Introduzione di mutazioni puntiformi nelle cellule staminali pluripotenti umane utilizzando l'editing del genoma senza soluzione di continuità

Summary

Qui, descriviamo un metodo dettagliato per l'editing genetico senza soluzione di continuità nelle cellule staminali pluripotenti umane utilizzando un plasmide donatore basato su piggyBac e il mutante nickase Cas9. Due mutazioni puntiformi sono state introdotte nell'esone 8 del locus del fattore nucleare 4 alfa (HNF4α) degli epatociti nelle cellule staminali embrionali umane (hESC).

Abstract

Le endonucleasi progettate su misura, come le Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9 guidate dall'RNA, consentono un efficiente editing del genoma nelle cellule di mammifero. Qui descriviamo procedure dettagliate per modificare senza soluzione di continuità il genoma del locus del fattore nucleare 4 alfa (HNF4α) degli epatociti come esempio nelle cellule staminali pluripotenti umane. Combinando un plasmide donatore basato su piggyBac e il mutante nickase CRISPR-Cas9 in una selezione genetica in due fasi, dimostriamo il targeting corretto ed efficiente del locus HNF4α.

Introduction

Le cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs) rappresentano una fonte illimitata di cellule somatiche per la ricerca o la clinica¹. Il targeting genico nelle hPSC offre un potente metodo per studiare la funzione genica durante le specifiche cellulari e per comprendere i meccanismi della malattia. Sebbene esistano metodi efficienti di modifica del genoma, la modifica dei geni nelle hPSC rimane tecnicamente impegnativa. Il targeting genico standard mediante ricombinazione omologa nelle hPSC avviene a bassa frequenza o addirittura non è rilevabile in alcuni geni 2, e il targeting genico stimolato dal DNA a doppia rottura del filamento (DSB) (chiamato editing genetico) è quindi necessario in queste cellule ^2,3. Inoltre, la trasfezione delle hPSC e il successivo clonaggio a singola cellula non sono molto efficienti, anche se l'apoptosi associata a singole cellule può essere ridotta attraverso l'uso dell'inibitore della protein chinasi Rho-associata (ROCK)⁴. Infine, anche le potenziali mutazioni on-target e off-target sul gene di interesse possono essere problematiche. Quindi, un protocollo affidabile è essenziale per apportare cambiamenti genetici su misura nelle hPSC.

La tecnologia CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) e CRISPR associated protein 9 (Cas9) guidata da RNA è ora uno strumento consolidato nell'editing genetico. L'RNA CRISPR trascritto (crRNA) e un RNA transattivante (tracrRNA) formano l'RNA guida singola (sgRNA), che si complessano con la proteina Cas9 permettendo la scissione specifica del gene⁵. Il sistema CRISPR / Cas9 è programmabile, modificando una sequenza guida di 20 bp dello sgRNA, il che significa che quasi tutti i locus che soddisfano il requisito del motivo adiacente al protospacer (PAM) possono essere modificati. Tuttavia, il tipo selvatico Cas9 può tollerare alcune discrepanze tra la sua sequenza guida e un bersaglio del DNA, che potrebbero causare effetti indesiderati fuori bersaglio. Per migliorare la sua specificità, è stato sviluppato un mutante nickase (Cas9n). Un Cas9n contenente una mutazione D10A o N863A possiede solo un dominio nucleasi funzionale e di conseguenza può intaccare solo il DNA su un filamento. Una coppia di Cas9n opportunamente distanziati e orientati può indurre efficacemente DNA DSB e gli effetti off-target sono drasticamente ridotti⁶. Per garantire una modifica efficiente di Cas9n, è stato dimostrato che due Cas9n-sgRNA dovrebbero idealmente essere posizionati con un offset da -4 a 20 bp e creare sempre una sporgenza di 5'⁶.

Cas9(n)-sgRNA indotto DSB può essere utilizzato per l'editing del genoma in hPSCs ^7,8. Può creare knockout genico tramite riparazione di giunzione finale non omologa o introdurre modificazioni geniche attraverso la riparazione diretta dall'omologia (HDR) se è presente un modello di DNA del donatore. Il protocollo qui descritto utilizza un plasmide donatore basato su trasposone piggyBac (o vettore targeting) per HDR, in cui un marcatore di resistenza ai farmaci è affiancato dalle ripetizioni invertite del trasposone. Il vantaggio di questo approccio include uno screening efficiente e un editing genetico senza soluzione di continuità, come dimostrato per la prima volta da Yusa et ^al.9,10. La cassetta di selezione dei farmaci consente l'arricchimento delle cellule con il vettore integrato, che vengono successivamente schermate mediante PCR a giunzione per identificare quelle derivate dall'HDR. Inoltre, la cassetta di selezione del farmaco può essere posizionata per sostituire le sequenze target per la scissione di Cas9 (n), in modo che non si verifichino ulteriori rotture del DNA dopo l'HDR, eliminando così le mutazioni target "on" derivanti dalla ri-scissione di Cas9 (n). Inoltre, sfruttando la precisa escissione catalizzata dalla trasposasi piggyBac, il marcatore di selezione viene poi asportato dal genoma senza lasciare cicatrici. Solo la sequenza TTAA endogena originale per l'inserimento di piggyBac rimane dopo la rimozione del marcatore di selezione del farmaco⁹. Anche se i siti TTAA devono essere creati introducendo sostituzioni, le possibilità di perturbare gli elementi normativi sono ridotte rispetto ad altri metodi¹⁰.

Qui descriviamo procedure dettagliate per l'implementazione dell'editing del genoma senza soluzione di continuità nelle hPSC. Combinando un plasmide donatore basato su piggyBac e il mutante nickase CRISPR-Cas9 in una selezione genetica in due fasi, abbiamo introdotto due mutazioni puntiformi predeterminate nel gene¹¹ del fattore nucleare 4 alfa (HNF4α) degli epatociti. Questo approccio è affidabile ed efficiente e ha permesso analisi approfondite degli importanti ruoli svolti da HNF4α nella specifica di endodermi ed epatociti da cellule staminali pluripotenti umane¹¹.

Protocol

1. Progettazione e costruzione di plasmidi di espressione CRISPR/Cas9n-sgRNA

1. Cerca sequenze guida a 20 bp direttamente a monte di qualsiasi 5'-NGG vicino al sito da modificare. Una coppia di RNA a guida singola (sgRNA) è necessaria quando viene utilizzata la nickasi Cas9 (Cas9n) di Streptococcus pyogenes . La coppia di sgRNA deve essere in grado di generare sporgenze 5' al taglio con^{un offset 6} da -4 a 20 bp.
2. Ordina gli oligo necessari e il vettore pSpCas9n-2A-puro.
3. Clonare sgRNA nel vettore pSpCas9n per la co-espressione con Cas9n seguendo il protocollo pubblicato¹².

2. Progettare e costruire un vettore di targeting basato su piggyBac

1. Scarica la sequenza genica bersaglio e cerca un sito TTAA vicino al sito da modificare.
   NOTA: la distanza tra il sito TTAA e il sito da modificare deve essere la più piccola possibile. Se all'interno della sequenza codificante e nessun sito TTAA è presente entro una distanza di 100 bp, è necessario introdurne uno facendo sostituzioni nucleotidiche sinonime.
2. Progettare bracci di omologia (HA) e incorporare le mutazioni puntiformi desiderate negli HA. La lunghezza ottimale degli HA dovrebbe essere di circa 500 - 1200 bp.
   NOTA: Si raccomanda di introdurre sostituzioni nucleotidiche sinonimi per mutare la sequenza PAM al fine di evitare potenziali ri-scissioni di Cas9n.
3. Costruire il vettore di targeting finale seguendo un protocollo stabilito¹⁰.
   NOTA: Nel vettore di targeting qui utilizzato, una cassetta di selezione puro-deltaTK guidata dal promotore PGK è affiancata da ripetizioni invertite di trasposone.

3. Editing genetico di cellule staminali pluripotenti umane

1. Mantenere le cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) in un incubatore umidificato a 37 °C e al 5% di CO₂ su superfici rivestite di laminina 521 ricombinante (5 μg/ml) in mTeSR1 mezzo¹³. Le cellule dovrebbero raggiungere il 70-85% di confluenza dopo 72 ore dopo un rapporto di divisione 1:3.
   NOTA: Se presente, rimuovere spontaneamente le cellule differenziate prima del cambio giornaliero del mezzo aspirandole delicatamente.
2. Il giorno della trasfezione, rivestire un pozzetto sufficiente di una piastra da 24 pozzetti con 300 μL della soluzione di laminina 521 (5 μg/ml) a 37 °C per almeno 2 ore.
3. Rimuovere delicatamente la soluzione di rivestimento e aggiungere 300 μL di terreno mTeSR1 fresco integrato con inibitore ROCK 10 μM a ciascun pozzetto, quindi rimettere la piastra nell'incubatore per ricevere le cellule.
   NOTA: Non lasciare asciugare le piastre in nessun punto quando la soluzione di rivestimento di laminina viene rimossa.
4. Spostare le hPSC di riserva dall'incubatore, rimuovere il mezzo esaurito e quindi lavare le cellule una volta utilizzando 1 ml di 1x DPBS sterile.
5. Aggiungere 1 mL di reagente di dissociazione cellulare delicato a ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e incubare a 37 °C per 6-8 minuti per dissociare le cellule.
   NOTA: Picchiettare delicatamente la piastra e verificare se le cellule possono staccarsi facilmente per decidere se la digestione è abbastanza lunga.
6. Pipettare delicatamente su e giù utilizzando una punta P1000 per sollevare tutti gli hPSC.
7. Terminare la dissociazione aggiungendo 2 mL di terreno mTeSR1 fresco integrato con inibitore ROCK 10 μM (Y-27632) alla sospensione cellulare.
8. Mescolare bene e trasferire la sospensione monocellulare in un tubo da 50 mL e centrifugare a 200 x g per 3 minuti a temperatura ambiente.
9. Rimuovere il surnatante e risospendere bene le cellule in 2 mL di terreno mTeSR1 fresco integrato con inibitore ROCK da 10 μM.
10. Contare le cellule vitali usando un emocitometro. Utilizzare Trypan Blue per colorare ed escludere le cellule morte.
11. Trasferire 8 x 10 5 a 1 x 10⁶ cellule vive in una provetta da^1,5 mL per ogni reazione di nucleofezione e centrifugare a 200 x g per 3 minuti. Quindi aspirare con cura il surnatante.
12. Mescolare 3 μg dei plasmidi di espressione Cas9n-sgRNA accoppiati e 5 μg di plasmide vettore bersaglio in 100 μL di soluzione/supplemento di nucleofezione mista dal kit di nucleofezione delle cellule staminali umane. Utilizzare il plasmide di controllo GFP dal kit e preparare anche una miscela di plasmidi di controllo GFP.
    NOTA: È importante effettuare una maxi-preparazione di tutti i plasmidi per ridurre la contaminazione da endotossine prima della nucleofezione. La concentrazione dei plasmidi deve essere di circa 1 μg/μL.
13. Utilizzare la miscela di DNA (volume ~111 μL) per risospendere le cellule preparate e trasferirle in una cuvetta di elettroporazione (fornita con il kit di nucleofezione), evitando eventuali bolle.
14. Elettroporare le cellule utilizzando il dispositivo di nucleofezione selezionando le condizioni ottimizzate per le cellule staminali pluripotenti umane.
    NOTA: Se si utilizza per la prima volta il kit di nucleofezione per cellule staminali pluripotenti umane, è necessario testare il programma di elettroporazione e scegliere quello più efficiente.
15. Aggiungere immediatamente 500 μL di terreno fresco e caldo a 37 °C mTeSR1 integrato con inibitore ROCK 10 μM alle cellule elettroporate. Trasferire la miscela in 2 pozzetti di una piastra da 24 pozzetti preparata dai punti 3.2 e 3.3.
16. Rimettere rapidamente la piastra nell'incubatore a 37 °C/5% di CO₂ e lasciare che le cellule si riprendano completamente.
17. 12-16 ore dopo, cambiare il mezzo di manutenzione della cella. Se le cellule hanno stabilito un contatto cellula-cellula, ritirare l'inibitore ROCK, in caso contrario, continuare a integrare il terreno con l'inibitore.
18. Tra 24-48 ore, controllare l'efficienza della nucleofezione esaminando l'espressione di GFP nelle cellule di controllo. Le cellule GFP positive dovrebbero essere almeno il 30%.
19. 48 ore dopo la nucleofezione, iniziare a selezionare le cellule integrando il terreno mTeSR1 con 1 μg/mL di puromicina.
20. 72 ore dopo la nucleofezione, integrare il terreno mTeSR1 con 0,5 μg/mL di puromicina. Se la confluenza cellulare è inferiore al 30%, integrare anche il mezzo con un inibitore ROCK da 10 μM.
21. 4-6 giorni dopo la nucleofezione, far passare le cellule resistenti alla puromicina in piastre 10-15 x 96 pozzetti alla concentrazione di 0,8 cellule/pozzetto.
    NOTA: È essenziale integrare il terreno con 10 μM di inibitore ROCK e 0,5 μg/mL di puromicina.
22. Mantenere quelle cellule a 37 ° C / 10% CO₂ per 10-12 giorni per formare colonie derivate da singole cellule. Rabbboccare il mezzo una volta 7 giorni dopo la semina.
    NOTA: L'aumento del livello di CO₂ aiuta le singole hPSC a formare colonie dalla nostra esperienza.
23. Contrassegnare i pozzetti contenenti una singola colonia e sostituire il terreno con terreno mTeSR1 fresco contenente 0,5 μg/mL di puromicina ma nessun inibitore di ROCK.
    NOTA: Da questo momento in poi, le cellule saranno cresciute sotto 37 ° C / 5% CO₂.
24. Due giorni dopo, cambiare il mezzo per i pozzi contenenti colonie indifferenziate. Integrare il terreno con 10 μM di inibitore ROCK e 0,5 μg/mL di puromicina.
    NOTA: In alcuni pozzetti, le cellule potrebbero essersi differenziate e devono essere scartate.
25. Utilizzare le punte delle pipette P2 per raschiare delicatamente via le colonie. Trasferire la sospensione cellulare derivata da una colonia in 2 nuovi pozzetti su piastre separate a 96 pozzetti e utilizzarne uno per la genotipizzazione e uno per il mantenimento.
    NOTA: È importante mantenere attentamente le colonie e mantenere al minimo il livello di differenziazione spontanea.
26. Prendi la piastra contenente le cellule per la genotipizzazione una volta che la confluenza nella maggior parte dei pozzetti ha raggiunto il 50% o superiore. Scaricare il mezzo esaurito e quindi lavare le celle una volta con DPBS.
27. Lisare le cellule nel pozzo utilizzando il tampone di lisi di Bradley e isolare il DNA genomico da ciascun pozzetto nella piastra seguendo il protocollo associato (https://mcmanuslab.ucsf.edu/protocol/dna-isolation-es-cells-96-well-plate).
28. Utilizzare un metodo PCR a giunzione a tre primer per genotipizzare indipendentemente i bracci di omologia sinistro e destro¹⁰.
    NOTA: uno schema che mostra il metodo PCR è presentato nella Figura 2.
29. Inviare i prodotti PCR di giunzione per entrambi i bracci di omologia da 4-5 colonie per il sequenziamento Sanger e ottenere le sequenze.
    NOTA: Il risultato del sequenziamento di 2 colonie stabilite è mostrato nella Figura 3A.
30. Mantieni le colonie con il genotipo corretto e scarta il resto.
31. Espandi le colonie corrette sotto selezione continua della puromicina e congelale al più presto possibile.

4. Rimozione del trasposone da cellule staminali pluripotenti umane mirate

1. Mantenere una colonia con genotipo corretto sotto 0,5 μg/mL di selezione puromicina.
2. Nucleofect 8 x 10 da 5 a 1 x 10⁶ cellule con⁵ μg di trasposasi iperattiva (pCMV-hyPBase) come descritto sopra (Sezione 3, fasi 3.4-3.18). Eseguire una nucleofezione di controllo GFP in parallelo.
   NOTA: La puromicina deve essere rimossa dal mezzo mTeSR1 immediatamente dopo la nucleotipizzazione di queste cellule.
3. Crescere e vagliare le cellule con la cassetta di selezione puro-deltaTK rimossa seguendo le procedure pubblicate¹⁰.
   NOTA: è importante seguire attentamente le procedure originali. FIAU, o 1-(2-deossi-2-fluoro-β-d-arabinofuranosil)-5-iodouracil), è stato usato come analogo della timidina per la selezione negativa basata sulla timidina chinasi derivata dal virus dell'herpes simplex (HSV-tk).
4. Sequenziare la regione modificata per confermare la rimozione del trasposone.
   NOTA: Il risultato del sequenziamento di 3 colonie stabilite è mostrato nella Figura 3B.
5. Mantieni le colonie con il genotipo corretto ed espandi per un ulteriore utilizzo.
6. Eseguire la caratterizzazione dei marcatori di pluripotenza nelle colonie scelte prima di utilizzarli per ulteriori analisi.
   NOTA: La caratterizzazione di due colonie stabilite è mostrata nella Figura 4.

Results

Targeting della strategia knock-in basata su vettori
Il gene del fattore nucleare 4 alfa (HNF4α) degli epatociti è stato scelto per l'editing mirato del genoma per introdurre due mutazioni puntiformi nell'esone 8. Una coppia di Cas9n-sgRNA con offset di 11 bp è stata progettata vicino al sito per essere modificata. Il vettore di targeting basato su piggyBac ha funzionato come modello di riparazione diretto dall'omologia per introdurre le mutazioni puntiformi desiderate. Un 967 bp 5'-HA e un 1142 bp 3'-HA che incorporano sostituzioni nucleotidiche sinonimi o le mutazioni puntiformi desiderate sono state amplificate e clonate nel vettore bersaglio finale. Il sito di inserzione di piggyBac era distante 16 bp e 22 bp dalle due mutazioni puntiformi desiderate. Le colonie contenenti la cassetta di selezione puro-deltaTK sono state selezionate con puromicina nel primo turno. Una volta che la cassetta di selezione è stata rimossa mediante escissione della trasposasi nel secondo round, il sito bersaglio è stato modificato senza soluzione di continuità con solo le mutazioni puntiformi desiderate incorporate nel gene (Figura 1).

Editing genetico in cellule staminali pluripotenti umane
Per lo screening delle cellule correttamente mirate, è stato utilizzato un metodo PCR basato su tre primer per la genotipizzazione (Figura 2). Il sequenziamento con metodo Sanger è stato eseguito per confermare i risultati della PCR (Figura 3A). Dopo la rimozione della cassetta di selezione, la regione modificata è stata nuovamente sequenziata per confermare la corretta introduzione delle mutazioni puntiformi desiderate (Figura 3B).

Costituzione di colonie e caratterizzazione di cellule staminali pluripotenti umane modificate
Le colonie con il genotipo corretto sono state selezionate ed espanse secondo necessità. Le colonie stabilite devono essere caratterizzate prima di essere utilizzate per ulteriori analisi. Le cellule modificate possiedono la stessa morfologia delle cellule parentali (Figura 4A). Esprimono anche marcatori rappresentativi delle cellule staminali pluripotenti umane, inclusi i fattori di trascrizione NANOG e OCT4 (Figura 4 B), nonché i marcatori di superficie cellulare SSEA4 e TRA-1-60 (Figura 4C).

Figura 1: Targeting della strategia knock-in basata su vettori¹¹. Una coppia di plasmidi di espressione Cas9n-sgRNA sono stati utilizzati per indurre la rottura del doppio filamento del DNA nell'esone 8 del gene HNF4α. Un vettore di targeting con una cassetta di selezione è stato utilizzato per introdurre mutazioni puntiformi predeterminate situate a 16 bp e 22 bp di distanza. Questa cassetta di selezione era contenuta all'interno del trasposone piggyBac , costituito da un marcatore di selezione positivo-negativo (puro-deltaTK) guidato da un promotore costitutivamente attivo (PGK). Attraverso un percorso di riparazione diretto dall'omologia, le cellule bersaglio hanno incorporato la cassetta di selezione. L'escissione del trasposone mediata dalla trasposasi determina una modifica senza soluzione di continuità con solo le mutazioni puntiformi presenti. La croce rossa indica la posizione delle mutazioni puntiformi desiderate. HA = braccio di omologia; PB = piggyBac; PM = mutazione puntiforme. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Tre metodi PCR basati su primer. Per lo screening delle cellule bersaglio del gene, è stata utilizzata la genotipizzazione basata sulla PCR. Tre primer, LA-F1, -R1 e -R2 sono stati utilizzati per amplificare la regione del braccio di omologia sinistra. Indipendentemente, RA-F1, -F2 e -R1 sono stati utilizzati per amplificare la regione del braccio di omologia destra. Sulla base del risultato dell'elettroforesi su gel, le cellule non bersaglio e le cellule eterozigoti e omozigoti sono state distinte l'una dall'altra. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Risultati del sequenziamento di cellule geneticamente modificate¹¹. I prodotti PCR di due cloni sono stati sequenziati e hanno confermato il corretto inserimento della cassetta di selezione nel locus target (A). Le ripetizioni terminali invertite (ITR) da 5' e 3' piggyBac sono state affiancate dalle ripetizioni dirette TTAA. Tre cloni sono stati sequenziati dopo l'escissione del trasposone (B). Una coppia di Cas9n-sgRNA con offset di 11 bp è stata utilizzata per introdurre la rottura del doppio filamento del DNA. Due mutazioni puntiformi predeterminate (da A a G e da A a C) sono state introdotte nel gene. Una mutazione sinonimo è stata introdotta per mutare il motivo adiacente al protospacer (PAM) e un'altra per creare il sito TTAA necessario per l'escissione di piggyBac . Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: Caratterizzazione di cellule staminali pluripotenti umane modificate. Morfologia di due linee cellulari modificate e delle cellule parentali (A), barra di scala = 100 μm. L'espressione dei marcatori di cellule staminali pluripotenti NANOG e OCT4 esaminati mediante immunocolorazione (B, barra di scala = 50 μm), oltre a SSEA4 e TRA-1-60 mediante citometria a flusso (C) in due linee cellulari modificate e nelle cellule parentali. Le IgG sono state utilizzate come controllo negativo. DAPI è stato utilizzato per colorare il nucleo. Le percentuali sono state calcolate come la media di tre esperimenti indipendenti. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Discussion

Il protocollo qui descritto può essere utilizzato per introdurre mutazioni puntiformi predeterminate in un locus endogeno nelle hPSC. La combinazione di un vettore di targeting basato su piggyBac e plasmidi di espressione CRISPR / Cas9n accoppiati si è dimostrata affidabile ed efficiente¹¹. Dopo l'editing genetico HNF4α, 12 dei 43 cloni analizzati sono stati correttamente mirati come determinato dallo screening PCR a giunzione. In particolare, l'efficienza di targeting biallelica era di circa il 21% (9/43) e l'efficienza di targeting monoallelica era di circa il 7% (3/43).

A seguito di esperimenti mirati, è fondamentale mantenere la selezione della puromicina per mantenere il locus mirato accessibile alla trasposasi piggyBac durante il primo ciclo di screening. Ciò ridurrà al minimo il silenziamento della cassetta di selezione puro-deltaTK guidata dal promotore PGK e ridurrà lo sfondo nel secondo turno di screening¹⁰. Un recente rapporto ha dimostrato che il promotore CAG è più resistente al silenziamento rispetto al promotore PGK nelle hPSCs¹⁴. La sostituzione del promotore per la cassetta di selezione potrebbe quindi migliorare questo sistema in futuro. È anche importante confrontare il numero di colonie resistenti da cellule trasfettate con hyPBasi e GFP. Dopo aver rimosso con successo il trasposone, ci dovrebbero essere più colonie sopravvissute dalla hyPBase- che cellule trasfettate con GFP. Oltre all'analisi PCR dell'escissione del trasposone, è necessario il sequenziamento diretto della regione modificata per confermare la fedeltà di escissione.

Sulla base^{della strategia 9,10} del vettore di targeting basata su trasposone piggyBac di Yusa^, le procedure sopra descritte si sono concentrate sul miglioramento della nucleofezione delle hPSC e sull'efficienza della clonazione di singole cellule. La densità di semina cellulare è stata ottimizzata per ridurre la probabilità di formazione di colonie eterogenee. Abbiamo anche impiegato 10-12 giorni di coltura sotto il 10% di CO₂ per migliorare la produzione di colonie per lo screening del genotipo. Nella nostra esperienza, circa 20 colonie potrebbero essere ottenute da ogni piastra a 96 pozzi. Sebbene questo passaggio possa richiedere più tempo rispetto ad altri metodi, è affidabile e altamente efficiente.

In base alla necessità, i vettori bersaglio possono essere progettati per introdurre o correggere mutazioni puntiformi, per creare linee cellulari reporter e per l'espressione genica knockout. In conclusione, la combinazione del sistema CRISPR/Cas9(n) e di un vettore bersaglio è un modo efficace per fornire diversi tipi di hPSC geneticamente modificate.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-umano SSEA4 PE	eBioscience	12-8843-42
Anti-umano TRA-1-60 PE	eBioscience	11-0159-42
DPBS	Thermo Fisher Scientific	14190144
DPBS con calcio e magnesio	Thermo Fisher Scientific	14040133
FIAU	Moravek	M251
Cella delicata reagente di dissociazione	Stem Cell Technologies	07174
H9 cellule staminali embrionali umane	WiCell	WA09
Anticorpo umano NANOG	R& D systems	AF1997
Anticorpo OCT4 umano	Abcam	AB19857
Cellula staminale umana Kit nucleofector 1	Lonza	VPH-5012
Controllo dell'isotipo IgG3 di topo PE	eBioscience	12-4742-41
mTeSR1 medium	Stem Cell Technologies	85850
Dispositivo Nucleofector 2b	Lonza	AAB-1001
pCMV-hyPBase	Wellcome Trust Sanger Institute	N/A
pMCS-AAT_PBPGKpuroTK	Wellcome Trust Sanger Institute	N/A
pSpCas9n(BB)-2A-Puro (PX462)	Addgene	PX462
Puromicina dicloridrato	Thermo Fisher Scientific	A11138-03
QIAprep spin maxiprep kit	Qiagen	12162
Kit di miniprep di rotazione QIAprep	Qiagen	27106
Laminina ricombinante 521	BioLamina	LN521
Soluzione blu di tripano, 0,4%	Thermo Fisher Scientific	15250061
Y-27632(Dicloridrato)	Millipore	SCM075