cellulare è stata utilizzata per ulteriori esperimenti. La Figura 2 illustra la correlazione lineare tra i valori cit50 e la molteplicità ...

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Discussione

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RTCA è una tecnologia basata sull'impedenza che viene sempre più utilizzata per il monitoraggio in tempo reale delle proprietà cellulari, come l'aderenza cellulare, la proliferazione, la migrazione e la citotossicità. In questo studio, la capacità di questa tecnologia di valutare la sopravvivenza IAV al di fuori dell'ospite è dimostrata misurando la pendenza dell'inattivazione del virus. Tecniche meticolose come TCID50 e saggi di placca sono sostituite da una valutazione obiettiva in tempo reale della vitalità...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,25%TripsinaThermoFisher25200056
75 cm2 pallone per coltura tissutaleFalcon430641U
E-Plate 16 (6 piastre)ACEA Biosciences, Inc5469830001Le E-plates sono disponibili in diverse confezioni
FCSLife technologies (gibco)10270-106
MEM 1XLife technologies (gibco)31095029
PBS 1XLife technologies (gibco)14040091
Penicillina-StreptomicinaLife technologies (gibco)11548876
TPCK-TrypsinWorthingtonLS003740
xCELLigence Real-Time Cell Analysis Instrument S16ACEA Biosciences, Inc380601310Gli strumenti xCELLigence RTCA S16 sono disponibili in diversi formati (16 pozzetti, 96 pozzetti, piastra singola o multipla)

Riferimenti

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