Articolo metodologico

Un sistema gnotobiotico per studiare l'assemblaggio del microbioma nella Phyllosphere e nella fermentazione vegetale

DOI:

10.3791/61149

⸱

3 giugno 2020

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Tufts University

In questo articolo

Sommario

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È stato sviluppato un metodo per coltivare cavoli Napa privi di germi che consente ai ricercatori di valutare come singole specie microbiche o comunità microbiche multispecie interagiscono sulle superfici delle foglie di cavolo. Viene inoltre presentato un estratto vegetale sterile che può essere utilizzato per misurare i cambiamenti nella composizione della comunità durante la fermentazione vegetale.

Abstract

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La fillosfera, la parte sotterranea della pianta che può essere colonizzata dai microbi, è un utile sistema modello per identificare i processi di assemblaggio della comunità microbica. Questo protocollo delinea un sistema per studiare le dinamiche della comunità microbica nella filosfera delle piante di cavolo Napa. Descrive come coltivare piante prive di germi in provette con un substrato di brodo di argilla e nutrienti. L'inoculazione di piante prive di germi con colture microbiche specifiche offre l'opportunità di misurare la crescita microbica e le dinamiche della comunità nella fillosfera. Attraverso l'uso di estratto vegetale sterile prodotto da cavoli si sposta nelle comunità microbiche che si verificano durante la fermentazione può anche essere valutato. Questo sistema è relativamente semplice ed economico da configurare in laboratorio e può essere utilizzato per affrontare le principali questioni ecologiche nell'assemblaggio della comunità microbica. Fornisce inoltre l'opportunità di capire in che modo la composizione della comunità della fillosfera può influire sulla diversità microbica e sulla qualità delle fermentazioni vegetali. Questo approccio per lo sviluppo di comunità di filosfera gnotobiotica potrebbe essere applicato ad altre specie vegetali selvatiche e agricole.

Introduzione

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La diversità microbica della fillosfera svolge un ruolo importante nel mantenimento della salute delle piante e può anche influenzare la capacità delle piante di resistere allo stress ambientale1,2,3,4,5. A sua volta, la salute delle colture influisce direttamente sulla sicurezza alimentare e sulla qualità6,7. Le piante svolgono un ruolo nel funzionamento dell'ecosistema e i microbiomi associati influenzano entrambi la capacità delle piante di svolg....

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Protocollo

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1. Cavoli senza germi in crescita

  1. Preparazione di attrezzature per la crescita di cavoli senza germi
    1. Pulizia dell'argilla calcificata per rimuovere le particelle di polvere fine
      1. Risciacquare l'argilla calcinata (Tabella dei materiali) almeno 3x con acqua del rubinetto; drenare l'acqua.
        AVVISO: L'argilla calciata produce polveri molto sottili e si consiglia di indossare una maschera protettiva (Tabella dei materiali) durante il lavaggio.
      2. Stendere l'argilla calciata come uno strato sottile (4 cm) in un vassoio autoclave e autoclave su un ciclo asciutto (121 gradi centigradi per 20 min e 20 min te....

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Risultati

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Tassi di crescita dei cavoli di Napa
Il metodo di sterilizzazione dei semi è stato testato con diversi cavoli Napa (B. rapa var pekinese; Figura supplementare 1) da un certo numero di fornitori diversi e tutti sono cresciuti costantemente con tassi di crescita simili. Tuttavia, testare i metodi con diverse specie di Brassica (B. rapa: Turnip Purple Top; B. oleracea: Cairo Hybrid, Tropic Giant Hybrid; B. campestri.......

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Discussione

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Le piante di cavolo Napa prive di germi sono state utilizzate per studiare la limitazione della dispersione dei batteri dell'acido lattico nella fillosfera del cavolo di Napa17. I cavoli Napa privi di germi possono anche essere utilizzati per testare la crescita individuale o a coppie nella fillosfera (Figura 1). I metodi per la produzione di estratto vegetale sterile sono stati testati per tre diverse varietà di cavolo: rosso, verde e Napa. Ognuna di queste SVI agisc.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione USDA-NIFA: 2017-67013-26520. Tracy Debenport e Claire Fogan hanno fornito supporto tecnico e Ruby Ye e Casey Cosetta hanno fornito utili commenti sulle prime versioni di questo manoscritto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Provette per microcentrifuga da 1,5 mLVWR20170-650
Provette coniche da 15 mLVassoio vassoio a 7 vie Falcon352096
Sigma MagentaT8654
Bottiglia di vetro Boston rotonda ambrata GPS712OZSPPK12BROrdinato il Amazon.com da vari fornitori
Filtri per caffè a cestelloSe ti interessa(carta non sbiancata) Acquistato da Wholefoods
Bleach (senza mercurio)borosilicato Austin50-010-45
VWR47729-586
Argilla calcinataTurfaceMVPOrdinato il Amazon.com da Root Naturally 6 Quart Bags. Dimensione delle particelle circa 3-5 mm
Frullatore CuisinartCuisinart CuisinartMini-Prep Plus Robot da cucina, forbici da dissezione a 3 tazze
7-389-AProdotti educativi americaniordinati su Amazon.com
EtanoloVWR89125-172
PinzeAven18434Ordinato su Amazon.com
GlycerolFisher Scientific56-81-5
KleenGuard M10Kimberley-Clark64240
Grande contenitore in plasticaRubbermaidOrdinato su Amazon.com
Scaffali luminosiGardner's Supply39-357lampadine fluorescenti T5 a spettro completo
Magenta tm Tappi a 2 vieMillipore SigmaC1934
Man, Rogosa e SharpeFisher ScientificDF0881-17-5Questo terreno è per brodo e 15 g di agar vengono aggiunti per fare piastre
Micro sonda pHThermo Scientific8220BNWP
MicropestleCarolina215828Chiamato anche Pellet Pestle
MS brodo nutrienteMillipore SigmaM5519Murashige e Skoog Basal Medium
NaClSigma AldrichS9888
Semi di cavolo NapaJohnny's Select Seeds2814GB. rapa var pekinensis (Bilko)
Petri piatto 100 mm x 15 mmFisherFB0875712Utilizzato per realizzare piastre di agar
Soluzione salina tampone fosfatoFisher Scientific50-842-941Teknova
Scatola per colture di tessuti vegetaliSigmaMagenta GA-7
Pipette sierologicheVWR89130-900
Tassello sterilePuritan10805-018Autoclave prima dell'uso per sterilizzare
Sterilizzante 0,2 &; micro; m filtroNalgene974103
Triptico agar di soiaFisherScientific DF0370-17-3Questo terreno è per brodo e 15 g di agar vengono aggiunti per fare piastre
Punte per pipette a orifizio largoRainin17007102
Lievito, peptone e destrosioFisher ScientificDF0428-17-5Questo terreno è adatto, ma può anche essere realizzato utilizzando lievito, peptone e destrosio, aggiungere 15 g di agar quando si preparano i piatti
Tubi in vetro

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Grady, K. L., Sorensen, J. W., Stopnisek, N., Guittar, J., Shade, A. Assembly and seasonality of core phyllosphere microbiota on perennial biofuel crops. Nature Communications. 10 (1), 4135(2019).
  2. Pii, Y., et al.

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Microbioma della fillosferaassemblaggio della comunit microbicapiante germ freeestratto vegetale sterilesterilizzazione dei semisubstrato di argilla calcareaterreno liquido MSprotocollo di inoculazioneanalisi della fermentazione

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