Presentato qui è un saggio di fluorescenza sensibile per monitorare l'attività dell'apolipoproteina N-aciltransferasi utilizzando il peptide diacilglicerile e gli alchino-fosfolipidi come substrati con click-chemistry.
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Articolo metodologico
Saggio fluorometrico basato sulla chimica dei clic per l'apolipoproteina N-aciltransferasi dalla caratterizzazione enzimatica allo screening ad alta produttività
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le lipoproteine dei proteobatteri sono modificate post-traduzionalmente dagli acidi grassi derivati dai fosfolipidi di membrana mediante l'azione di tre enzimi integrali di membrana, con conseguente proteine triacilate. Il primo passo nella via di modificazione della lipoproteina comporta il trasferimento di un gruppo diacilglicerile dal fosfatidilglicerolo alla prolipoproteina, con conseguente diacilgliceril prolipoproteina. Nella seconda fase, il peptide segnale della prolipoproteina viene scisso, formando un'apolipoproteina, che a sua volta viene modificata da un terzo acido grasso derivato da un fosfolipide. Quest'ultimo passaggio è catalizzato dall'apolipoproteina N-aciltransferasi (Lnt). La via di modificazione delle lipoproteine è essenziale nella maggior parte dei γ-proteobatteri, rendendola un potenziale bersaglio per lo sviluppo di nuovi agenti antibatterici. Qui è descritto un test sensibile per Lnt che è compatibile con lo screening ad alto rendimento di piccole molecole inibitorie. L'enzima e i substrati sono molecole incorporate nella membrana; Pertanto, lo sviluppo di un test in vitro non è semplice. Ciò include la purificazione dell'enzima attivo in presenza di detergente, la disponibilità di alchino-fosfolipidi e substrati del peptide diacilglicerile e le condizioni di reazione nelle micelle miste. Inoltre, al fine di utilizzare il test di attività in una configurazione di screening ad alta produttività (HTS), la lettura diretta del prodotto di reazione è preferibile rispetto alle reazioni enzimatiche accoppiate. In questo saggio enzimatico fluorometrico, il prodotto peptidico alchino-triacilato viene reso fluorescente attraverso una reazione click-chimica e rilevato in un formato multipozzetto. Questo metodo è applicabile ad altre aciltransferasi che utilizzano substrati contenenti acidi grassi, inclusi fosfolipidi e acil-CoA.
Introduzione
Le lipoproteine batteriche sono caratterizzate da acidi grassi legati covalentemente ai loro amino-termini attraverso i quali sono ancorati nelle membrane 1,2. La parte matura della proteina è molto diversificata nella struttura e nella funzione, spiegando così il ruolo delle lipoproteine in vari processi biologici nell'involucro cellulare batterico.
Le lipoproteine sono modificate dagli acidi grassi derivati dai fosfolipidi dopo l'inserimento nella membrana citoplasmatica. Le prolipoproteine contengono un motivo distintivo, il lipobox, che contiene un residuo di cisteina invariante....
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Protocollo
1. Preparazione di enzimi e substrati
- Purificazione dell'enzima
- Produrre e purificare l'enzima Lnt dalle membrane solubilizzate detergenti come descritto in precedenza 4,8. In breve, indurre l'espressione del gene lnt-streptococco, che codifica per Lnt con un tag C-terminale Streptococco, a OD 600 di 0,6 con tetraciclina anidra (200 ng/mL) a 37 °C per 16 ore.
- Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 4.000 x g per 10 minuti e scartare il surnatante.
- Risospendere il pellet cellulare nel tampone WA (20 mM Tris-HCl pH 8....
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Risultati
Nella reazione Lnt l'acido grasso sn-1 dai fosfolipidi viene trasferito su un peptide diacilglicerile, risultando inpeptide triacilato 8 maturo. Il test Lnt in vitro qui descritto è progettato per utilizzare fosfolipidi contenenti un acido grasso alchino (alchino-POPE) e FSL-1-biotina come substrati, con conseguente formazione di alchino-FSL-1-biotina. Dopo una reazione chimica a scatto con azido-FAM, questo prodotto dovrebbe essere marcato con fluorescenza e rilevato mediante spettrometr.......
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Discussione
Il protocollo per il saggio Lnt qui descritto, basato sulla rilevazione a fluorescenza del prodotto triacilato, è sensibile e riproducibile. Il legame specifico ed efficiente della biotina alla streptavidina è un elemento chiave nel test. Anche il substrato alchino-POPE rimasto dopo il completamento della reazione Lnt è marcato in modo fluorescente con FAM, ma viene rimosso in modo efficiente dopo il legame sulle piastre di streptavidina mediante più fasi di lavaggio. Inoltre, l'aggiunta di DMSO non influisce sull'attivi.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo Fabrice Agou e Alix Boucharlat della Chemogenomic and Biological Screening Platform, Center for Technological Resources and Research (C2RT) dell'Institut Pasteur Paris per gli utili suggerimenti sul protocollo, tutti i membri dell'Unità BGPB per il supporto e le discussioni scientifiche e Simon Legood per la lettura critica del manoscritto. Il lavoro è stato finanziato dalle Global Care Initiatives dell'Institute Carnot Infectious diseases e dell'Institute Carnot Microbes and Health (15 CARN 0017-01 e 16 CARN 0023-01).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Ä kta Purificatore Sistema FPLC | GE Healthcare | NA | Purezza: NA Purificazione Lnt |
| alchino-POPE | Avanti Lipidi polari | 900414P | Purezza: >99% substrato Lnt |
| Azido-FAM | Lumiprobe | A4130 | Purezza: 100% (puro) Biofotometro a clic reagente |
| Plus | Eppendorf | N/A | Purezza: NA OD 600 nm |
| BioTek ELX 405 Seleziona la lavatrice per piastre | BioTek | N° serie 115800, n° materiale 405 Seleziona | Purezza: NA Fasi di lavaggio |
| biotina-fluoresceina | Sigma | 53608 | Purezza: ≥ 90% Controllo della fluorescenza |
| Solfato di rame (II) pentaidrato | Sigma | C3036 | Purezza: ≥ 98% Fare clic sul reagente |
| DDM | Anatrace | D310A | Purezza: ≥ 99% β+α; < 15% α Detergente per purificazione Lnt |
| Dimetilsolfossido (DMSO) | Invitrogen | D12435 | Purezza: anidro Solbilizzazione Fare clic sul reagente |
| Pipetta elettronica Voyager 8 canali 0,5-12,5 uL | INTEGRA | 4721 | Purezza: NA Manipolazione dei reagenti |
| Cella a pressione francese | N/A | N/A | Purezza: NA Disgregazione cellulare |
| FSL-1-biotina | Microraccolte EMC | L7030 | Purezza: NA Substrato Lnt |
| Greiner Bio-One Micropiastra in polistirene CELLSTAR standard a 384 pozzetti | Greiner | 781091 | Purezza: NA Nero con fondo trasparente (lettura verso l'alto o verso il basso) |
| Greiner Bio-One Piastra in polistirene sterile a 96 pozzetti, alto legame | Greiner | 655097 | Purezza: NA Nero con fondo trasparente (lettura verso l'alto o verso il basso) |
| Lettore di micropiastre Infinite M1000 pro | Tecan | N/A | Purezza: NA Rilevamento della fluorescenza |
| MTSES (sodio (2-sulfonatoetil)metanetiosolfonato) | Anatrace | S110MT | Purezza: ~100% Inibitore specifico del tiolo |
| Fogli di tenuta adesivi otticamente trasparenti | Thermo Scientific | AB-1170 | Purezza: NA Foglio per sigillare la piastra multipozzetto |
| Sephacryl S400 HR 16/60 gel colonna di filtrazione | GE Healthcare | GE28-9356-04 | Purezza: NA Purificazione Lnt |
| StreptoTactina Sefarosio 50 % | IBA Biotecnologia | 2-1201-010 | Purezza: NA Purificazione Lnt |
| streptavidina | Sigma | S4762-1MG | Purezza: ≥ 13 unità/mg protein TBTA legante la biotina |
| (tris[(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil]ammina | Sigma | 678937 | Purezza: 97% Fare clic sul reagente |
| TCEP (tris(2-carbossietil)fosfina cloridrato | Sigma | 75259 | Purezza: ≥ 98% Reagente a scatto |
| TECAN Infinite F500 | Tecan | N/A | Purezza: NA Rivelazione di fluorescenza |
| TECAN Infinite M1000 pro | Tecan | N/ | A Purezza: NA Rivelazione di fluorescenza |
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382000015 | Purezza: NA Coperchio riscaldato |
| Triton X-100 | Sigma | 93443 | Purezza: 10% in H2O Tampone di reazione Lnt |
| Ultra centrifuga | Beckman LC | N/A | Purezza: NA Frazionamento cellulare |
Riferimenti
- Buddelmeijer, N. The molecular mechanism of bacterial lipoprotein modification--how, when and why. FEMS Microbiology Reviews. 39 (2), 246-261 (2015).
- Kovacs-Simon, A., Titball, R. W., Michell, S. L. Lipoproteins of bacterial pathogens. Infections and Immunity.
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Ristampe e permessi
