Worm-align e Worm_CP, due pipeline open source per raddrizzare e quantificare i dati delle immagini a fluorescenza ottenuti da Caenorhabditis elegans

Sommario

Worm-align/Worm_CP è un semplice flusso di lavoro FIJI/CellProfiler che può essere utilizzato per raddrizzare e allineare i campioni di caenorhabditis elegans e per ottenere test basati su immagini worm interi senza la necessità di passaggi di formazione precedenti. Abbiamo applicato worm-align/Worm_CP alla quantificazione dell'espressione indotta da shock termico negli animali vivi o goccioline lipidiche in campioni fissi.

Abstract

Un problema che si verifica spesso quando si acquisiscono dati di immagine da C. elegans fissi o anesteti è che i worm si incrociano e si raggruppano con i loro vicini. Questo problema è aggravato dall'aumento della densità dei vermi e crea sfide per l'imaging e la quantificazione. Abbiamo sviluppato un flusso di lavoro basato su FIJI, Worm-align, che può essere utilizzato per generare montaggi a canale singolo o multicanale di worm selezionati dall'utente, raddrizzati e allineati dai dati delle immagini non elaborati di C. elegans. Worm-align è un flusso di lavoro semplice e intuitivo che non richiede una formazione preliminare né dell'utente né dell'algoritmo di analisi. I montaggi generati con Worm-align possono aiutare l'ispezione visiva dei vermi, la loro classificazione e rappresentazione. Inoltre, l'output di Worm-align può essere utilizzato per la successiva quantificazione dell'intensità di fluorescenza in singoli worm, sia direttamente nelle FIJI, sia in altre piattaforme software di analisi delle immagini. Lo dimostriamo importando l'output di worm-align in Worm_CP, una pipeline che utilizza il software CellProfiler open source. La flessibilità di CellProfiler consente l'incorporazione di moduli aggiuntivi per lo screening ad alto contenuto. Come esempio pratico, abbiamo utilizzato la pipeline su due set di dati: il primo set di dati sono immagini di worm reporter shock termici che esprimono proteine fluorescenti verdi (GFP) sotto il controllo del promotore di un gene indutbile da shock termico hsp-70e il secondo set di dati sono immagini ottenute da vermi fissi, macchiati per fat-store con un colorante fluorescente.

Introduzione

Un organismo relativamente semplice, il nematode C. elegans, è un sistema modello estremamente utile per lo studio delle malattie umane. Circa il 38% dei geni nel genoma di C. elegans ha controparti funzionali nell'uomo^1,2. Una delle caratteristiche uniche di C. elegans è che è otticamente trasparente, consentendo un facile accesso alle informazioni in vivo riguardanti l'espressione (sub) cellulare dei reporter fluorescenti attraverso i tessuti. Ciò rende C. elegans un organismo modello primario per schermi ad alto contenuto che utilizzano piattaforme basate su immagini³. Tuttavia, un problema che spesso complica questi studi è che quando si imagingno popolazioni dense di vermi, tendono ad attraversare e raggrupparsi, rendendo difficili i confronti tra i singoli worm, offuscando l'analisi e la quantificazione delle immagini a valle.

Le soluzioni esistenti che superano questo problema in genere si basano sull'ottimizzazione del protocollo di coltivazione e imaging, ad esempio attraverso l'utilizzo di configurazioni microli fluidiche⁴, consentendo l'cattura di singoli worm in immagini separate^5,6. Altri hanno applicato algoritmi di machine learning che consentono il riconoscimento di singoli worm, anche in una popolazione grumiata. Un ottimo esempio di quest'ultimo è WormToolbox, che è un'estensione modulare della piattaforma di analisi delle immagini open source CellProfiler⁷. WormToolbox offre una soluzione ad alta produttività e ad alto contenuto per l'analisi di C. elegans ebeneficia chiaramente della sua inclusione in CellProfiler, in quanto è possibile includere facilmente moduli di analisi aggiuntivi. Sebbene WormToolbox venga fornito con un modello pre-addestrato (DefaultWormModel.xml), il training dell'algoritmo di machine learning è in genere necessario per ogni nuova applicazione. Esercitazioni online su come farlo sono disponibili su Github (https://cp-website.github.io/Worm-Toolbox/). Nonostante ciò, l'installazione e l'utilizzo di WormToolbox richiede un significativo investimento in termini di tempo per gli utenti alle prime armi.

Qui descriviamo un protocollo semplice ed economico per la cultura e le popolazioni di immagini di C. elegans. Per consentire la valutazione dei singoli worm nelle immagini acquisite abbiamo sviluppato un semplice flusso di lavoro open source basato su FIJI, denominato Worm-align. L'allineamento dei worm può essere utilizzato per generare montaggi a canale singolo o multicanale di worm raddrizzare e allineati. In primo luogo, l'utente deve selezionare manualmente singoli worm per l'analisi disegnando una linea dalla testa alla coda. L'allineamento dei worm utilizzerà questa selezione per ritagliare i worm selezionati dall'immagine panoramica e generare un montaggio in cui i worm selezionati vengono raddrizzata e allineata per facilitare il confronto visivo e la presentazione.

Inoltre, l'output di Worm-align può essere utilizzato per la successiva quantificazione dell'intensità di fluorescenza in singoli worm, sia direttamente nelle FIJI, sia in altre piattaforme software di analisi delle immagini. Lo dimostriamo importando l'output di worm-align in Worm_CP, una pipeline che utilizza il software CellProfiler open source. La flessibilità di CellProfiler consente l'incorporazione di moduli aggiuntivi per lo screening ad alto contenuto. Abbiamo utilizzato la tubazione Worm_CP per quantificare la risposta allo shock termico, un meccanismo protettivo ben conservato che riformuplica le proteine che vengono piegate erroneamente a causa di fattori di stress^{come l'alta}temperatura 8 . Nello specifico, abbiamo applicato la tubazione ai vermi che trasportano un transgene multi-copia integrato, dove il promotore di un gene indutbile da shock termico, hsp-70(C12C8.1), guida la proteina fluorescente verde (GFP)⁹. Abbiamo anche utilizzato la pipeline Worm_CP su animali fissi che sono stati etichettati con un colorante fluorescente che visualizza goccioline lipidiche (LDs), il principale organello di conservazione dei grassi in C. elegans¹⁰. Sebbene questo flusso di lavoro non abbia la velocità effettiva offerta da WormToolBox, è un'alternativa semplice e intuitiva per la presentazione visiva e l'analisi di esperimenti C. elegans basati su immagini.

Protocollo

1. Fissazione di vermi per l'imaging a contenuto di grassi utilizzando un colorante fluorescente per goccioline lipidiche (BODIPY)¹⁰

1. Preparare una popolazione sincronizzata di C. elegans sbiancando secondo le procedure standard². Placcare circa 1.000 vermi a 1 stadio L1 su una piastra di 9 cm di media di crescita del nematode (NGM) per condizione.
   NOTA: Vengono preparati più vermi di quanti siano effettivamente quantificati alla fine, a causa della perdita di vermi durante la manipolazione.
2. Per immaginire gli animali in fase di giovane adulto (circa 50 h dopo la placcatura L1 a 20 °C), lavare ogni piastra di 9 cm con 15 ml di M9 in un tubo conico, centrifugare a 252 x g per 1 minuto e rimuovere il supernatante.
3. Ripetere il lavaggio e lasciare 1 mL di M9 sul pellet di vermi.
4. Trasferire 1 ml di M9 contenente i vermi in un tubo di microcentrifugo a basso legame proteico da 2 ml, utilizzando punte a bassa ritenzione.
5. Girare verso il basso a 252 x g in un microcentrifugo per 1 minuto e rimuovere il supernatante, facendo attenzione a non toccare il pellet di verme nella parte inferiore del tubo.
6. Per il monitoraggio del contenuto di grassi utilizzando colorazione 4,4-difluoro-1,3,5,7,8-Pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene (BODIPY)¹⁰ (Tabella dei materiali),fissare i vermi aggiungendo 0,5 mL di isopropanolo al pellet di verme per 3 min¹¹o aggiungendo 2 mL di metanolo ghiacciato per 10 min. Per entrambe le procedure, invertire il tubo ogni 30 s.
   ATTENZIONE: Se il metanolo è il reagente di fissazione scelto, questo passaggio deve essere intrapreso in una cappa aspirante a causa della sua tossicità.
7. Rimuovere il più fissatore possibile senza toccare il pellet di verme e aggiungere 1 mL di M9. Lasciare che i vermi si sistemino nella parte inferiore del tubo per 3−5 minuti.
8. Lavare di nuovo con 1 ml di M9, lasciare depositare i vermi e rimuovere il supernatante, lasciando circa 50 μL nel tubo. Fissare il tubo utilizzando un morsetto.
9. Congelare i vermi facendo precipitare il tubo saldamente chiuso in azoto liquido e quindi in un bagno d'acqua calda a ~ 40 °C.
10. Ripetere il passaggio 1.9 un'altra volta.
11. Aggiungere 0,5 mL di BODIPY diluito in M9 ad una concentrazione finale di 1 μg/μL e posizionare su un rotatore a temperatura ambiente per 1 h.
12. Dopo 1 h, lasciare che i vermi si sistemino nella parte inferiore del tubo per 3−5 minuti.
13. Rimuovere il supernatante e aggiungere 1 mL di M9.
14. Lascia che i vermi si sistemino sul fondo e rimuovono il supernatante.
    NOTA: In alternativa, è possibile girare verso il basso a 252 x g per 1 min, in quanto ciò non sembra influenzare la morfologia.
15. Aggiungere 0,5 mL di M9.
    NOTA: Se il fissatore è isopropanolo al 60%, i vermi possono essere utilizzati solo entro 48 ore. Se il fissatore è il metanolo, i vermi devono essere utilizzati entro 24 ore.

2. Preparazione di cuscinetti di agarosio per montare i vermi

NOTA: Il passaggio critico durante la preparazione di un tampone di agarosio è quello di ottenere un cuscinetto di spessore regolare. Altrimenti, i vermi attraverso il pad si trovaranno in diversi piani focali, rendendo difficile ottenere un'immagine mirata di un campo visivo più ampio.

1. Preparare il 2% di tamponi di agarosio aggiungendo 0,2 g di agarosio a 10 ml di H₂O sterilizzato in un becher o in un pallone conico. Riscaldare nel microonde per 30 s fino a quando l'agarosio inizia a bollire.
   NOTA: Non surriscaldarsi e fermarsi non appena compaiono bolle; altrimenti aumenta la viscosità dell'agarosio rendendo più difficile ottenere lo spessore del pad desiderato.
2. Una volta sciolto l'agarosio, erogare una goccia di agarosio fuso al centro di uno scivolo di vetro al microscopio utilizzando una punta della pipetta da 1000 μL con il suo taglio finale. Immediatamente, ma delicatamente, tenere un altro scivolo di vetro molto vicino alla goccia di agarosio e rilasciarlo sull'agarosio per formare un cuscinetto di spessore regolare per i migliori risultati di microscopia.
   NOTA: il rilascio della diapositiva superiore da un'altezza non solo formerà bolle, ma si tradurrà in un pad irregolare. In alternativa, è anche possibile utilizzare due scivoli di vetro che fiancheggiano lo scivolo con il pad, con un sottile strato di nastro su ogni diapositiva.
3. Dopo un minimo di 2−3 minuti, rimuovere delicatamente lo scivolo superiore. Utilizzando il lato dello scivolo superiore, tagliare il pad per renderlo di forma quadrata. Montare i vermi entro 5 minuti, per evitare che il pad si asciughi prima dell'uso.

3. Montaggio di worm fissi per l'imaging

1. Creare una micropipetta bocca estendendo un sottile capillare di vetro nella fiamma di un bruciatore Bunsen (Figura 1A). Dopo l'estensione nella fiamma, rompere il capillare in due pezzi (Figura 1B). Scegli il più adeguato, di solito il più lungo, e verifica se la fine del capillare è aperta cercando di aspirare l'acqua.
   NOTA: Se il liquido non entra nel capillare, è troppo sottile o bloccato. Tagliare delicatamente l'estremità del capillare con un paio di forbici, evitando di tagliare troppo come i vermi saranno aspirati se il foro è troppo grande.
2. Collegare il capillare di vetro del passaggio 3.1 all'adattatore capillare (Figura 1C), collegato al tubo di silicone da 6 mm e collegare l'altra estremità del tubo di silicone da 6 mm a un filtro da 0,2 μm, attaccato a un tubo di silicone da 3 mm all'altra estremità(figura 1C). Collegare una punta filtrante da 1 ml(Figura 1C)all'estremità libera del tubo in silicone da 3 mm per aspirare il liquido.
   NOTA: Il filtro da 0,2 μm viene aggiunto tra la bocca dello sperimentatore e il capillare, per garantire la massima sicurezza dello sperimentatore. Una soluzione simile viene utilizzata per le micropipette per la bocca utilizzate per gestire embrioni di^{topo 12}. Cambiare il filtro (di solito ogni pochi mesi) se la micropipetta della bocca non aspira più liquido.
3. Utilizzando la micropipetta della bocca al microscopio a dissezione, rimuovere il più liquido possibile intorno al pellet di verme di vermi fissi (Figura 2).
   NOTA: Pipettare il supernatante utilizzando una micropipetta manuale può essere utilizzato come alternativa alle pipette per la bocca nei passaggi da 3.1 a 3.3 per rimuovere il più possibile il supernatante. Aggiungere 6 μL di mezzo di montaggio. Scopriamo, tuttavia, che questo metodo non funziona in modo così efficiente perché il liquido eccessivo nei cuscinetti crea una densità di verme sparsa, il che rende l'imaging più dispendioso in termini di tempo. Riprendere il passaggio 3.6. Guarda il fondo del tubo e assicurati che la pipetta non ambi i vermi.
4. Aggiungere rapidamente 10 μL di supporto di montaggio(Tabella deimateriali) sul fondo del tubo.
5. Risciacquare una punta di 10 μL in PBS con tracce di detersivo (0,01% Tritone), per evitare che i vermi si attacchino ai lati della punta della pipetta di plastica. Tagliare l'estremità della punta con un paio di forbici.
6. Trasferire 8 μL di mezzo di montaggio contenente i vermi sul tampone di agarosio preparato al passaggio 2.3. Al microscopio, scuotere delicatamente lo scivolo, per evitare sovrapposizioni dei vermi.
7. Coprire la goccia di mezzo di montaggio sul tampone di agarosio con un coverslip da 18 mm x 18 mm(Figura 3).
   NOTA: I copripasci più piccoli sono preferiti in quanto esercitano meno pressione sui vermi. Tenere la coverslip con un paio di pinzette e applicare un bordo della coverslip contro il tampone di agarosio, prima di depositare delicatamente il coverslip con le pinzette.

4. Montaggio di worm vivi per l'imaging

NOTA: Per immaginire vermi vivi, devono essere immobilizzati sul pad. Un modo per raggiungere questo obiettivo è paralizzarli con l'agonista del recettore nicotinico: levamisolo(Tavolo dei Materiali).

1. Pipetta 3−4 μL di levamisolo da 3 mM sciolta in M9 sul cuscinetto di agarosio creato nel passaggio 2.3.
   NOTA: Ci dovrebbe essere abbastanza volume liquido che i vermi non sono uno sopra l'altro ma non troppo liquido che i vermi sono troppo sparsi sul pad. I raccoglitori di vermi esperti possono utilizzare 3 μL di levamisolo. I raccoglitori meno esperti potrebbero dover aggiungere un volume maggiore di levamisolo, in modo che la levamisolo non evapori completamente.
2. Scegli 30−50 vermi per condizione nella goccia di levamisolo.
3. Coprire la goccia di levamisolo sul cuscinetto in agarosio con un copripacchi da 18 mm x 18 mm. Vermi immagine entro 1 h, poiché l'agente paralizzante alla fine porterà alla morte dei vermi.

5. Diapositive di imaging con un microscopio a epifluorescenza

1. Con un cuscinetto di agarosio di spessore uniforme, immagini tutti i vermi sullo scivolo contemporaneamente usando un'immagine grande 6 x 6 o 7 x 7, ad esempio con l'obiettivo 20x di un microscopio fluorescente. Se lo spessore del pad non è uniforme, acquisire diverse immagini più piccole 3 x 3 o 4 x 4 della stessa diapositiva.
2. Utilizzare le stesse impostazioni per l'intensità della fluorescenza e il tempo di esposizione per tutte le condizioni. Regola ogni impostazione in modo che corrisponda alla diapositiva con l'intensità più luminosa, assicurandoti che non vi sia saturazione di pixel. Per istruzioni specifiche sull'acquisizione delle immagini, seguire le istruzioni del produttore del microscopio.

6. Creazione di immagini di montaggio di singoli worm allineati utilizzando la pipeline FIJI allineata ai vermi

1. Installare il pacchetto software di analisi delle immagini open source FIJI¹³/ImageJ¹⁴ da https://imagej.net/Fiji. Se è disponibile un'installazione precedente di FIJI, assicurarsi che sia aggiornata alla versione 1.52a o successiva, poiché alcune delle funzioni utilizzate nella macro (ad esempio, funzioni table) lo richiedono. Scarica la macro Di allineamento worm da Github: https://github.com/hannekeo/Worm-align.
2. Aprire FIJI ed eseguire la macro Allinea worm. Eseguire l'allineamento del worm facendo clic su Plug-in | Macro | Eseguire nella barra dei menu principale delle FIJI (Figura S1). Individuare ora lo script Worm-align.ijm nel computer.
3. La macro viene inizializzata chiedendo la posizione delle immagini. La pipeline funzionerà su immagini a fluorescenza a canale singolo e multicanale (Figura S2). Selezionare una cartella di input e la macro genererà automaticamente una cartella di output in cui verranno salvati tutti i risultati (Figura S3).
   NOTA: è importante che la cartella selezionata contenga solo file di immagine poiché la presenza di altri formati di file causerà l'arresto anomalo della macro. Idealmente, raggruppa solo le immagini acquisite con le stesse impostazioni del microscopio. Worm-align accetterà molti formati di file diversi, tra cui nd2, czi, tif, rgb, jpg e png. Il nome della cartella di output sarà lo stesso della cartella di input, con '_output' aggiunto come postfix, cioè se la cartella di input è 'images', l'output verrà trovato in 'images_output'. La cartella di output conterrà quattro sottocartelle, in cui i dati verranno salvati.
4. Consentire alla macro di procedere all'apertura della prima immagine nella cartella di input e utilizzarla come immagine rappresentativa per estrarre un'impostazione per generare il montaggio.
   NOTA: l'allineamento del worm selezionerà automaticamente la prima immagine nella cartella di input per generare le impostazioni che verranno applicate a tutte le altre immagini nella cartella. Se un'altra immagine è considerata più rappresentativa del set di dati, assicurarsi che questa immagine sia selezionata salvando una copia dell'immagine nella cartella di input, modificando il nome in modo che sia ora elencato nella parte superiore dell'elenco (ad esempio, '0_RepresentativeImage').
5. Con lo strumento Disegno a linea retta, disegnare una linea sulla larghezza di un worm (Figura S4) e utilizzare la lunghezza di questa linea per determinare l'altezza delle regioni ritagliate per singoli worm. Per ogni canale, specificare il nome, la tabella di ricerca (LUT), le impostazioni di intensità (B&C) e se deve essere inclusa nel montaggio (Figura S4).
   NOTA: questi parametri vengono registrati e salvati in un file di impostazioni, Settings.csv, che si trova nella sottocartella CellProfiler della cartella di output.
6. Una volta acquisite tutte le impostazioni, all'utente viene mostrato come saranno le immagini dopo l'applicazione delle impostazioni applicate (Figura S5). Selezionare la casella superiore se le impostazioni sono sufficienti. Selezionare le opzioni per la generazione del montaggio (rimuovere i segni di graduazione, se non necessario): 1. Generare un montaggio di worm selezionati per ogni singola immagine oppure 2. Generare un montaggio combinato in cui tutti i worm selezionati su tutte le immagini nella cartella di input verranno combinati in un unico montaggio. Fare clic su OK per eseguire il resto della macro.
   NOTA: se la casella superiore non viene spuntata prima di fare clic su 'OK', la macro rieseguirà la configurazione, in modo che le impostazioni dell'immagine possano essere ottimizzate.
7. La pipeline di allineamento worm ora procede all'apertura di tutte le immagini nella cartella di input. Per ogni immagine, disegnare linee sull'asse longitudinale di tutti i worm da includere nel montaggio e/o quantificare (Figura 4 e Figura S6) utilizzando lo strumento "linea segmentata" (sulla barra dei menu principale delle FIJI). Per garantire il corretto allineamento del worm, disegnare linee in modo coerente da testa a coda (o viceversa) e lungo l'intera lunghezza del worm (vedere esempi di disegno di linee "buono" e "cattivo" nella figura 4B).
8. Aggiungere ogni riga al gestore del ROI, facendo clic su CTRL+T. L'allineamento dei worm utilizza le linee aggiunte al gestore del ROI, in combinazione con il parametro width del worm (impostato nel passaggio 6.4) per generare immagini ritagliate di singoli worm selezionati. L'insieme di ROM di riga viene salvato nella sottocartella 'data'. Questa cartella contiene anche una copia dell'immagine originale che mostra le linee e il numero del worm. Le linee sono codificate a colori con la Glasbey_on_dark di ricerca. Le immagini dei worm raddrizzate vengono salvate nella single_worms della cartella di output. Inoltre, se selezionata nel passaggio 6.6 di questo protocollo, Worm-align produce montaggi di tutti i worm selezionati per immagine panoramica e/o per tutte le immagini panoramiche nella cartella di input (vedere la figura 4C e la figura S7). Questi montaggi si trovano nella sottocartella 'allineata' della cartella di output.

7. Analisi dell'intensità della fluorescenza a worm singolo utilizzando l'output di Worm-align in una pipeline cellprofiler automatizzata

1. Per l'elaborazione e l'analisi downstream dei dati dell'output worm-align, scaricare e installare il pacchetto software di analisi delle immagini open source 'CellProfiler^15,16 da https://cellprofiler.org/. Scaricare la pipeline Worm_CP.cpproj da GitHub: https://github.com/hannekeo/Worm-align
   NOTA: la pipeline di esempio descritta qui è stata costruita utilizzando CellProfiler2.2.0 e potrebbe non essere eseguita nelle versioni successive di CellProfiler.
2. Prima di avviare la pipeline Worms_CP.cpproj, assicurarsi che tutte le immagini di output previste siano presenti nella sottocartella CellProfiler della cartella di output Worm-align: una copia elaborata dell'immagine originale (denominata: Original_), una maschera immagine binaria della popolazione di worm (denominata: Mask_), una maschera di linea delle linee disegnate su worm selezionati (denominata: Lines_) e un'immagine che rappresenta ciascuno dei canali presenti nell'immagine originale (denominata dal numero di canale).
3. Per quantificare l'intensità della fluorescenza in singoli worm, fare clic sul modulo di input Immagini e trascinare semplicemente la cartella di output di CellProfiler nella finestra che indica Rilascia file e cartelle qui. Se dall'analisi precedente è presente un elenco di immagini, rimuoverle facendo clic con il pulsante destro del mouse nella finestra e selezionando Cancella elenco file. Per escludere il file 'Impostazioni.csv' dall'elenco immagini, selezionare 'Solo immagini' o 'Personalizzato' con 'Estensione è tif, tiff, ome.tif o ome.tiff' per le impostazioni del filtro (Figura S8).
4. Fare clic sul modulo di input dei metadati. Nel secondo metodo di estrazione fare clic sulla cartella gialla e individuare la sottocartella CellProfiler nella cartella di output WormAlign (Figura S9). Selezionare il file Impostazioni.csv e collegare le impostazioni del file all'output di CellProfiler abbinando i metadati nei file CSV a quelli presenti nelle immagini (metadati del canale).
5. Fare clic sul modulo di input NamesAndTypes e inserire una nuova immagine per ogni canale dell'immagine originale da quantificare.
   NOTA: Già presenti nella pipeline di esempio sono la maschera worm, due immagini a colori, la maschera di linea e l'immagine originale e tre immagini in scala di grigi (il canale verde e il canale rosso). L'elenco in questo modulo deve essere regolato se le immagini originali hanno più o meno canali rispetto alle immagini di esempio.
6. Verificare che il nome delle immagini in ogni etichetta di colonna/maschera/worm sia corretto.
   NOTA: I nomi delle immagini su una riga dovrebbero corrispondere tutti alla stessa immagine iniziale da analizzare. Se si verifica un errore durante il processo di analisi delle immagini, alcune delle immagini di output saranno mancanti e i nomi sotto l'etichetta/maschera/worm delle tre colonne non corrisponderanno più alla stessa immagine iniziale per ogni riga. In tal caso, scopri dov'è l'errore.
7. Premere Visualizza impostazione di output per selezionare la cartella per salvare l'output da Cellprofiler.
8. Fare clic su Avvia modalità test. Una volta in modalità test, ricontrollare le impostazioni della pipeline applicandole alla prima immagine del set di dati, facendo clic su Esegui (che verrà eseguito attraverso tutti i moduli attivi nella pipeline) o Passaggio (che verrà eseguito attraverso la pipeline un modulo alla volta).
   NOTA: durante la modalità di test, le misure estratte non verranno esportate, anche se nella pipeline è presente (e attivo) un modulo ExportToSpreadsheet.
9. Una volta che la pipeline ha eseguito come dovrebbe, fare clic su Esci dalla modalità di test e quindi premere Analizza immagini. Come attualmente configurato, il Worms_CP utilizzerà (1) l'immagine Mask_ per segmentare una maschera worm ruvida e l'immagine Lines_ ( FiguraS10A) per identificare i worm selezionati e produrre maschere worm singole (Figura S10C), (2) misurare l'intensità di fluorescenza di tutti i canali presenti nelle immagini di input nei worm identificati e mascherati. La tubazione può anche misurare l'intensità dello sfondo (Figura S10B) e correggere tutte le immagini di conseguenza (indicata dalla soglia della parola nel nome del parametro misurato. ad esempio: Intensity_MeanIntensity_green_threshold), (3) misurare le dimensioni dei worm selezionati e (4) esportare tutti i parametri misurati (Figura S10D).
10. Aprire l'output Worm_CP costituito da due file CSV, worm.csv e righe.csv salvati nella cartella di output selezionata (vedere la figura S11). Questi file possono essere aperti in Excel o R (Studio) per la post-elaborazione e la creazione di report. Se è necessario un output aggiuntivo, ad esempio per dati immagine, è possibile selezionare questo elemento nel modulo ExportToSpreadsheet della pipeline.

Risultati

La coltivazione e l'imaging di C. elegans secondo il metodo descritto in questo protocollo produce grandi immagini panoramiche delle popolazioni di vermi. Per facilitare l'ispezione visiva e la classificazione dei worm da queste immagini abbiamo sviluppato l'allineamento dei vermi. Worm-align è uno script FIJI semplice e intuitivo che può essere utilizzato per creare montaggi di worm raddrizzare e allineati. I worm vengono selezionati dalle immagini panoramiche disegnando una linea lungo l'asse longitudinale dei vermi. A ogni worm selezionato viene assegnato un numero, ritagliato e raddrizzare e aggiunto a un montaggio. I montaggi possono essere generati per immagine o combinando tutte le immagini dalla cartella di input originale.

Come previsto, l'output della pipeline dipende in gran parte dalla qualità delle linee disegnate sopra le immagini. Per illustrare questo punto, nella figura 4 vengono mostrati diversi esempi di linee e il loro output da Worm-align. Una linea completa dalla testa alla punta della coda produce un verme correttamente allineato (etichettato come "buono"). La figura 4 mostra anche come le imprecisioni di tracciatura durante l'esecuzione di Worm-align influenzino l'output dell'allineamento. Dal montaggio annotato incluso nella figura 4C, occorre fare attenzione a evitare i seguenti errori, in quanto ostacolano il corretto allineamento dei worm:

• Tracciamento incoerente del verme dalla testa alla coda (etichettato come "coda a testa"). Ciò si traduce nell'orientamento dei vermi in direzioni diverse (ad esempio, coda a testa rispetto alla testa alla coda) nell'allineamento.
• Tracciatura incompleta (etichettata come "incompleta"). Ciò si traduce solo nella parte del verme che è stata tracciata per essere ritagliata per il montaggio.
• Inclusione di più worm in un'unica traccia (etichettata come "worm con due teste"). Ciò si traduce in worm più (sezioni significative di) i loro vicini inseriti nello stesso pannello del montaggio.
• Aggiunta di linee casuali all'immagine (etichettata come "casuale"). Ciò si traduce nell'inserimento di pannelli casuali nel montaggio.

Per la creazione del montaggio non è un problema se due singole linee si intersecano (etichettate "intersecandosi") o vengono unite a entrambe le estremità del worm (etichettate come "unite"), purché ogni riga traccia l'intera lunghezza di un singolo worm: lo script worm-align seleziona singolarmente e seleziona in sequenza ogni RIGA ROM, la ritaglia e la raddrizza, in modo che ogni pannello nel montaggio finale rappresenti una singola traccia di riga. Nel caso dei worm intersecanti, tuttavia, sebbene i vermi raddrizzata a lunghezza intera appaiano per il worm "intersecting1" e il worm "intersecting2" nel montaggio (vedere figura 5A-B), è chiaramente evidente che questi worm si incrociano nell'immagine panoramica originale. Pertanto, si può concludere che l'identificazione visiva delle linee intersecante è possibile dall'immagine sovrapposta presente nella sottocartella 'data' (Figura 5A), nonché dai pannelli dei singoli worm nel montaggio (Figura 5B). Inoltre, qualsiasi sovrapposizione di worm/linee può essere identificata dalla tabella di controllo qualità (QC) generata per ogni immagine elaborata da Worm-align e salvata nella sottocartella dati. Questa tabella registra tre parametri per ciascuna delle ROI di linea disegnate nell'immagine (vedere la figura 5C): di questi, Lunghezza indica la lunghezza del ROI della linea, che è un buon indicatore delle dimensioni del worm; e il numero worm indica l'ordine in cui le linee sono state disegnate sull'immagine panoramica. Infine, l'ultima colonna indica se vi è sovrapposizione tra il worm/linea in questione e uno qualsiasi degli altri worm/linee selezionati nell'immagine. In caso di sovrapposizione, il numero in questa colonna sarà diverso da quello elencato nella colonna Numero worm. In combinazione con l'immagine sovrapposta, la tabella QC dovrebbe aiutare il ricercatore a prendere decisioni apprese su quali vermi dovrebbero essere esclusi dal montaggio e / o dalla quantificazione.

L'uscita di Worm-align può essere utilizzata per la successiva quantificazione dell'intensità di fluorescenza in singoli vermi. In FIJI, le ROM di linea possono essere usate per misurare l'intensità della fluorescenza nei dati dell'immagine originale, ad esempio eseguendo il semplice script FIJI ' Worm-quant.ijm', che può essere trovato anche nel repository Worm-align su Github. In alternativa, l'output worm-align può essere importato in software di analisi delle immagini di terze parti. Lo dimostra importando l'output di worm-align di due set di Worm_CP, una pipeline generata in CellProfiler. Worm_CP utilizza i file nella sottocartella 'CellProfiler' della cartella di output Di allineamento worm per ottimizzare le maschere di segmentazione dei singoli worm selezionati durante l'esecuzione della macro Di allineamento worm. In particolare, utilizza la maschera di linea (denominata: Lines_) per isolare i worm selezionati dalla popolazione di worm vista nella maschera binaria (denominata: Mask_). Va notato che le linee che si intersecano sull'immagine di panoramica (Figura 5A), sebbene non siano un problema per la generazione di montaggi, sono problematiche per la pipeline Worm_CP. Perché è così, è illustrato nella figura 5 D-E. Worm_CP utilizza la maschera di linea (Figura 5D) e non singole ROM per aiutare l'identificazione dei singoli worm. La linea intersecante tracciata seconda durante l'esecuzione di Worm-align è sovrapposta alla prima linea e quindi l'intensità lungo questa linea sarà quella di ROI2 anche nel bit in cui la linea 1 e 2 si sovrappongono. Di conseguenza, CellProfiler segmenterà line2 come un unico oggetto, ma line1 come due oggetti separati nel punto in cui si interseca con line2. Ciò significa che CellProfiler produrrà due (metà) maschere worm per il worm 'intersecting1' (Figura 5E). Il modo più semplice per escludere questi eventi dall'analisi finale (se necessario) è identificare il numero di worm intersecati dalla tabella QC (sottocartella dati) e rimuovere le misurazioni per questi worm dai file di output di CellProfiler. Si noti che ai worm non verrà necessariamente allocato lo stesso numero in FIJI e CellProfiler: per identificare il numero di worm FIJI nell'output di CellProfiler, esaminare i valori Intensity_Max_Intensity nel file di output 'Lines.csv'. Qualsiasi Intensity_Max_Intensity valore visualizzato nella tabella 'Linee.csv' più di una volta per immagine è un'indicazione del ROI di quella linea con conseguente maschera worm fratturata.

Una volta segmentate le singole maschere worm, Worm_CP misurare l'intensità di fluorescenza nei worm selezionati per tutti i canali registrati. Tutte le misurazioni vengono prese dai dati originali dell'immagine (non elaborati), anche se va notato che CellProfiler ridimensiona automaticamente l'intensità dei pixel su una scala 0-1. Ciò si ottiene dividendo il valore di intensità del pixel non elaborati per la massima intensità di pixel possibile per l'immagine. Nel caso di immagini a 8 bit questo valore è 255 e, nel caso di immagini a 16 bit, è 65535. I valori di intensità di CellProfiler devono quindi essere moltiplicati per il valore di intensità massimo possibile per recuperare valori equivalenti ai dati dell'immagine non elaborati. L Worm_CP'output è costituito da due file CSV, 'worm.csv' e 'Lines.csv' salvati nella cartella di output selezionata. Durante l'ispezione di questi file, è chiaro che CellProfiler registra un gran numero di parametri relativi all'intensità della fluorescenza. Di questi, il Intensity_IntegratedIntensity corrisponde alla fluorescenza totale per verme (cioè la somma dell'intensità di fluorescenza all'interno di tutti i pixel che interpretano la maschera di un singolo verme). Il parametro Intensity_MeanIntensity si riferisce all'intensità media di fluorescenza all'interno di un singolo worm (cioè l'intensità media di fluorescenza per pixel per tutti i pixel contenuti all'interno di un singolo worm). A causa dell'insorgenza occasionale di (piccoli) errori nella segmentazione delle maschere worm, si consiglia di utilizzare misurazioni MeanIntensity quando si confrontano le misurazioni della fluorescenza dei singoli worm tra due condizioni. Se si desidera sovstrare la fluorescenza di fondo da misurazioni quantificate, utilizzare i misuramenti denominati MeanIntensity_Threshold.

Abbiamo utilizzato la tubazione Worm_CP per quantificare l'intensità della fluorescenza da animali fissi che sono stati etichettati con un colorante fluorescente che incorpora nelle goccioline lipidiche (LD) (Figura 6). Al fine di convalidare la quantificazione della fluorescenza dalla pipeline Worm-align/Worm_CP, abbiamo quantificato l'intensità di fluorescenza nello stesso set di worm dal set di dati BODIPY dalla pipeline Worm-align/Worm_CP o dalla quantificazione manuale in FIJI/ImageJ. La quantificazione manuale è stata eseguita in FIJI/ImageJ girando ogni verme e una zona di sfondo scura in ogni immagine. L'intensità di fluorescenza è stata misurata nel gestore del ROI e il valore misurato per lo sfondo dell'immagine è stato sottratto dalla misurazione della fluorescenza del verme di ciascun worm, come^{descritto 17}. Abbiamo confrontato vermi N2 di tipo selvatico (WT) con mutanti dbl-1(nk3), che presentano una diminuzione del contenuto di goccioline lipidiche¹⁸. Come previsto, l'intensità della fluorescenza verde è significativamente diminuita tra i vermi WT e dbl-1(nk3) con entrambi i metodi(Figura 6A,B). Esempi di worm allineati possono essere osservati nella figura 6C,D. Il contenuto di goccioline lipidiche viene diminuito del 17% (valore p<0,0001, test t non accoppiato) tra WT e dbl-1(nk3) utilizzando la quantificazione manuale e del 14% (p-value=0,0051 t-test non accoppiato) utilizzando la pipeline Worm_CP. La diminuzione del contenuto di goccioline lipidiche qui osservata in dbl-1(nk3) con entrambi i metodi di quantificazione è conforme alla letteratura¹⁸. Ciò dimostra che la quantificazione delle immagini di fluorescenza acquisite con la pipeline Worm_CP CellProfiler è paragonabile alla quantificazione manuale.

Abbiamo anche utilizzato Worm_CP per quantificare la risposta agli shock termici nei vermi vivi che esprimono GFP sotto controllo del gene indutbile dello shock termico hsp-70(C12C8.1)⁹. La figura 7 mostra immagini rappresentative di C. elegans dal vivo che trasportano l'hsp-70 (C12C8.1)p::reporter GFP. In assenza di stress da calore, i vermi non inducono espressione GFP (Figura 7A,B). Tuttavia, quando i vermi sono esposti a un breve shock termico di 30 min a 34 °C, inducono espressione GFP(Figura 7C,D). I livelli di espressione della GFP con e senza shock termico sono quantificati nella figura 7E.

Nella sua forma attuale, Worm_CP tratta di un gasdotto molto semplice. Tuttavia, questo approccio consente una segmentazione più accurata delle singole maschere worm, che consente una quantificazione più accurata dell'intensità di fluorescenza in quei vermi selezionati dall'immagine. Per questo motivo, preferiamo questo approccio rispetto a una quantificazione approssimativa nelle FIJI, usando solo le maschere di linea. Inoltre, CellProfiler offre il vantaggio che ulteriori moduli di analisi possono essere facilmente inclusi nella pipeline. Ad esempio, per il set di dati che esamina il contenuto di goccioline lipidiche, l'inserimento di moduli aggiuntivi nella pipeline Worm_CP potrebbe indagare i numeri di goccioline lipidiche e l'intensità di fluorescenza delle singole goccioline in quei vermi selezionati nelle immagini di panoramica.

Figura 1: Generazione di una micropipetta bocca. Un capillare di vetro viene esteso nella fiamma di un bruciatore Bunsen (A), fino a quando non fornisce sottili estremità allungate (B). Il capillare in vetro esteso viene quindi collegato al pezzo dell'adattatore della micropipetta della bocca. (C) Schema di una micropipetta della bocca. La micropipetta della bocca è stata assemblata con un capillare di vetro collegato a un adattatore. Un tubo in silicone da 6 mm collega l'adattatore a un filtro siringa da 0,2 μm, utilizzato per la sicurezza. L'altra estremità del filtro è attaccata a un tubo di silicone da 3 mm che termina con una punta filtrante da 1 ml. Lo sperimentatore può aspirare tramite la punta del filtro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Aspirazione del liquido che circonda il pellet di verme, utilizzando la micropipetta della bocca. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Aggiunta del coverslip sui vermi che giace sul pad di agarosio Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Esempi di raddrizzamento del verme usando Worm-align sulle immagini di fluorescenza acquisite da animali vivi che trasportano il reporter trascrizionale fat-7p::GFP nell'intestino e un marcatore di co-iniezione rosso nella faringe (mio-2p::tdtomato). (A) Screenshot di un'immagine composita acquisita al microscopio fluorescente dei vermi vivi al giorno 3 dell'età adulta. L'immagine è stata aperta con Worm_align e le linee sono state disegnate lungo l'asse longitudinale dei vermi usando l'allineamento del verme. (B) Screenshot della stessa immagine di in (A), con esempi commentati di disegno buono e cattivo delle linee lungo l'asse dei worm, utilizzando l'allineamento del worm. (C) Esempi di linee disegnate sopra vermi che possono salire a worm allineati in modo errato. L'output di allineamento dei vermi selezionati in B. Le immagini sono state scattate con un obiettivo 20x su un microscopio widefield invertito (vedi tabella Materiali) con intensità di fluorescenza verde=1, esposizione =60 ms e intensità di fluorescenza rossa = 8, esposizione =60 ms. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Esempi di raddrizzamento dei vermi mediante l'allineamento dei worm sui worm intersecati. (A) Screenshot di un'immagine composita acquisita al microscopio fluorescente di vermi vivi al giorno 3 di animali in età adulta che trasportano il reporter trascrizionale fat-7p::GFP nell'intestino e un marcatore di co-iniezione rosso nella faringe (mio-2p::tdtomato). I vermi intersecante sono etichettati come "intersecting1" e "intersecting2", mentre i worm non sovrapposti sono etichettati come "good3" e "good4". (B) Montaggio creato da Worm-align che rappresenta i worm raddrizzare selezionati in (A). È evidente nel montaggio che i vermi 1 e 2 si intersecano sull'immagine originale (vermi etichettati come "intersecting1" e "intersecting2"). (C) Screenshot della tabella QC da Worm-align che consente di individuare i casi in cui i worm si intersecano. Lunghezza: lunghezza della linea ROI; numero verme: ordine in cui le linee sono state disegnate; l'ultima colonna indica se c'è una sovrapposizione tra il worm/linea di interesse e qualsiasi altro worm. In questo esempio, il worm nel primo raw (worm number1) si sovrappone al worm numero 2, come indicato dal numero "2" nell'ultima colonna. (D) Screenshot delle linee disegnate con l'allineamento del worm sui quattro worm selezionati in A. (E) Screenshot delle maschere generate da Worm-align sui quattro worm selezionati in A, che mostra come viene eseguito il rendering delle maschere per i due worm intersecati. In questo caso, due maschere invece di una sono ora corrispondenti al worm "intersecting1". Le immagini sono state scattate con un obiettivo 20x su un microscopio widefield invertito (vedi tabella Materiali) con intensità di fluorescenza verde=1, esposizione = 60ms e intensità di fluorescenza rossa = 8, esposizione = 60 ms.

Figura 6: La Worm_CP del gasdotto quantifica la fluorescenza con la precisione della quantificazione manuale. Confronto della quantificazione della fluorescenza dei vermi giovani adulti fissi e macchiati per il contenuto di goccioline lipidiche con il colorante fluorescente verde BODIPY, Worm_CP utilizzando una tubazione (A) o una quantificazione manuale (B). Il contenuto di goccioline lipidiche di WT e dbl-1 (nk3) è stato monitorato fissando e macchiando gli animali con BODIPY, che si intercala in acidi grassi di goccioline lipidiche (vedi protocollo A). I giovani animali adulti sono stati fissati con il 60% di isopropanolo e macchiati con BODIPY per 1h. Lo stesso insieme di animali è stato quantificato utilizzando il gasdotto Worm_CP (cfr. fase 7) o mediante quantificazione manuale secondo le procedure standard¹⁷. (A) Quantificazione della fluorescenza mediante Worm_CP oleodotto. WT: n=22 animali, fluorescenza media= 1,016 (UA) ± 0,206 SD; dbl-1(nk3):n=25 animali, fluorescenza media= 0,8714 (UA) ± 0,126 SD. Test t non accoppiato. (B) Quantificazione manuale della fluorescenza. WT: n=22 animali, fluorescenza media = 1,048 ± 0,153 SD; dbl-1(nk3):n=25 animali, fluorescenza media = 0,8632 ± 0,109 SD. Test t non accoppiato. (C, D) Esempio rappresentativo o output Worm-Align per gli animali WT (C) e dbl-1(nk3) (D) raddrizzare con la tubazione di allineamento dei worm. Le immagini sono state scattate con un obiettivo 20x su un microscopio widefield invertito (vedi tabella Materiali) con intensità di fluorescenza verde=2, exposure=60ms. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Esempio di quantificazione della fluorescenza e allineamento dei vermi vivi da immagini a fluorescenza di vermi vivi che trasportano il reporter trascrizionale hsp-70(C12C8.1)p::GFP a seguito di shock termico. (A) A seguito di una breve scossa di calore (30 minuti a 34 °C), i vermi giovani adulti sono stati recuperati alla loro temperatura di coltivazione (25 °C) e montati, quindi sono stati chiamati 3,5 ore dopo lo shock termico. Circa 30 vermi sono stati quantificati in seguito a shock termico utilizzando la tubazione di allineamento del verme. (A-B) Esempi di vermi allineati che non sono stati esposti a shock termico. (C-D) Esempi di worm scioccati dal calore che trasportano hsp-70(C12C8.1)p::GFP usando Worm-align. (E) mostra l'intensità media GFP (parametro Worm_CP: MeanIntensity_Threshold) dei vermi giovani adulti WT coltivati, senza shock termico o all'esposizione a shock termico (34 °C per 30 minuti). Le immagini sono state scattate con un obiettivo 20x su un microscopio widefield invertito (vedi tabella Materiali) con intensità di fluorescenza verde=1, esposizione=60ms; no HS: n=12, HS: n=32. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare 1: Posizione nelle FIGI in cui è possibile trovare la macro di allineamento dei worm, una volta installata. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 2: Selezione della cartella contenente tutte le immagini scattate con le stesse impostazioni. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 3: Generazione di 4 sottocartelle nella cartella di output in FIJI. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 4: disegno di una linea sulla larghezza del worm e delle impostazioni del canale per il montaggio. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 5: Anteprima dell'immagine con le impostazioni applicate. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 6: Disegno di una linea lungo l'asse longitudinale dei vermi di interesse da includere nel montaggio e/o nella quantificazione. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 7: Montaggio dei worm selezionati nella cartella di output, in cartella "allineata". Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 8: Cancellazione delle immagini precedenti dall'analisi precedente in Cell Profiler. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 9: importazione di metadati in CellProfiler dalla cartella di output di worm-align selezionando la sottocartella Impostazioni.csv impostazioni. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 10: la pipeline di CellProfiler Worm_CP.cpproj utilizza le immagini Lines_ per singolo worm selezionati (A) e produce maschere worm singole dei worm di interesse (C). Il gasdotto misura anche l'intensità di fondo (B). Outlook di tutti i parametri misurati dalla pipeline Worm_CP.ccproj esportati in un file CSV (D). Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 11: selezione dei file di output nel "ExportToSpreadsheet nella pipeline Worm_CP.cpproj. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

Worm-align è una pipeline di elaborazione delle immagini basata su FIJI che genera prontamente montaggi di worm selezionati dall'utente, in cui i worm vengono raddrizzata e allineati per aiutare il confronto visivo, la classificazione e la rappresentazione. Sebbene questa funzionalità sia offerta anche da alcuni strumenti esistenti, in particolare il modulo WormToolbox in CellProfiler⁷, Worm-align richiede relativamente poca esperienza di analisi delle immagini precedenti: gli utenti devono solo rintracciare quei worm che vorrebbero selezionare per il montaggio (e l'analisi). Sebbene rintracciare i worm sui dati dell'immagine non elaborata sia un processo semplice, in particolare quando è disponibile un computer touch-screen o un tablet, è fondamentale che le linee siano disegnate correttamente lungo l'asse longitudinale dei worm. Le linee incomplete, che seguono solo una parte del worm, si tradurranno in worm parziali nel montaggio (ad esempio, worm mancanti teste di estremità della coda) e maschere di segmentazione parziale durante l'analisi di CellProfiler. Inoltre, se le linee di due singoli vermi si incrociano, i vermi non verranno elaborati correttamente nel montaggio di allineamento del verme e per la quantificazione della fluorescenza. Per il controllo qualità un'immagine sovrapposta delle selezioni di riga sull'immagine originale viene salvata nella cartella dati, insieme a una tabella QC. Da questi, le linee problematiche che porteranno a vermi segmentati in modo errato possono essere facilmente identificate ed escluse dal montaggio e / o dall'analisi successiva.

Sebbene l'input diretto dello sperimentatore nella selezione dei worm sembri forse un po 'dispendioso in termini di tempo, presenta un chiaro vantaggio del flusso di lavoro rispetto ad altri in esperimenti in cui worm provenienti da diversi stadi di sviluppo sono presenti nella stessa immagine: i worm possono essere selezionati durante la "fase di tracciamento", delineando solo quei worm che si trovano nella giusta fase di sviluppo. In alternativa, i worm possono essere filtrati utilizzando l'output di Worm_CP in base alla lunghezza della linea di tracciatura o all'area della maschera di segmentazione, entrambi indicatori affidabili della lunghezza/dimensione dei worm. Probabilmente, gli algoritmi di apprendimento automatico possono avere difficoltà a riconoscere i worm da diverse fasi di sviluppo, poiché le loro dimensioni e il loro aspetto nelle immagini DIC sono così diversi.

L'output di Worm-align può essere utilizzato per la successiva quantificazione dell'intensità di fluorescenza in singoli worm, sia direttamente nelle FIJI, sia in altre piattaforme software di analisi delle immagini. Lo abbiamo dimostrato importando l'output di worm-align in una semplice pipeline cellprofiler (Worm_CP), che consente la quantificazione dell'intensità di fluorescenza multicanale nei singoli worm selezionati durante l'esecuzione della pipeline di allineamento worm. Abbiamo scelto questo approccio grazie alla flessibilità del software CellProfiler: è semplice incorporare moduli aggiuntivi nella pipeline per analizzare funzionalità aggiuntive nei singoli worm (ad esempio misurando le dimensioni delle goccioline lipidiche o granuli di stress, nuclei, mitocondri). Inoltre, le singole maschere worm potrebbero potenzialmente essere utilizzate per addestrare un nuovo modello per WormToolbox⁷.

I principali vantaggi di questo metodo sono che è veloce e richiede un semplice set-up di montaggio worm. Questo metodo è più veloce in quanto non richiede di dedicare tempo all'apprendimento del software, né all'esecuzione di set di training tramite un algoritmo^{di computer 7}. Inoltre, questo metodo funziona con vermi vivi o fissi semplicemente montati su normali cuscinetti di agarosio. Non è necessario utilizzare camere microfluidiche complesse, come sviluppato in altri metodi^5,6.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Agarosio	MeLford Biolaboratories Ltd	MB1200
Tubo aspiratore	Sigma-Aldrich	A5177	per creare micro-pipette per bocca (vedi fase del protocollo)
Bicchiere
BODIPY 493/593	Invitrogen	D3922	soluzione madre preparata in DMSO a 1mg/mL
Centrifuga	MSE MISTRAL 1000
Pallone
Copri Slip	VWR	631-0120
Filtro 0,2 &; m per Siringa	Sartrius	16534-K	Filtro, per creare micro-pipetta per bocca (vedi fase del protocollo)
Isopropanolo
Levamisolo cloridrato	Sigma-Aldrich	BP212	3mM soluzione preparata sciogliendo levamisolo in
M9 Azoto liquido Azoto			liquido facility
Puntale a bassa ritenzione 1000µ L	Starlab	S1182-1830
Metanolo	VWR prodotti chimici	20847.307
Vetrini per microscopio, MENZEL GLASSER	Thermo Scientific	BS7011/2
Microscopio	Nikon		Eclipse Ti
Forno a microonde	Delongi
M9			preparato in laboratorio secondo15
		NGM da >9 cm	preparate in laboratorio secondo15
PBS preparate			in laboratorio
Protein LoBind Tube 2ml	Eppendorf	22431102
Triton	SIGMA	T9284-500ML
Ring Caps	SIGMA-ALDRICH	Z611247-250EA	tubi micro-capillari in vetro per creare la bocca micro-pipetta (vedi fase del protocollo)
Rotator	Stuart Scientific
Tubina in silicone traslucida	Laboratorio scientifico Fornitori	TSR0600200P	parete 6,0 mm x 2,0 mm - per creare micro-pipette per bocca (vedi fase del protocollo)
Acqua H2O			MilliQ sterilizzata in autoclave in laboratorio
10µ Punte a L	Starlab	S1120-3810
200µ Punte a L	Starlab	S1120-8810
1000µ L Tips	Starlab	S1122-1830
Provetta da centrifuga da 15 ml	CORNING	430791
Vecta Shield	VECTOR	94010	supporto di montaggio antisbiadimento (H-1000) senza DAPI